全 文 ：吉林农业 大学学报 20 3, 25 ( 5 ) : 4 9 一 5 02
oJ
“砌之of iJ il n A『女以 t u几汉 nU i馏冷姆
盐胁迫下短芒大麦 c O N A 文库的构建
陆一鸣’ , 李彦舫 , , 白杰英’
( 1
. 解放军军 需大 学生物教研 室 , 吉林 长春
3 1X() 3 6 ; 3
. 军事 医学科学院 , 北京 l X() 85 0 )
曹明富2 , 马鹤雯’ , 阮承迈 J
13《X巧2 ; 2 . 杭州师 范大 学 生物 系 , 浙江 杭 州
摘 要 : 为 了克隆与研究盐胁迫相 关的基 因 , 以 盆胁迫后 的扭 芒 大麦叶 片为 材料 , 用 irT ozj 一步法提取总
RN A
,
iol 即 ( dT )纤维素柱纯化 m NR A , 反转录合成第一桩 c DN A 和第二健 。 D NA 。 。 DN人纯化后 , 与 现人P 表达载
体连接 , 体外包装后得到盆胁迫下姐芒大走 。ND A 文率 ,其重组 率达 % % , 滴度为 2 x l口两 /诚 , 擂入 片段长
度 0 . 5 一 3 . 0 k b 。
关妞询 : 姐芒大麦 ; 盆胁迫 ; 。 DNA 文库
中圈分类号 : 7Q 8 5 ; 5 12 . 3 文欲标识码 : A 文章摘号 : 1仪” . 5 684 ( 20 3 )05 ·以卯一 04
C o n s t ur ot io n of e D NA L ib ar yr o f 扫lO化eI u m b er VIS ub u伯如用
Lin k U n d 6 r S a !t st 限5 5
切 Y i一而 n g , , L l Y an 一afn g , , B ^ x Ji e 一 y i吧 , , e A o M i昭一 fu Z , M A H e · we n ` , R u ^ N e h e n g 一ma i ,
( 1
.
D初is 匆 n of B动之叮犷 , 2触 口“ 南门们旧活把 r nU 油 sr 勿 of P M , C肠火卯人un , 拟认 13以巧2 , hc ian ;
2
. 刀叮心材me 瓜 of B如10盯 , aH昭认o 。 几配加 r , ! co ll卿 , 而哪咖。 , 乃哪“叮 31 X() 3 6 , hc ian ;
3
.
Ac山众哪 of iM il 协尽 eM d必以 反纪一 , 及访n g 10 85 0 , ch ian )
A be t『a Ct : In o dr e r ot e lon e an d s tu d y s al t一 s流 5 er lat e d ge nes , t o alt RNA was
·
isol at
e d 加m l e va es of
oH der
u m b , is动以以山 m ( irT n . ) U kn u s i n g饥现 O L er叫笋 n t u n d e r asl t s tesr an d m RN A aws fu rt h e r p u -
ir if de th or u hg 0 11即一 dT e e ll u lo s e . hT e if st t st o d e DN A aws s y n th es i ez d 场 er v e ser tanr cs ir Ptas e
. 从 e r
th e s y n th e s i s of th e se e o n d at anr d
,
ht e e DN A was
p u成 ed an d 11, tde 杭 ht 理 A P e x Per s v e c to r . 从 er
pac k呼 n g i n v i t or , het e DN A li b ar 叮 Of oH成 , b卿自幼山随红 , ( irT n . ) U kn , co sn utr e t e d . 仆 e 。 D -
N ^ li b口 yr e on at i n e d 2 x 20, e lon e s
,
in 汕 i e h 咖 er t腼 9 6% e loesn we er er co 汕 in an st an d most of i n -
s e rt D NA far grn
e n ts we er ha tw e
n 0
.
5 一 3
.
0 kb
.
