全 文 ：江苏农业学报(Jiang su J. of Agr. S ci. ), 2006, 22(4):374～ 378
NEM对川百合花粉萌发和花粉管伸长的抑制效应
张学琴 1 , 　陈玉玲 2 , 　袁　明1 , 　王学臣 1
(1.植物生理学和生物化学国家重点实验室 , 中国农业大学生物学院 ,北京 100094;2. 河北师范大学生命科学院 ,河北 石家
庄 050016)
收稿日期:2006-07-20
基金项目:中国农业大学科研启动基金项目(2005026)
作者简介:张学琴(1966-),女,江苏丹阳人 , 博士 ,副教授 ,从事高等
植物雄配子体的发育及分子机制研究。
通讯作者:王学臣 , (Tel)010-62732706
　　摘要:　为探明微丝骨架结构以及微丝骨架对花粉萌发和花粉管伸长的作用 , 采用不同浓度的巯基类化学反
应试剂 NEM处理川百合花粉。结果表明:30μm ol /L NEM能有效抑制川百合花粉萌发和花粉管伸长 , 抑制率分别
达到 95%和 99%;经 20μmo l /L NEM处理过的川百合花粉 , 在去掉 NEM后 , 其萌发率恢复到对照(0μmo l /L NEM)
的 98%, 花粉管长度恢复到对照(0 μm o l /L NEM)的 60%;15 μm o l /L、20 μm o l /L和 30μmo l /L NEM处理过的川百
合花粉 , 其花粉管内微丝排列呈弯曲状;而非沿纵轴向顶端延伸的正常微丝束状态。可见 , NEM作为一种微丝骨架
的抑制剂改变了花粉管中微丝骨架的分布结构 ,影响了花粉管的生长。
关键词:　NEM;花粉萌发;花粉管伸长;微丝骨架;抑制效应
中图分类号:　Q944. 42　　　文献标识码:　A　　　文章编号:　1000-4440(2006)04-0374-05
Inhibition of N-ethyml alemi ide (NEM) to Pollen Germ ination and Tube
Grow th of L ily
ZHANG Xue-qin1 , 　CHEN Yu-ling2 , 　YUAN M ing1 , 　WANG Xue-chen1
(1. S tateKey Labora tory o fP lant Physio logy and B iochem istry, Co llege ofB iologica lS cien ces, Ch inese Ag ricu ltura lUn iversity, B eijing 100094, Ch ina;
2. College of Life Science, HebeiNorm a lU niversity, Sh ijiazhuang 050016, Ch ina)
　　Abstract:　Actin filament is the cy to ske le ton in the po llen tha t contro ls po llen germ ination and tube grow th. N-e thy l-
m aleim ide(NEM) is a sulfhydry la a lky la ting agent tha t can change the interaction be tw een m yosin in the cy toskele ton. To
investiga te the e ffec t o f NEM on actin filam en t and further on pollen ge rm ina tion and tube g row th, the po llen of lily w as
treated w ith NEM a t differen t concentra tions. W ith the c lim bing of NEM concen tra tion, actin filam en ts in the lily po llen be-
come m ore curved, wh ich changed the po llen from cy linder shape to zigzag curve. The inhibitions o fNEM at 30μmo l /L to
po llen germ ina tion and tube g row th we re 95% and 99%, re spec tively, indicating the effe ctive inhibition of NEM. A fte r the
po llen pre-treated w ith NEM w ere put into the liqu id favo ring po llen germ ination for 80 m in, germ ination rate and tube
g row th w ere b rought back to 98% and 60% of CK(0μmo l /L NEM treatment), respective ly, sugge sting that the inh ib ition
o f NEM to po llen ge rm ina tion and tube g row th is reversib le.
