全 文 ：收稿日期:2007-07-06
作者简介:彭缨(1972-), 女(满族),山东兖州人 , 副教授 , 硕士 , 主要从事中药质量控制研究 , Tel.024-23986510 ,
E-mail yingpeng1999@yahoo.com.cn;王淑君(1960-),女(汉族), 辽宁抚顺人 ,副教授 ,博士 ,主要从事药物新剂型
与药物动力学研究 , Tel.024-23986360 , E-mail x iaohu6408 cn@sina.com。
文章编号:1006-2858(2008)05-0372-04
柱前衍生高效液相色谱法测定知母中
菝葜皂苷元的含量
彭　缨 , 骆　 , 王淑君 , 李玲芝 , 孙毓庆 , 潘卫三
(沈阳药科大学 药学院 ,辽宁 沈阳 110016)
摘要:目的 建立用苯甲酰氯与菝葜皂苷元进行柱前衍生化反应 ,以HPLC-UV法测定知母药材中
菝葜皂苷元的含量 。方法 采用 Agilent C18柱(150 mm×4.6 mm , 5μm), 流动相为甲醇-水(体积
比99∶1),检测波长为230 nm ,流速为1.1 m L·min-1 , 柱温为33 ℃。结果 菝葜皂苷元质量浓度在
0.20～ 4.00 g·L-1内与峰面积呈良好的线性关系(r =0.999 6), 平均回收率为 98.3%(n =9),
RSD 为 2.1%。结论 本法可用于菝葜皂苷元的定量分析。
关键词:知母;菝葜皂苷元;柱前衍生化;高效液相色谱法
中图分类号:R 917　　　文献标志码:A
　　中药知母为百合科植物知母(Anemarrhena
asphodeloides Bge.)的干燥根茎 ,具有清热泻火 、
滋阴清肺 、生津润燥的功能 ,菝葜皂苷元是其主要
活性成分。《中华人民共和国药典》2005 年版一
部收载了HPLC-ELSD法测定菝葜皂苷元含量的
方法[ 1] 。知母中主要含有甾体皂苷[ 2] ,由于其中
皂苷类成分大多无紫外吸收 ,所以对其皂苷类成
分的含量测定 ,目前报道有用HPLC-ELSD法测定
知母皂苷 BⅡ和用 RP-HPLC 示差折光法测定苷
元的含量[ 3-4] 。作者采用柱前衍生化技术 ,将菝
葜皂苷元上的羟基酯化后进行 RP-HPLC 分析 ,
可以用紫外检测器进行含量测定 ,方法简便 。该
方法可用于菝葜皂苷元的定量分析 ,同时也为进
一步完善对知母药材的质量评价提供依据。
1　仪器与材料
高效液相色谱仪:岛津LC-10AT 泵(日本岛
津公司)、SP 可变波长紫外 -可见检测器(美国
Spect ra-Physics 公司)、ANASTAR 色谱工作站
(天津科贝尔公司),AE系列电子分析天平(梅特
勒-托利仪器(上海)有限公司),岛津 SUNTEK
柱温箱(日本岛津公司),超声波清洗器(中船六院
七二六超声仪器厂)。
菝葜皂苷元对照品(自制 , NMR鉴定结构 ,
化学结构式见图 1),甲醇(色谱纯 ,天津康科德科
技有限公司),二次重蒸水 。
所用药材产地为河北 ,由沈阳药科大学孙启
石教授鉴定为百合科植物知母(Anemarrhena as-
phodeloides Bge.)。
Fig.1　Structure of sarsasapogenin
2　方法与结果
2.1　对照品溶液的制备
称取菝葜皂苷元对照品125 mg ,精密称定 ,置
25 mL量瓶中加甲醇超声溶解 ,摇匀 ,定容 ,即得
对照品储备溶液 。精密吸取对照品储备溶液
0.4 、2.0 、4.0 、6.0 、8.0 mL分别置10 mL量瓶中 ,
加甲醇定容 ,摇匀 ,配制成系列质量浓度的对照品
溶液 。
2.2　供试品溶液的制备
取知母药材细粉(过450μm筛)约1.0 g ,精密
称定 ,置具塞锥形瓶中 ,加入体积分数为 75%的
甲醇50 mL ,浸泡过夜 ,超声(250 W ,45 kHz)提取
第 25 卷 第 5 期
2 0 0 8 年 5 月
沈　阳　药　科　大　学　学　报
Journal of Shenyang Pharmaceutical University
Vol.25 　No.5　
May 2008 p.372　
DOI :10.14066/j.cnki.cn21-1349/r.2008.05.009
30 min。放冷 ,摇匀 ,滤纸过滤 ,滤液浓缩后转移
至10 mL量瓶中 ,用体积分数为 75%的甲醇定容
至刻度 ,摇匀 ,经0.45μm微孔滤膜过滤 ,取续滤
液即得。
2.3　衍生化反应
精密吸取稀释后的菝葜皂苷元对照品溶液
100μL ,依次加入苯甲酰氯600μL 、吡啶1 300μL ,
密闭于涡旋混合器上震荡混匀1min ,甲醇定容至
2mL ,经0.45μm过滤后 ,进行 HPLC分析测定。
2.4　色谱系统适用性试验
色谱 条 件:色 谱 柱 为 Agilent C18 柱
(150 mm ×4.6mm , 5μm), 流动相为甲醇 -水
