全 文 ：遗传 HEREDITAS(Beijing)20 (增刊):56 ～ 59 1998
染色体组原位杂交对小麦-易变山羊草
附加系外源染色体来源的研究①
余懋群1　马欣荣1　M.Cerbah3　邓光兵1　彭德良2
O.Panaud3　J.Jahier4　F.Person-Dedryver4　S.Yakovlev3
(1.中国科学院成都生物研究所 , 610041成都)
(2.中国农业科学院植物保护研究所 , 100094北京)
(3.Universi te Paris-Sud , Laboratoire d′Evolu tion et Systematique , 91405 , ORSAY , France)
(4.INRA , S tation d Amelioration des Plantes , 35650 , Le Rheu , France)
摘　要　利用染色体组荧光原位杂交技术研究了抗禾谷类根线虫 H.avenae 、 M.naasi “ 小麦-易变山羊
草” 附加系附加染色体来源 。易变山羊草的 U 、 Sv染色体组供体 Aegilops umbellulata和 Ae.longissima 的
染色体组总 DNA 分别用 Dig-11-dUTP标记作探针与附加系染色体作原位杂交 , 其结果显示附加染色体与
Ae.longissima 染色体有极高同源性 , 很有可能属 Sv染色体组的 3Sv染色体 。此外原位杂交结果还表明 ,
Ae.longissima 染色体与小麦部分染色体同源程度也很高 , 这些染色体可能是小麦 B组染色体 , 推测
Sitopsis组山羊草可能是小麦 B组的供体 。在小麦染色体间存在较丰富的罗伯逊易位 , B组与 A 、 D 组染
色体亦存在一定程度的同源性 。
关键词　小麦/山羊草附加系 , 染色体鉴定 , 原位杂交 , 禾谷类根线虫
中图分类号　Q37 , S512
Genomic in situ Hybridization Approach for Studying the Origin
of the Alien Chromosome in Wheat-Ae.variabilis Lines
YU M aoqun1　MA Xinrong1　M .Cerbah3　DENG Guangbing1
PENG Deliang2　O.Panaud3　J.Jahier4　F.Person-Dedryver4　S.Yakovlev3
(1.Chengdu Institute of Biology , Chinese Academy of Sciences , Chengdu 610041)
(2.Institute of Plant Protection, Chinees Academy of Agricultural Sciences , Beijing 10094)
(3.Universi te Paris-Sud, Laboratoire d′Evolut ion et Systematique 91405 , ORSAY , France)
(4.INRA , S tation d Amelioration des Plan tes 35650 , Le Rheu , France)
禾谷类根线虫孢囊线虫 Heterodera avenae 、根结线虫 Meloidogyne naasi 是危害禾本科作物和牧草根系的主要
土传线虫 , 部分受害地区的作物产量损失可达 70%以上〔1〕 。易变山羊草 (Aegilops variabilis , 2 n=28 , USv)对
H.avenae和M.naasi 具很高抗性 , 抗 M.naasi 根结形成由一对显性基因Rkn-mn1控制〔2〕 。我们通过普通小麦
“中国春” 与 Ae.variabilis杂交 , 再用普通小麦品种 “Lutin” 连续回交 , 已将具有显性抗性基因 Rkn-mn1的易
① 国家自然科学基金(39370441)、 中国科学院和中国科学院成都地奥科学基金 (DASF)资助项目。
DOI :10.16288/j.yczz.1998.s1.018
变山羊草染色体导入 “Lutin” 中 , 形成遗传稳定的抗禾谷类根线虫 “小麦-易变山羊草” 二体附加系 (X-35 , 2 n
=44 , 22Ⅱ)〔3〕 。同工酶分析显示附加外源染色体属于第三部分同源群 , 附加染色体或为 3U或为 3Sv〔4〕。
易变山羊草系统发育研究表明其染色体组 U 来自 Ae.umbellulata , S组很可能来自山羊草 S itopsis组的 Ae.
