全 文 ：一 5 0 3一 药物分析杂志 C ll i n J P ha r l n An a l 200 8 , 2 8 ( 3 )
H P L C 一 E L S D 内标法测定知母药材中菠莫皂普元含量 `
陈千 良’ , 2 , 王文全 2 * * , 马长华2 , 孙文基 ’
(1
. 西北大学 陕西省生物医药重点实验室 , 西安 7 10 0 69 ;2 . 北京中医药大学 中药学院 , 北京 10 01 02 )
摘要 目的 :建立 HP L C 一 ELS D 内标法 , 测定知母药材中被莫皂存元含量 方法 : 采用胆固醇为内标 , rK o m as il C I: 柱 ( 250 m m
x 4
.
6 m m
,
5 卜n 。 ) , 以 甲醇为流动相 , 流速 1 m L · ril n 一 ’ 。 柱温为 30 ℃ 。 蒸发光散射检测器漂移管温度为 50 ℃ ,蒸发温度为
70 ℃ , 以氮气为雾化气 ,压力为 1. 03 / 10 5 Pa 结果 :菠莫皂背儿进样浓度在 0 . 02 一 0 50 。 1 9 · n lL 一 ’ 内 ,进样量的常用对数与
对照品峰和内标峰面积比值的常用对数成良好线性关系 ( r = 0 . 9 9 9 5 ) ;平均回收率 ( ,: = 5 )为 9 6 . 3% , RS D 为 2 . ] % 。 结论 :建
立的内标方法准确 、快速 , 是控制知母药材质量较理想的方法 对我国北方主要知母产地药材中拨莫皂昔元含量侧定和 比较
表明不同产地野生知母质量差异较大 。
关键词 : 知母 ;高效液相蒸发光检测 ; 内标 ;被莫皂背元 ;含量测定
中图分类号 : Rg 1 7 文献标识码 : A 文章编号 : 0 2 5 4 一 17 9 3 ( 2 0 0 5 )0 3 一 0 350 一以
D e t e r m i n a t i o n o f S a f s a S S P 0 g e m n 11 R h i
z o m a A n e m a r r h e n a e
b y H P L e 一 E L s D i n t e r n a l s t a n d a r d m e t h o d `
C H E N Q i
a n 一 li a n g w AN G w e n 一 q u a n Z “ M A e h a n g 一 h u a Z , Su N w e n 一 ji
( 1
.
B i
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A b s t r a c t O bj
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W i t h e h o l e
s t e r o l a s i n * e rn a ] s t a n d a
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,
K r o m a s i l C
, , e o l u m n ( 2 5 0 m m
x 4
.
6
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,
5 协m ) w a s u s e d . M ( ) b il e p h a s e w a s m e th a n o l w i t h t h e fl o w r a t e o f 1 m L · m i n 一 ’ ; t h e t e m p e r a r u r e o f t h e d r i fl
tu b e a n d
e v a p o r a t i o n w a s 5 0 ℃ a n d 7 0 ℃ r e s P e e t i v e l y . T h e g a s p er s s u er w a s 1 . 0 3 x 10 5 p a . R e s u l st : T il e r e w a s
g o o d l i n e a r i ty i n t }l e ar n g e 0
.
0 2 一 0 . 5 0 m g · m L 一 1 o f s a r s a s a p o g e n i n r = 0
.
9 9 9 5 ; t h e a
v e ar g e r e (
: o v e卿 w a s 9 6 . 3%
w i th R SD o f 2
.
1%
.
C o n e l u s i o n : T h e i n t e r n a l s t a n d a
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.
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s u i t a l) l e fo r q u a l i t y (
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.
T h e r e s u l t o f d e t e r m i n a t i o n r e v e a l s t h a t t h e q u a li t y o f R h i z o m a A n e m a r h e n a e fr o m d i-f
fe r e n t p l a e e s o f n o rt h C h i n a a r e o f n o t a b le d i fe er
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.