K ey words:　NEM;po llen germ ination; tube g row th; ac tin filam en t; inhibition
　　花粉萌发和花粉管伸长是植物生殖学领域中一
个重要方面 ,控制花粉萌发和花粉管伸长的细胞骨
架主要是微丝骨架[ 1] 。花粉管伸长所需要的物质
就是通过细胞骨架的作用运输到花粉管顶端 。因此
研究微丝骨架的结构具有重要意义。
化学试剂修饰是研究蛋白质结构和功能的一种
行之有效的方法 ,即蛋白中的功能基团如胱氨酸残
基被化学试剂修饰后 ,蛋白质的结构或功能会发生
相应改变 [ 2] ,从而可了解所研究的蛋白质结构与功
374
能的关系 。 NEM (N-e thy lm aleim ide)是一种巯基类
化学反应试剂 ,在体外使用 NEM ,单体肌动蛋白不
能成束 [ 3] 。而用低浓度的 NEM处理嗜铬(Chromaf-
fin)细胞时 ,细胞骨架中的总 F-肌动蛋白含量可降
低 40% ～ 50%[ 4] 。
近年来探讨细胞骨架蛋白间相互作用 ,也多采
用巯基反应试剂 NEM。据文献报道 ,在动物细胞
中 , NEM 是微丝结合蛋白———肌球蛋白 [ 5] 、血影蛋
白 [ 6]活性的一种抑制剂。但在植物细胞中还没有
报道 NEM是否影响由肌动蛋白形成的微丝束的排
列 。本研究以川百合花粉和花粉管为材料 ,试图探
明 NEM对川百合花粉的萌发和花粉管伸长的影响
以及对花粉管中微丝成束的抑制作用 。
1　材料与方法
川百合(Lilium david ii Duch. )花粉采自兰州郊
区 ,新鲜花粉晾干后于 - 80 ℃保存。 NEM为 S igma
公司产品 。花粉萌发液内含 15.00%蔗糖 , 0.01%
硝酸钾 , 0.02%硫酸镁 , 0.01%硼酸 , 0.03%硝酸钙。
1.1　NEM对川百合花粉萌发和花粉管伸长的影响
花粉萌发参考陈钟颖等人的方法 [ 7] ,取出冻存
的川百合花粉 ,经过至少 12 h的水合。去除花粉中
的油脂后 , 分别放入不同浓度 NEM (0 μmol /L、 5
μmo l /L、10 μmo l /L、15 μmo l /L和 30 μmo l /L)的萌
发液中 ,在温度为 28 ～ 30 ℃,转速为 70 ～ 90 r /m in
的温箱中萌发 60 m in,显微镜下统计川百合花粉的
萌发率 。将充分水合后的川百合花粉先在萌发液中
萌发 40 m in,再转至含有不同浓度 NEM(0 μmo l /L、
15 μmol /L和 30 μmo l /L)的花粉萌发液中 80 m in,
测量并统计川百合花粉管的长度。
1.2　NEM抑制川百合花粉萌发和花粉管生长的
恢复
NEM抑制川百合花粉萌发和花粉管生长的恢
复试验参照 G ibbon等的方法 [ 8]并稍作修改 ,具体方
法为将充分水合好的川百合花粉先分别在含 0
μmo l /L、 5 μmo l /L、 10 μmol /L、 15 μmo l /L 和 30
μmo l /L的 NEM萌发液中萌发 30 m in后 ,用 20 μm
尼龙网滤去含 NEM的萌发液 ,收集花粉 ,并用不含
有 NEM的萌发液淋洗多次 ,再在不含 NEM 的萌发
液中继续萌发 40m in,统计其萌发率。
取一定量水合后的川百合花粉预先分别在含有
0 μmol /L、20μmo l /L、25μmol /L和 30 μmo l /LNEM
的花粉萌发液中萌发 40m in ,显微镜下测量 NEM处
理后的川百合花粉管的长度 ,然后用 20 μm的尼龙
网过滤除去含 NEM的萌发液 ,并收集相应的川百合
花粉管 ,接着再转入不含有 NEM的花粉萌发液中继
续萌发 80 m in,显微镜下测量花粉管的长度。
1.3　NEM对川百合花粉管内微丝束排列的影响
将充分水合后的川百合花粉分别放入含有 0
μmo l /L、15 μmo l /L、20 μmol /L和 30 μmo l /L NEM
的萌发液中萌发 50m in, 20 μm尼龙网滤除含 NEM
萌发液 , 收集相应已萌发的花粉并置于含有 10
nmol /L A lexa-phalloidin(分子探针公司产品)缓冲液