(体积比 99∶1), 检测波长为 230 nm , 流速为
1.1 mL·min-1 ,柱温为33 ℃,进样量为20μL。
在上述色谱条件下 ,空白 、对照品及样品色谱
图见图 2。
1—Sarsasapogenin
Fig.2　Chromatograms of blank sample(A), reference substance(B)and Rhizoma Anemarrhenae sample(C)
　　按上述色谱条件进样分析 ,衍生化后菝葜皂
苷元的理论塔板数为 3.2 ×103 , 对称因子为
1.05 ,与其他色谱峰之间分离度均大于 1.5。
2.5　方法的线性关系考察
分别精密吸取系列的菝葜皂苷元对照品溶液
100μL ,依次加入苯甲酰氯600μL 、吡啶1 300μL ,
密闭于涡旋混合器上震荡混匀1min ,甲醇定容至
2mL ,经 0.45μm微孔滤膜过滤 。取续滤液按
“2.4”条色谱条件测定 ,以对照品的质量浓度(ρ,
g·L -1)对峰面积(A , mAU)进行线性回归 ,菝葜
皂苷元的回归方程为:A =7×106ρ+1.348 8×
105 , r =0.999 6。结果表明菝葜皂苷元质量浓度
在 0.20 ～ 4.00 g·L-1内线性关系良好。
2.6　精密度试验
取衍生化后100 mg·L-1对照品溶液 ,重复进
样 5 次 ,以衍生化后菝葜皂苷元的峰面积计算 ,
RSD 为 2.8%, 仪器精密度良好 。定量限为
1mg·L-1 。
2.7　重复性试验
按“2.2”条方法平行制备 5 份知母供试品溶
液 ,按“2.3”条方法衍生化处理 ,按“2.4”条色谱条
件进样分析 ,测得样品的含量质量分数平均值为
1.052%, RSD为 3.8%。
2.8　稳定性试验
同一供试品溶液室温放置 ,按“2.3”条方法进
行衍生化处理 ,分别于 0 、0.5 、1 、1.5 、2 h ,按“2.4”
条色谱条件分别进样20μL 。衍生化后的菝葜皂
苷元在1 h内稳定 ,室温放置超过1 h ,含量下降 ,
干扰物质增多 。因此样品衍生化后应立即进样分
析。
2.9　回收率试验
取已知含量的知母药材样品 9 份 , 各约
1.0 g ,精密称定。分别按含量质量分数的 80%、
100%和 120%加入适量的对照品溶液 ,按“ 2.2”
条方法制备供试品溶液 ,按“2.3”条方法将提取液
进行衍生化处理 ,按“2.4”条色谱条件进行测定 ,
计算菝葜皂苷元的回收率 ,结果见表 1。
2.10　样品含量测定
药材中菝葜皂苷元的含量 。准确分别量取
6份供试品溶液 ,按“2.2”条方法制备菝葜皂苷元
溶液 。依次加入苯甲酰氯600μL 、吡啶1 300μL ,
密闭于涡旋混合器上震荡混匀1 min ,将提取液进
行衍生化处理后 ,进行 HPLC 分析。根据外标两
点法计算菝葜皂苷元的含量。知母药材中菝葜皂
苷元的含量质量分数分别为 1.247%、1.252%、
1.301%、1.287%、1.233%、1.274%, 平均值为
1.266%(n=6), RSD为 2.6%。
373第 5 期 彭　缨等:柱前衍生高效液相色谱法测定知母中菝葜皂苷元的含量　　　
Table 1　Results of recovery of sarsasapogenin(n=3)
m(mangiferin)/mg m added/ mg m found/ mg Recovery/ % Average recovery/ % RSD/ %
10.52 8.40 8.451 100.2
10.52 8.40 8.052 95.8 96.8 3.0
10.52 8.40 7.943 94.5
10.52 10.51 10.07 95.9
10.52 10.51 10.01 95.3 97.0 2.4
10.52 10.51 10.48 99.8
10.52 12.62 12.61 100.1
10.52 12.62 12.99 103.1 102.1 1.8
10.52 12.62 12.57 99.8
3　讨论
3.1　衍生化反应条件的筛选
3.1.1　吡啶的用量对衍生化反应的影响
苯甲酰氯的衍生化反应通常在吡啶的碱性条
件下进行 ,其反应机理是在碱性条件下苯甲酰氯
对菝葜皂苷元上的羟基进行酯化 ,从而引入有紫
外吸收的苯甲酰基 ,进行紫外检测 。
作者分别考察了吡啶与苯甲酰氯物质的量比
(mol)依次为 1∶1 、2∶1 、3∶1 、5∶1 、10∶1对衍生化反
应的影响。结果表明 ,当吡啶与苯甲酰氯物质的
量比(mol)为 3∶1时 ,衍生化反应完全。继续增大
吡啶的用量 ,过剩的吡啶在上述色谱条件下不会
干扰衍生化产物的分离 ,但是对环境造成污染 ,因
此吡啶的加入量定为吡啶与苯甲酰氯物质的量比
(mol)为 3∶1 。
3.1.2　衍生化试剂用量对反应的影响
作者分别考察了菝葜皂苷元与苯甲酰氯物质