K e y wo dr
s : R h i
z o m a A n e m a hr
e n a e ; H P L C 一 E LS D in 定e nr a l s ta n d a dr ; s a sr a s a p o g e n i n ; d e t e mr i n a ti o n
知母为 百合科 L il ac ae e 知母属多年生草本植物
知母 A ne m ar lr en a as p ho de ilo de 、 B ge . 的干燥根茎 , 始
载于《神农本草经 》 ,列为中品 , 具有清热泻火 、 生津
润燥的功能 。 用于外感热病 、 高热烦渴 、 肺热燥咳 、
骨蒸潮热 、 内热消渴 、肠燥便秘等症 。 知母根茎主要
含皂昔类成分一” 1 。 药理研究表明知母皂昔具有较
强的抑制血小板 的聚集 [ ’ 〕 、清除 自由基 [` l 、降血糖
作用 }’ 〕 , 以及改善认知功能 、 抗衰老等作用 [ 6〕。 知
母中所含街体皂昔种类较多 ,但水解后 的普元主要
是菠葵皂昔元 ( as sr as ap go en in ) ,并且菠莫皂昔元具
有 N a + 、 K + 一 A T P 酶抑制活性 , 被认为是知母泻火
解热的活性成分 〔7〕 。 因此 2 00 年版中国药典开始
以菠葵皂昔元含量作为指标 ,反映总皂昔的含量 ,作
为知母药材基本的质量控制方法 〔8 ] 。 由于菠莫皂
昔元没有紫外吸收 , 所以知母药材及其制剂中菠莫
皂昔元的含量测定 多采用薄层 扫描法 [8 一 ” 」和气相
色谱法 } ’ ` , ” 〕。 在高效液相色谱法中则采用示差折
光检测 〔’ ` 1和蒸发光检测 「’ 7」。 而后者的灵敏度高于
* *
闰家 “ 十五 ” 重大科技专项 “ 创新药物和中药现代化 ” , 2 0 01 B B 7A 01 A 62 一 13 ;西北大学科研启动项门资助
通讯作者 r e l : ( 0 10 ) 84 7 3 8 6 2 3 ; E 一 m a j l : w w q 5 7@ 1 26 . e o m
DOI : 10. 16155 /j . 0254 -1793. 2008. 03. 004
药物分析杂志 Ch in J p h a rm A n 滋 2 0 0 8 , 2 8 ( 3 )
前者 , 是 目前最理想的检测方法 , 被 2 0 0 5 年版中国
药典所采用 { ’ 8 { 。 但是 已有文献中的液相色谱方法
均采用外标法定量 [ ’ 9 一 ” , , 由于蒸发光检测器的灵敏
度和稳定性与紫外检测器 尚有一定差距 , 而且外标
法和内标法相 比 ,引起误差 的可能性较大 。 ) 目前作
者尚未见到采用 H P LC 一 E L SD 内标法进行含量测
定的报道 。 本文建立 了以胆固醇为内标的 H P L C -
IE
J
s D 方法 ,能够提高测定 的准确性 ,并测定 了我 国
北方主要产地知母药材中被莫皂昔元的含量 。
1 仪器 、试剂与材料
高效液相 色谱仪 : E SA 高效液相 色谱仪 , 检测
器 : E S A 蒸发 光散射检测 器 ( 美 国 E SA ) ; K Q -
s o 0 D E 型数控超声波清洗机 (昆山市超声仪器有限
公司 ) ; H H 一 6 型恒温水浴锅 (江苏 国华电器有限公
司 ) 。
援莫皂昔元对照品购 自中国药品生物制品检定
所 (批号 : 1 10 7 4 4 一 2 0 0 3 0 6 , 供含量测定用 ) , 内标物
胆固醇购 自生工公司 , H P LC 蒸发光检测 ,纯度大于
9 9%
。 娃哈哈纯净水 ,色谱纯 甲醇 ( F IS H E R ) , 其余
试剂均为分析纯 (北京化工厂 ) 。
不同产地药材样品均经北京中医药大学中药学
院刘春生副教授鉴 定 为 A ne m a hr en a a sP ho de ilo d es
B ge
. 的干燥根茎 , 留样药材存于北京中医药大学中
药学院中药生药系标本室 。
样品来源及采集时间见表 1 。 样品在取样地多
点随机挖取 ,根茎总鲜重一般不少于 1 k g ,最少不低
于 5 0 0 9 。 去掉地上部分及须根后 。 根茎用毛刷刷
去泥土 , 晾晒或低温烘干 ,粉碎 。
2 方法和结果
2
.