(50 mmo l /L Pipes pH6.9, 5 mmol /L EGTA ,
5mmol /L M gC l2 , 0.05% NP-40, 500 mmo l /L甘露
醇 , 75 nmol /L A lexa-pha llo id in)中 , 20 m in后加 1滴
50%甘油并用指甲油封片 ,共聚焦激光扫描显微镜
(B io-rad,MRC-1024)下观察并扫描图像 。
2　结果
2.1　NEM抑制花粉萌发和花粉管生长
用不同浓度的 NEM处理川百合花粉 , NEM浓
度越高川百合花粉的萌发率越低 , 当 NEM 为 30
μmo l /L时 , 对川百合花粉萌发率的抑制率达到
95%(图 1)。而对于川百合花粉管 , NEM能有效地
抑制其继续伸长 ,当 NEM 浓度也为 30 μmo l /L时 ,
对川百合花粉管生长抑制率达到 99%(图 2)。表
明 NEM能抑制川百合花粉萌发和花粉管伸长 。
图 1　川百合花粉在含不同浓度 NEM萌发液中处理后萌发率
F ig. 1　Po llen germ ina tion perentage of lily a ffected by differen t
concentrations o fNEM
　　试验结果还表明 ,川百合花粉在含 15 μmo l /L
NEM的花粉萌发液中 ,花粉管虽能伸长 ,但外形不
再表现为正常的长圆柱形 ,而是呈 “波浪形 ”弯曲
(图 3-3),表明经 NEM处理后很可能改变了花粉管
375张学琴等:NEM对川百合花粉萌发和花粉管伸长的抑制效应
Ⅰ :NEM处理前百合花粉管长度。
Ⅰ :The leng th of pollen tube before NEM treatm en.t
图 2　川百合花粉在含不同浓度 NEM萌发液处理后的长度
F ig. 2　P ollen tube leng th of lily affected by d ifferent concentra-
tions o fNEM
1:对照;2:5 μmo l /L NEM; 3:15 μm ol /L NEM;4:30 μm ol /L
NEM。箭头所指为弯曲的花粉管。
1:Contro l;2:5μm ol /L NEM;3:15μm ol /L NEM;4:30μm ol /L
NEM. Arrow poin ts the ben t pol len tubes.
图 3　NEM抑制川百合花粉管伸长的显微照片
F ig. 3　 Inhibition o f NEM to the grow th of po llen tube o f li ly
中微丝骨架的排列形状。
2.2　NEM抑制川百合花粉萌发和花粉管生长的
恢复
作为微丝骨架抑制剂的条件之一是低浓度起作
用 ,去掉抑制剂后 ,骨架的结构和活性应缓慢恢复 。
川百合 花粉 分别在 含有 0 μmo l /L (对照 )、
20 μmol /L、 30 μmo l /L NEM 的萌发液中先萌发
20 m in,即当花粉管只在萌发孔附近露出小白点时 ,
用 20μm尼龙网过滤除去含 NEM 的萌发液 ,将收
集到的川百合花粉再放入不含有 NEM的花粉萌发
液中继续萌发 80m in后发现 ,经 20μmo l /L NEM处
理过的川百合花粉在去掉 NEM后 ,萌发率能恢复至
对照 (0 μmo l /L NEM)的 98%;NEM处理浓度越高 ,
去掉 NEM后川百合花粉萌发率的恢复程度越低
(图 4)。
经 NEM处理的川百合花粉管生长的恢复试验
结果 (图 5)显示 , 20 μmo l /L NEM处理过的川百合
花粉在去掉 NEM 后 ,花粉管长度能恢复到对照 (0
μmo l /L NEM)的 60%,而 30μmo l /L NEM处理过的
川百合花粉在去掉 NEM后 ,花粉管只能恢复到对照
的 25%(图 5)。表明 NEM在一浓度范围内对花粉
萌发和花粉管的抑制作用是可逆的。
图 4　不同浓度 NEM解除后川百合花粉萌发恢复程度
F ig. 4　R ecov ery of po llen germ ina tion after NEM was rem ov ed
Ⅰ:川百合花粉预先萌发 40 m in时花粉管长度。