longissima
〔5 , 6〕 。由于 U 、 Sv组染色体形态和 C-带带型与小麦一些染色体相似 , 难以利用染色体形态和 C-带鉴定
技术确认外源附加染色体 。
染色体原位杂交技术自 1969年开始用于动物和人类的 DNA特异片段及基因定位研究以来〔7〕 , 该技术发展很
快 , 特别是近十余年来非放射性探针染色体原位杂交技术已广泛用于基因和特异 DNA 序列定位 、染色体片段鉴
定 、远缘杂种分析以及物种系统发育等方面的研究〔8 ～ 12〕 。
本研究利用荧光标记的染色体组总 DNA为探针 , 通过原位杂交技术鉴定抗禾谷类根线虫的 “小麦-易变山羊
草” 附加系中的附加染色体来源 , 为抗性基因的转移和利用提供遗传信息 。现将结果报道如下 。
1材　料　和　方　法
1.1 材料
本试验用 “小麦-易变山羊草” 附加系 “X-35” 和亲本小麦品种 “Lutin” 均为套袋自交材料 。 Ae.longissima 、
Ae.umbellulata由法国农科院雷恩作物改良所提供;Ae.squarrosa 、 T .arartu 由法国巴黎十一大学植物形态实
验室 Dr.Jacque惠赠 。
1.2 方法
1.2.1 染色体准备　　种子经表面灭菌后培养皿滤纸上 23 ～ 25℃培养箱中发芽 。当根长达 1.0 ～ 1.5cm时取根尖
于饱和α-溴萘+冰水中 0 ～ 4℃预处理 24h , 根尖用无水乙醇 、冰醋酸 (3∶1)固定 。材料固定 1夜后即可用于制
片 。
根尖经 0.5%醋酸洋红 37℃解离 1 ～ 2h后在 1滴 45%醋酸中剖离分生组织细胞 , 压片后用干冰或液氮脱片 ,
风干 1h后用 45%醋酸处理 10min或用无水乙醇处理 1h , 风干后备用 。花粉母细胞减数分裂制片与根尖细胞相
似 。取处于减数分裂中期 I (MI)的花药于 1滴 1%醋酸洋红 (无铁离子)中解剖出花粉母细胞 , 微热后压片 。
脱片与处理同有丝分裂细胞制片 。
染色体原位杂交前制片用 100μl RNase (100ng/μl)37℃处理 1h , 2×SSC清洗 3次 , 每次 5min , 沥干后在
70%甲酰胺 70℃下处理 3min , 再经 70%、 90%、 100%乙醇室温下各处理 5min , 风干备用 。
1.2.2 DNA提取及标记　　用于标记和阻断的 DNA 均来自幼嫩叶片 , 采用改良 CTAB法提取总DNA 。初提 DNA
分别用 RNase和 Protenase K 在 37℃下处理 1h , 再用氯仿-异戊醇抽提 2次 , 精提 DNA溶于 1×TE在 -20℃下保
存备用 。
待标记的 Ae.umbellulata和 Ae.longissima DNA用注射针头剪切法切断 DNA , 使其长度在 5 ～ 15kb左右 。
DNA标记用 Digoxigenin-11-dUTP (Boehringer Mannheim), 采用缺口平移法标记 。
1.2.3染色体原位杂交和检测　　原位杂交参照 Heslop-Harrison等〔13〕的方法 。每载片含 50%甲酰胺 、 10%Dex-
tran sulfate 、 0.1%SDS 、 2×SSC 、 1.5μg鲑精 DNA , 如用 Ae.longissima标记 DNA 为探针 , 阻断 DNA 则为 T .
urartu和 Ae.squarosa DNA , 标记 DNA 与阻断 DNA量为 1∶2 , 如用 Ae.umbellulata 标记 DNA 为探针 , 阻断
DNA则为普通小麦 DNA , 探针与阻断 DNA 的比例为 1∶20 。杂交混合液充分混匀后 , 85℃变性 10min , 冰中淬火
10min。每载片加 50μl杂交混合液后盖上塑料盖片 , 放入杂交盒中 85℃变性 10min , 转入 55℃复性 5min后移入
37℃杂交箱过夜 。杂交后的载片经一系列处理:2×SSC室温 1×5min , 2×SSC 42℃3×5min , 20%甲酰胺 2×
5min , 0.1×SSC 42℃1×5min , 4×SSCT 42℃1×5min , 4×SSCT 1×5min (室温)。杂交信号可用免疫荧光法放
大 , 以便易于检测 。每载片加用 4×SSCT 配制的 5%牛血清 100μl室温下处理 10min , 沥干后再加 50μl Anti-
57增刊 余懋群等:染色体组原位杂交对小麦-易变山羊草附加系外源染色体来源的研究
Digoxigenim-Fluoresceim液 (10μg/ml , 用 5%牛血清配制)37℃下处理 1h , 然后在 4×SSCT , 37℃下清洗 3 ×
8min。载片沥干后加 100μl 5%兔血清 (用 4×SSCT 配制)室温处理 10min , 沥干后加 50μl用 5%兔血清配制的
FITC-Anti-Sheep 37℃处理 1h , 4×SSCT 37℃洗脱 3×8min。载片分别用 2%DAPI 和 2μg/ml PI 背景染色 10 ～
15min。最后加入 30μl抗荧光衰老剂 (Antiflo r AF 1)封片 。