1 色谱条件 色谱柱 : K r o m a s i l C 1 8柱 ( 2 5 0 m m x
4
.
6 m m
,
5 林m ) 。 流动相 : 甲醇 , 流速 1 m L · m i n 一 ’ 。
柱温为 30 ℃ 。 蒸发光散射检测器漂移管温度为 50
℃ ,蒸 发温度 为 70 ℃ , 以氮气为雾化气 , 压力 为
1
.
03 xl 护 P a 。 在此条件下 , 菠莫皂昔元保留时 间
为 1 1 . o m i n , 内标胆固醇保留时间为 2 7 . o m i n 。
2
.
2 系列对照品溶液的制备 精密称取适量被莫
皂普元对照品置 10 m L 量瓶中 , 以甲醇溶解定容 ,配
制成浓度约为 1 . 0 m g · m L 一 ’ 的对照品溶液 ;精密称
取适量胆固醇置 50 m L 量瓶中 , 以甲醇溶解定容 ,
配制成浓度约为 1 . 0 m g · m L 一 ’ 的内标溶液 。 分别
精确吸取上述菠葵皂昔元对照品溶液 50 , 10 , 2 0 ,
5 0 0
,
10 0 0 协 L 置 2 m L 量瓶中 , 精确加 人内标溶液
2 0 0 林 L ,加甲醇至刻度 , 即得 。
2
.
3 线性关系考察 精密吸取以上系列对照 品溶
液 10 林L 注人液相色谱仪中 ,记录色谱图 , 测定援葵
皂昔元峰面积和胆固醇峰面积 。 以被葵皂昔元的进
样质量 ( 林g ) 的常用对数值 X 为横坐标 , 以菠葵皂昔
元和胆固醇峰面积之比的常用对数值 y 为纵坐标
进行回归 ,得到方程 :
Y = 1
.
6 O S X + 0
.
6 18 7 r = 0
.
9 9 9 5
说明菠 莫皂昔元进样浓度在 0 . 02 一 .0 5 m g ·
m L
一 ’ 内 ,进样量 (此 )的常用对数值与对照品峰和内
标峰面积比值的常用对数呈 良好线性关系 。 色谱图
见图 1 。
一一 - - ~一 一 ~ - - r es . es .0 5 10 巧 2 0 2 5 t / m i n
图 1 菠莫皂阵元对照品和内标色谱 图 (制作标准曲线的图谱重叠
图 )
F i g 1 Ch or m a l o g a 。 叮 s a r s a s a p o g e n i n a r ld i n r e r n a l s t a n d翻 ( o v e r -
l a p P e d e h r o :。 a ro g ar m s 10 s t a n〔 ladr
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n g )
一 菠莫皂背元 ( s a r s a s a p o g e n i , 1 ) 2一勾标胆 固醇 ( ( }l o l e s一e r( , l , i n l e :: l a l
s r a n d a
r
d )
2
.
4 供试品溶液的制备 知母药材低温干燥 ,粉碎
后过 3 号筛 。 精密称取药材粉末 0 . 5 9 , 置 25 m L 量
瓶中 , 加人乙醇接近刻度 , 浸泡过夜 。 超声波振荡
(功率 2 0 0 W , 频率 3 0 k H z ) 4 0 m i n , 取 出放至室温
后 , 以乙醇定容。 滤过 , 取续滤液 10 m L 置烧瓶中 ,
蒸干 ,加人浓盐酸 1 . 5 m L ,水 10 m L ,水蒸气回流水
解 Z h 。 水解液放至室温 , 滴加 4 0% 氢氧化钠溶液
至由黄色突变为橙红色 。 用氯仿 30 m L 萃取 2 次 ,
合并萃取液 , 回收氯仿至干 。 残渣用 甲醇溶解 ,转移
至 10 m L 量瓶中 ,加入上述胆固醇内标溶液 1 m L ,
以甲醇定容后用 0 . 45 协m 滤膜过滤 , 即得 。
2
.