Ⅰ:Th e length of pollen tube before NEM treatm en .t
　图 5　不同浓度 NEM去除后川百合花粉管恢复生长的长度
　F ig. 5　The length o f pollen tube after NEM was rem oved
　　上述结果说明 30 μmo l /L NEM 能有效抑制花
粉萌发和花粉管伸长 ,同时也说明在生理活性允许
范围内 , NEM对花粉萌发和花粉管伸长的抑制作用
是可逆的 ,对活细胞没有致死毒性 。
2.3　NEM改变花粉管内微丝束排列的正常形状
结果显示 , 15 μmol /L NEM使川百合花粉管的
376 江 苏 农 业 学 报 　2006年 第 22 卷 第 4期
外形异常 ,说明 15 μmo l /L NEM已影响了花粉管内
微丝骨架的排列 。对用不浓度 NEM处理过正在生
长的川百合花粉管用罗丹明连结的鬼笔环肽孵育
后 ,通过共聚焦激光显微镜观察发现 , NEM处理过
的花粉管内的微丝排列呈弯曲状 ,随着 NEM浓度的
升高 ,微丝束的弯曲程度也越高 , NEM 浓度达 30
μmo l /L时 ,花粉管伸长基本受阻 ,管内的微丝排列
极不规则 ,花粉管顶端表现为球形(图 6)。
A:对照;B:15 μm ol /L NEM;C:20 μmo l /L NEM;D:30 μm ol /L
NEM。
A:C on trol;B:15 μmo l /L NEM;C:20 μm o l /L NEM;D:30μm ol /L
NEM.
图 6　不同浓度 NEM 处理后川百合花粉管微丝的荧光标记
F ig. 6　A lexa-phal lo idin labeled m icro filam ent in pollen tube af-
ter NEM treatm ent
3　讨 论
低浓度的 NEM能抑制川百合花粉萌发和花粉
管的伸长 ,使花粉管外形呈现弯曲状态。微丝骨架
与囊泡的运输有关 ,是花粉管伸长的骨架基础 [ 1] 。
由 F-肌动蛋白形成的微丝束在胞质环流中的作用
可用真菌毒素 CB和 CD[ 9, 10]来鉴定 。这些药剂主
要是结合在肌动蛋白的倒刺端 , 阻止其进一步组
装 [ 11] ,这样就导致微丝束的解聚 。但这类真菌毒素
在处理烟草 [ 9]和水仙[ 10]花粉管中已形成的长微丝
束时 ,其作用只导致 F-肌动蛋白的聚集或进一步聚
合 ,而不再是起解聚作用。用 NEM处理嗜铬细胞 ,
其中的 F-肌动蛋白在细胞骨架中的含量会减少
40% ～ 50%,说明 NEM对肌动蛋白的聚合有抑制作
用。但 NEM是否直接结合在肌动蛋白的倒刺端上 ,
使聚合不再发生还有待进一步证明。
在花粉管伸长过程中 ,微丝骨架是作为其结合
蛋白肌球蛋白的轨道。因为肌球蛋白通过两个头
部 ,利用 ATP作为能量在微丝束上滑行来运输囊泡
的。 F-肌动蛋白与肌球蛋白的结合 ,目前还没有有
效专一性的抑制剂来打断。曾有人用 500 μmo l /L
NEM体外处理 Cha ra节间细胞的细胞质 3m in,试验
发现 ,细胞质中的肌球蛋白不能再结合 F-肌动蛋
白[ 12] 。这些结果表明 ,细胞质被 NEM处理后 , NEM
共价修饰肌球蛋白的 ATPase端的巯基 ,使肌球蛋白
的功能发生改变 ,肌球蛋白与肌动蛋白的结合也随
之发生改变 ,从而影响其在 F-肌动蛋白上滑行 [ 5] 。
NEM能有效抑制花粉的萌发和花粉管的伸长 ,
一方面有可能首先影响了肌动蛋白的活性 ,对其结
构进行修饰 ,使其正常的延伸功能受到影响。因为
用 15 μmo l /L NEM处理川百合花粉时 ,大部分花粉
仍具有萌发能力 ,而且还形成一定长度的花粉管 ,但
花粉管已表现异常 。利用罗丹明-phallo idin活体标
记这些异常的花粉管中的微丝 ,微丝束为 “波浪”形
弯曲;NEM 浓度达到 20 μmo l /L时 ,花粉管内的微
丝束变形程度较大;NEM 浓度达到 30 μmo l /L时 ,
NEM不单单影响肌动蛋白的活性 ,还可能波及到其
结合蛋白 (如肌球蛋白的功能 )和肌动蛋白与其结
合蛋白的相互作用 。因为 30 μmol /L NEM 处理的