的量比(mol)依次为 1∶1 、1∶2 、1∶5 、1∶10 、1∶100对
衍生化反应的影响 。结果表明 ,当菝葜皂苷元与
苯甲酰氯物质的量比(mol)为 1∶5时 ,衍生化反应
完全。继续增大苯甲酰氯的用量 ,虽然过剩的苯
甲酰氯在上述色谱条件下不干扰衍生化产物的分
离 ,但对衍生化反应已无影响 ,所以衍生化时确定
菝葜皂苷元与苯甲酰氯物质的量比(mol)为 1∶5 。
3.1.3　衍生化反应时间的影响
作者考察了衍生化反应时间分别为 0.5 、1 、
5 、20 、60min对衍生化完全程度的影响。结果表
明 ,菝葜皂苷元加入苯甲酰氯后 ,吡啶加入后的
0.5 min即反应完全 ,结合实际操作的便利性 ,确
定衍生化时间为1 min。
3.2　提取方法的选择
分别考察了索氏提取法 、水煎法和超声法提
取知母中的菝葜皂苷元 ,经过对比 ,该三种方法提
取的菝葜皂苷元含量几乎没有差别 ,考虑到超声
提取法比较易于操作 ,故将提取方法定为超声提
取法 。同时考察了超声法中以水 , 体积分数为
30%、50%、75%、100%甲醇 , 体积分数为 30%、
50%、75%、100%乙醇为提取溶剂以及提取 20 、
30 、40 min对提取效率的影响。确定以体积分数
为75%的甲醇为提取溶剂 ,超声提取30 min ,为最
佳提取条件。
3.3　流动相的选择
菝葜皂苷元本身极性就很小 ,衍生化后更难
于洗脱 ,比较了甲醇-水和乙腈-水的不同比例 ,
流动相几乎需要全部为有机溶剂才能将其洗脱下
来 ,乙腈与甲醇的分离效果相似 ,考虑到经济性 ,
选择甲醇-水(体积比 99∶1)作为流动相。
参考文献:
[ 1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典:一部[ M] .北
京:化学工业出版社 , 2005:148.
[ 2] 季德 , 陆兔林 ,宋 .知母研究进展[ J] .中华实用中西
医杂志 , 2005 , 18(13):260-262.
[ 3] 于健东 , 马玲云 , 马双成 , 等.知母中知母皂苷 BⅡ的
TLC 鉴别及 HPLC 法含量测定[ J] .药物分析杂志 ,
2005 , 25(12):1436-1437.
[ 4] 刘美凤 , 丁怡 ,邢东明 ,等.RP-HPLC示差折光检测法
测定复方知母胶囊中菝葜皂苷元的含量[ J] .中国药
学杂志 , 2004 , 39(2):141-142.
374 　　　沈　阳　药　科　大　学　学　报 第 25卷
Determination of sarsasapogenin in Rhizoma Ane-
marrhenae with precolumn derivatization by HPLC
PENG Ying , LUO Fang , WANG Shu-jun , LI Ling-zhi , SUN Yu-qing , PAN Wei-san
(School of Pharmacy , Shenyang Pharmaceut ical Universi ty , Shenyang　110016 , China)
Abstract:Objective To establish an HPLC-UV method for determination of sarsasapogenin in Rhizoma
Anemarrhenae wi th benzoyl chloride derivate.Methods Chromatography was carried out on Agilent C18 col-
umn(150 mm×4.6 mm , 5μm),using methanol-water(V∶V=99∶1)as the mobile phase at a flow rate of
1.1 mL·min-1 and the detection w aveleng th w as set at 230 nm.The column temperature was 33 ℃.Re-
sults The linear range of sarsasapogenin w as 0.20-4.00 g·L-1(r =0.999 6).The average recoveries of
sarsasapogenin w as 98.3%(n =9).Conclusions This method can be used for determination of sarsasa-
pogenin in Rhizoma Anemarrhenae.
Key words:Rhizoma Anemarrhenae;sarsasapogenin;precolumn derivatization;HPLC
375第 5 期 彭　缨等:柱前衍生高效液相色谱法测定知母中菝葜皂苷元的含量