5 精密度试验 吸取同一份供试品溶液 10 卜L ,
重复进样 5 次 , 计算菠莫皂昔元含量 ,结果平均含量
为 1 . 10 % , R SD 为 1 . 7 % ,表明精密度 良好 。
2
.
6 稳定性考察 取同一供试品溶液分别在 O , l ,
2
,
3
,
6
,
s h 注入液相色谱仪测定 ,计算被莫皂昔元
含量 , 结果平均含量为 1 . 09 % , R SD = 2 . 1% ,表明供
试品溶液在 s h 内稳定性良好 。
2
.
7 重复性试验 精密称取同一知母药材粉末 5
份 ,按照 “ 2 . 4 ” 项下方法制备供试品溶液 , 进样 10
卜L 。 测得被莫皂昔元平均含量为 1 . 36 % , R s D 为
一 3 5 2 一 药物分析杂志 C h i , , J Ph a mr A n al 2 0 0 8 , 2 8 ( 3 )
2
.
0%
, 说明本方法的重复性较好 。
2
.
8 回收率试验 精密称取药材 ( 山西繁峙 , 含量
0
,
53 % )粉末 0 . 25 9 ,共 5 份 , 分别精密加人对照品
溶液 l( . 13 m g · m L 一 ’ )0 . s m L ,按照 “ 2 . 4 ” 项下方法
制备 供试 品 溶 液 并测 定 。 求得 平均 回 收率 为
9 6
.
3%
,
R SD 为 2 . 1% ,表明本方法回收率较好 。
.2 9 样品测定 精密吸取供试品溶液 or 林L ,注人液
相色谱仪测定 ,进样 3 次取峰面积的平均值 ,根据回归
方程计算含量 ,结果见表 1。 药材样品色谱图见图 2 。
表 1 不同产地野生知母菠羹皂普元含量 (M 上 S D , n = 3)
T a b 1 C o n t e n t s o f a
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v e c o n s t it u e n t i n s a m Pl e s
fr o m d i fe
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r o d u e i n g a r e a
采集时问
来源 ( 、 0 1: 。* 、 ) 贬)l l c c t i o一1
被莫电普元
含量 ( e o n l e n L ` ) f
as
r 、 sf1 ()P邵 in l) / 呢
河北琢鹿 ( z卜L , { )IL月, Il o b e l )
北京松山 ( s , , lg s h a n . B e j i; 19 )
河北平 11一( P in g、 h a n , 生I e b e i )
河北易县 ( Y i x i a , 1 , H e } , e i )
河北内 昆 ( N e lq i u , H o l ,e i )
河北内 丘 ( N 。 」q iu , } {。 I ,` i )
河北涉县 ( Sh e x ,a 。 , H 。 } )一i )
内蒙补13函辽 ( T o n g l i a 〔、 , N e iM ` , n g g o l )
吉林突泉门’ u q : , a n , J ll i r . )
内蒙 [t f赤峰 ( C h价n g , N e i M . ) n g g o l )
山西繁峙 ( F an , h j , Sh a n x i )
山西陵川 ( Li n g e h u a n , s卜a o i )
山西榆社 ( Y u s h e , S卜a , l x i )
山西 灵丘 (肠 n朋 i u , S h a r l x i )
山西绛县 ( J ian 爵 i a n , Sh a , l x i )
河南辉县 ( H u , x l an , H e r , a ` , )
陕西吴旗 ( w u q i , Sh a anx i )
陕西榆林 ( Y u l i n sh a a n x l )
陕西定边 ( iD n曲 ian , hs a 二 )
陕西 ( S卜a a n x i ) *
黑龙汀大庆 ( n a q i , ,g . ll o i l o n自ia n` )
黑龙门泰康 ( r a i k a n。 , H e i l o n 为 i a n g )
宁夏固原 ( G u y u a n , 刊 , n罗 j a )
*野生知母药材 , 购自西安万寿路药材市场
2
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4 士 0
.
07
1
.
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.
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.
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.
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.
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.
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.
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.
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.
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.
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.
8 9 士 0
.
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.
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.
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1 3 士 1
.
0 3
0
.
5 8 土 0
.