川百合花粉 ,萌发完全受到抑制 ,即使肌球蛋白仍有
部分功能携带囊泡沿着极不规则排列的肌动蛋白丝
上滑行 ,但也只能将囊泡堆积在萌发孔端 ,使萌发孔
端形成一个球状突起 ,花粉管不再伸长 。
本研究结果表明巯基类化学反应试剂 NEM也
是抑制微丝聚合的一种有效的试剂 ,进一步说明微
丝骨架是花粉管伸长的一个必需因子。
参考文献:
[ 1] 　TAYLOR L P , HEPLER P K. Pollen germ ination and tube grow th
[ J] . Annu Rev P lan tPhysio lPlan tMo lB iol, 1997, 48:461-491.
[ 2] 　COTTON J F, WELSH M J. C ovalentm od ification of the regu lato-
ry dom ain irrevers ib ly st imu lates cystic fibrosis transm em b rane con-
ductance regu lator[ J] . J B io l Chem , 1997, 272(41):25617-
25622.
[ 3] 　M ILZAN I A, DALLE-DONNE L, COLOM BO R. N-ethy lm aleim-
ide-m od ified act in filam en ts do not bund le in the presence ofα-ac-
tin[ J] . C ellB iol, 1995, 73:116-122.
377张学琴等:NEM对川百合花粉萌发和花粉管伸长的抑制效应
[ 4] 　WU Y N, YANG Y C, WAGNER P D. M od ification of ch rom affin
cells w ith pertu ssis tox in or N-ethy lm aleim ide lowers cytoskeletal
F-actin and enhances Ca(2+)-dependent secretion[ J] . J B iol
Chem , 1992, 267:8396-8403.
[ 5] 　WAKAYAMA J, SHOHARA M , YAGI C, et a.l M otions of the
m yos in-coated beads actively s lid ing along actin filaments susp en-
d ed b etw een imm ob ilized beads[ J] . B ioch im ica etB iophysica A c-
ta, 2002, 1573:93-99.
[ 6] 　STRE ICHMAN S, HERTZ E, TATARSKY I. D irect invo lvem en t
of spectrin th iols inm aintain ing erythrocytem em brane therm al sta-
b ili ty and spectrin d imm er self-association [ J] . B ioch im B iophys
Acta, 1988, 942:333-340.
[ 7] 　陈钟颖 ,朱广廉. 从低温贮存兰州百合花粉中制备批量的生活
精细胞 [ J] . 植物学报 , 1995(38):589-593.
[ 8] 　G IBBON B C, KOVAR D R, STAIGER C J. Latruncu lin B has
d ifferent effects on pollen germ ination and tube g row th[ J] . Plan t
C ell, 1999, 11:2349-2363.
[ 9] 　LANELLE S A, HEPLER P K. C ytochalasin-indu ced u lstructu re
alteration in Nicotiana pollen tubes[ J] . P rotoplasm a, 2001, 215:
64-76.