用 Axiophot Zeiss荧光显微镜 , Plan-Neo Fluar物镜 , 09滤光镜观察杂交信号 。使用 Fujichrome ASA 400胶卷
照像。
2结　　果
2.1 Ae.umbel lulataDNA为探针
抗禾谷类根线虫 H.avenae 、 M.naasi 附加系 X-35 呈单体附加时 (2 n=43), 绝大部分花粉母细胞 PMC
(>90%)在减数分裂中期 I (MI)都能形成 21个二价体 、 1个单价体 (21 Ⅱ+1Ⅰ), 少数 PMC形成 20Ⅱ+1Ⅲ ,
19Ⅱ+1 Ⅳ+1Ⅰ和 20Ⅱ+3Ⅰ 。在染色体构型为 21 Ⅱ+1Ⅰ的 PMC中 , 为单价体状态的外源染色体和其它染色体
一样总是被 P Ⅰ染成桔红色 。在绝大部分根尖细胞中染色体全染成桔红色 , 载片边缘少数细胞出现部分染色体被
染成桔黄色或绿色 , 但不能区分附加染色体 。
2.2 Ae.longissimaDNA为探针
在观察的绝大部分 PMC中 , 单价外源染色体被 Ae.longissima DNA 所杂交 , 呈现为黄绿色 , 另有一些二价
染色体亦被杂交 , 呈黄绿色 。在根尖有丝分裂细胞中可见 10多条完全被 Ae.longissima DNA 杂交的染色体 , 另
有一些染色体仅一染色体臂被 Ae .longissima DNA 杂交 , 呈黄绿色 。另有一些染色体被 P Ⅰ染成浅桔红色 。还有
一些染色体完全未被 Ae.longissima DNA杂交 , 呈现桔红色 。
3讨　　论
在蓝色光的激发下 FITC发出绿光 , P Ⅰ则发出桔红光 。在 P Ⅰ对染色体背景染色下 , 被 FITC染色的染色体
则表现为黄色或黄绿色 。通过对抗禾谷类根线虫单体附加系减数分裂中期 Ⅰ染色体组原位杂交 , 可以看到以 Ae.
longissima DNA为探针 , T .urartu 、 Ae.squarosa DNA为阻断子对 PMC在 MI染色体进行原位杂交 , 单价附加
染色体原位杂交显示为黄绿色;而以 Ae.umbellulata DNA为探针 , 附加系亲本小麦 “Lutin” DNA为阻断子的染
色体原位杂交 , 附加单价染色体未能被 Ae.umbellulatta DNA 杂交 , 由此可见 “小麦-易变山羊草” 附加系 “X-
35” 具抗禾谷类根线虫 H.avenae 和M.naasi基因的外源附加易变山羊草染色体极有可能为 Sv组染色体 。我们
曾对附加系酯酶 Est-5分析 , 结果表明附加系外源染色体属于第三部分同源群〔4〕 。因此该附加染色体极有可能为
易变山羊草 3Sv 。在染色体进化中 , 亲缘关系越近的物种 , 其染色体结构和功能相似程度越高 。那么与 Ae.
longissima同属山羊草S itopsis组的 Ae.sharonensis 、 Ae.speltoides 、 Ae.bicornis 、 Ae.searsii 不同类型材料中亦
很有可能存在抗禾谷类根线虫基因 。
以 Ae.longissima DNA 为探针 , T .urartu 、 Ae.squarosa DNA 为阻断子对附加系根尖有丝分裂细胞染色体
原位杂交结果表现近三分之一染色体被标记 , 部分染色体出现 1臂被标记 , 还有部分染色体染色介于桔黄色和桔
红色间 。这 3类染色体中 , 第一类显示其染色体 DNA 序列与标记 DNA 同源程度极高 。现已比较清楚 , 山羊草
S itopsis组的 S染色体组与小麦 B组染色体同源程度较高 , 因此一些人认为 , Sitopsis组内一山羊草可能就是小麦
B组供体 。从本研究来看 , 试验结果支持这一观点 。第二类染色体为罗伯逊易位染色体 , 可能为 A 、 D组染色体
与 B组染色体相互易位的结果 , 在文献中已有不少报道 。第三类染色体结果表明 , 可能小麦染色体部分 DNA 序
列与 Ae.longissima S l组染色体存在较高的同源程度 , 在染色体上表现为非连续性杂交区域 , 在染色体 DNA 链上
总的杂交程度不高 , 因而出现这种杂交信号较弱的中间型染色体 。
58 遗　　传 HEREDITAS(Beijing)1998 20卷
在试验中还可发现 , 在盖片近边沿部分常出现一些伪信号 , 这可能是杂交混合液分布不均造成的结果 。此外
原位杂交信号受影响的外界因素中 , 除探针剂量 、杂交温度 、时间外 , 还与 DNA 洗脱强度有极大关系 , 影响洗
脱强度的因素除甲酰胺 、 SSC浓度 、温度 、洗脱时间外 , 洗脱振荡频率亦影响杂交质量 。振荡频率太低 , 载片各
区域染色体上低同源性 DNA不易洗脱 , 出现一些伪信号和背景杂音干扰 , 严重影响杂交结果分析和图像质量 。
不同材料 、不同探针应摸索出各自最佳处理参数 , 才能获得满意杂交结果 。
参　考　文　献
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＊　＊　＊　＊　＊　＊　＊　＊　＊　＊　＊　＊　＊　＊　＊　＊　＊　＊　＊　＊　＊　＊　＊　＊　＊　＊　
　(上接第 55页)
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