0 3
86101051óùō2054
0 5 10 1 5 2 0 25 七/ m i n
图 2 易县知母药材样品色谱图
F ig 2 C h
r o n i a t o g r a n i o f s a
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1
. 被莫皂昔元 ( s asr a s a p o g e n i n ) 2
s t a n d ar d )
Y i
x i a n
内标胆 klJ 醇 ( C h o l e s [ e or l 、 i n t e nr al
3 讨论
3
.
1 菠葵皂昔元没有紫外吸收 ,用高效液相色谱测
定菠葵皂昔元含量蒸发光散射检测器是 比较好的选
择 ,它 比示差折光检测器灵敏度高 ,而且可 以用梯度
洗脱的分离条件 。 但是它的灵敏度 、 稳定性和精密
度与紫外检测器相 比还是有一定的差距 。 应用外标
法测定菠莫皂昔元的含量时 , 由于检测器本身稳定
性只能保持在一定限度 ,所 以测定结果的准确度就
会受到影响 。 采用内标法避免了用外标法时对照品
测定与样品测定过程间仪器状态的波动造成的定量
误差 ,从而提高了测定的准确性 (: 对于蒸发光散射
检测器 ,这种提高应该更为明显 。 另外 ,一般外标法
每次测定都要随行测定两点对照品 , 或制备标准曲
线 ,而内标法在方法建立之后 ,测定时只需分析样品
溶液根据回归方程就可定量 ,所以内标法不仅准确
而且更为简便快速 。
3
.
2 知母药材中不含有胆固醇 , 而且在色谱图上与
菠葵皂昔元分离良好 。 胆固醇属于 幽体化合物 ,结
构和性质与菠莫皂昔元相近 , 在蒸发光散射检测器
要求的条件和响应方面都 比较接近 ,所以是 良好的
内标物 。
3
.
3 蒸发光检测器检测的灵敏度受多种因素影响 ,
进而影响图谱的质量和测定方法的灵敏度 。 试验中
对检测器漂移管温度和蒸发温度以及雾化气体流速
进行了优化 。 当漂移管温度为 50 ℃ , 蒸发温度为
7 0 ℃ ,雾化气压力为 1 . 03 x 10 , P 。 时检测的灵敏度
最佳 。
3
.
4 对供试样品溶液制备过程中水解 时添加浓盐
酸的量和回流水解的时间进行了优化 。 分别考察了
加盐酸 l , 1 . 5 , 2 m L , 水解时 l司 1 . 5 , 2 , 3 h 。 以菠奠
皂昔元含量作为指标 , 反复试验 , 最终确定了水解时
加人浓盐酸 1 . 5 m L , 回流水解 Z h 为最佳条件 。
3
.
5 中国药典以获莫皂昔元含量作为标准控制知
母质量 ,是衡量知母总皂昔含量的基本指标 。 从测
定结果看 ,河北琢鹿样品的含量最高 ,含量最低的是
河南辉县样品 。 前者是后者的 8 倍多 。 对所有样品
进行方差分析 ,样品间菠莫皂昔元含量差异极显著
(尸 < 0 . 0 1 ) 。 所有样品 的平 均 含 量 ( n = 23 ) 为
1
.
17 %
,
R SD 为 61 . 3% 。 全国不同产地野生知母菠
莫皂昔元含量多半能够达到中国药典标准 ,但是变
化很大 ,说明各地知母质量有较大的差异 。
3
.
6 知母为常用大宗中药材 , 我国北方的河北 、 山
西 、 内蒙等广大地区均有广泛分布 。 主要产区在河
北太行山地 ,传统上以河北省易县所产质量最优 ,称
药物分析杂志 C hi n JP ha rm An al 2 008 , 2 8 ( 3 ) 3 53
之为 “ 西陵知母 ” , 是著名的道地药材 「2 2〕 。 本试验的
河北省样品中被莫皂昔元含量普遍较高 ,从一定程
度上印证了河北产知母的道地性 。 但是易县样品的
含量并不是最高的 ,这提示决定道地 “ 西陵知母 ” 质
量的因素并不仅仅是被莫皂昔元含量一项 , 其内在
质量特征还需进一步研究来揭示 。
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(本文于 2 0 0 7 年 3 月 15 日收到 )