[ 10 ] MASCARENHAS J P. M olecu lar m ech anism s of pollen tube
grow th and d ifferentiation[ J] . Plan tC ell, 1993, 5:1303-1314.
[ 11] COOPER JA. E ffects of cytocha lasin and phalloid in on actin[ J] .
J C ell B iol, 1987, 105:1473-1478.
[ 12] GROLIG F, SCHRODER J, SAW ITZKY H , et a.l Partia l ch arac-
terization of a pu tat ive 110 kDa myosin from the green alga Chara
Cora llina by in vitro b ind ing of f luorescent F-actin[ J] . Ce llB iol,
1996, 20(5):365-373.
草莓新品种———紫金 1号
钱亚明 , 　吴伟民 , 　赵密珍 , 　王壮伟 , 　袁　骥
(江苏省农业科学院园艺研究所 ,江苏 南京 210014)
　　紫金 1号是由硕丰为母本 、日本品种久留米为父本杂交选育而成的草莓新品种 , 适于大棚或露地栽培 , 该品种果实酸甜 、
风味浓 、易除萼 、抗病性强 、丰产性好 、耐贮藏。
1　特征特性
紫金 1号植株生长势强 , 平均株高 22 cm , 株冠径 32 cm;分株能力弱 , 匍匐茎抽生能力强;两性花 ,低于或平于叶面 , 花序
斜生;耐热性好 ,抗炭疽病和蛇眼病。
紫金 1号为非四季型草莓品种。果实短圆锥形 , 纵径稍大于横径;果面鲜红 , 略有棱 , 果型整齐;果肉和髓心红色或橙红
色 , 着色均匀;果实种子微凹于果面 ,萼心状态为凹型;果实萼片翻卷 , 易除萼;露地栽培条件下 , 第 1、2序果平均单果重 13. 5
g, 最大果重 25. 0 g,单株产量为 197. 0 g, 可溶性固形物在 9%以上。
2　物候期
紫金 1号在南京地区大棚栽培时 , 可于 9月底至 10月上旬定植 ,次年 1月上 、中旬覆棚膜 , 3月上 、中旬初花 , 3月下旬果
实转白 , 4月中旬进入果实采收期 ,采收时间可持续到 5月底 , 采收期达到 35 d;进行露地栽培时 , 定植时间同半促成栽培 ,初
花期为次年 3月 28～ 31日 , 4月下旬果实转白 , 5月上中旬进入果实采收期 ,采收期在 20 d左右。
3　栽培技术要点
3. 1　培育壮苗　紫金 1号栽培应培育壮苗 。壮苗的要求为单株苗须根 10条以上 , 根茎粗 0.8 ～ 1. 0 cm , 有 4张以上展开叶 ,
叶色浓绿 , 中心芽饱满 ,单株平均重 30 g左右 ,无病虫害。
3. 2　适当密植　紫金 1号在江苏及周边地区种植时 , 可以进行起垄密植 , 株行距一般控制在 20 cm ×25 cm , 种植密度以
667 m2 6 000 ～ 8 000株为宜。
3. 3　加强管理　及时摘除老 、病叶和多余的叶片 , 使草莓植株始终保持在 4 ～ 6张展开叶 ,进行露地放蜂授粉;施足基肥 , 每
667 m2田施腐熟有机肥 2 000 kg, 氮 、磷 、钾复合肥 30 kg和钙肥 30 kg左右;适时追肥补水 , 在现蕾期和果实膨大期各施肥 1
次 , 肥料主要是 0. 2% ～ 0. 3%的复合肥或微量元素肥 ,并在 1月初至 2月中 、下旬采用滴灌结合黑地膜覆盖技术。
3. 4　病虫害防治　育苗期间主要防治草莓叶斑病和炭疽病 ,大田期间重点防治草莓果实灰霉病 、白粉病和蚜虫。
378 江 苏 农 业 学 报 　2006年 第 22 卷 第 4期