Ky6 wo dsr
:
oH沁 u o b。 七ub 以a 名i u m ( irT n . ) U n k ; 。al t st ~ ; e DN A li b ar 砰
土壤盐碱化是世界上限制农业生产的一个重
要环境因素 。 全世界有 3 . 8 x l护 h扩 盐碱土地 ,
在我国 6 . 7 x 10 ? h耐 耕地中就有 or % 耕地为盐演
化土壤 ,严重影响着现代农业的发展 。 开发利用
盐碱荒地 ,使之发挥出生产上的巨 大潜力是农业
生产上的一个重要课题 。 短芒大麦 〔oH沁“ m b卜
沁 ub 以哪她m ( irT n . ) U nk 〕是禾本科大麦属 中的一种
多年生草本植物 ,俗称野大麦 ,广泛分布于我国的
东北 、华北 、 内蒙 、青海及新服等地 ,其优点是草质
柔软 ,适 口性好 ,各种家畜喜食 , 营养价值较高 , 同
时又具有较高 的产量 , 除放牧 、 调制干草 、加工草
粉外 , 又可在低湿地上种植 , 建立人工草地 , 具有
良好的生产性能及较高的经济价值 。 因此培育短
芒大麦耐盐碱新品种和研究耐盐的分子机理对改
良盐碱地 , 实现 “ 退耕还 草 ” 具 有重要 的现实意
义 [】” 一。
谷金项目 : 国家自然科学基金 ( 39 8( 犯 l伪 )和吉林省自然科学基金 (卯 O公乃 一 2) 资助项 目
作者简介 : 陆一鸣 ( 197 5一 ) ,男 ,博士研究生 . 研究方 向 : 分子生物学 。
收稿 日期 : 双犯 3扔 一 15
DOI : 10. 13327 /j . j jl au. 2003. 05. 006
吉 林 农 业 大 学 学 报 2朋 3年
植物受到干旱 、 盐渍和低温等渗透胁迫时会
发生一系列的生理生化变化 , 包括细胞对水 的透
性增加 、离子运输的改变 ,一些具渗透保护作用的
有机分子如糖类 、脯氨酸 、多胺和甜菜碱的积累增
加 、蛋白质组成及基因表达发生改变等 ,其 中基因
的表达与调控研究近年来逐渐受到重视 。 目前已
从许多种植物中分离到一些受逆境胁迫诱导的基
因及基因上游序列 ,但对植物抗渗透胁迫反应的
分子机制仍未完全阐明〔 3一 4 ] 。 本研究 旨在通过建
立盐胁迫下短芒大麦 c D N A 文库 ,从 而为进一步
筛选与盐胁迫有关的基 因 , 探索植物耐盐的分子
机理奠定基础 。
材料与方法
,
.
1 材料
1
.
1
.
1 植物 材料 取短 芒大麦种子 , 用 0 . 1%
H g 1C
2 表面消毒 , 蒸馏水冲洗 , 于 37 ℃浸种 24 h 。
27 ℃ , 自来水暗培养至根长约 2 。m , 转移 至光下
(每天光照 12 h) 、 含 oH ag l an d 营养液 中培养 。 苗
龄 2 周后 , 用 2 . 0% N a e l (用 H o a g la n d 营养 液配
制 )进行胁迫处理 3 一 6 d , 每 日剪取 叶片贮 存在
一 80 ℃ 备用 ,建库时混合随机取样 。 同时对照在
正常 Hao gl an d 营养液中培养 。
1
.
1
.
2 主 要试剂 RT IZ O L R e卿 n t ( G IBC O BR L
公 司 ) , D E CP ( S IMG A 公 司 ) , OlP y ( A ) Qu i k mR N A
I s o l a t io n K i t ( s tar t铭 e n e 公 司 ) , 。D N A s ” th e s is 儿 t
( S t ar t铭 e n e 公 司 ) , z A p E x p er s s p r e d i郎 s t e d v e e to r
儿 t ( s t ar t嗯 e n e 公 司 ) , G i郎 p a e k l 励 ld aP e k a ig n g
xE tar ct ( st 皿 ag en e 公 司 ) ,低熔点琼脂糖购 自 GI B -
Co 公司 ,毛 连接酶购 自 P or m ge 。 公 司 , 各种限制
性内切酶购自 T AKA R A 公司 。
1
.
2 方法
,
.
2
.
, 。 D N A 文 库 的 构建 ( l) 总 RN A 的提
取 。 创造一个 无 R Nas e 的 环境 5[] , 利用 T R zI o L
R e ag en t 试剂盒提取总 RN A (一步法 ) ,具体方法按
GI B CO B R L 公司试剂盒说明书操作 , 电泳检测 。
( 2 ) mR
N A 的分离纯化 。 利用 oP ly ( A ) Qu i k
m丑N A I s o l a t io n K i t 分离纯化 m RNA , 具体方法按
st art ag en
e 试剂盒说明书操作 , 电泳检测 。
( 3 ) CD N A 合 成 。 以 mR N A 为模 板 , 用 含
刀切 工位点的 01 190 ( d T ) 18 的衔接物一引物锚定 ,
在 st art as icr tP R T 反转录酶作用下合成第一链 c D -
N ;A 加人 RN as e H 、 D N A 多聚酶 工等成分合成第二
链 c D N ;A 加 人 p fu D N A 多 聚 酶 补 平 末 端 后 与
及。 R 工接头连接 ; 经 Xh 。 工酶切后得 到 5 , 端 是
及。 R l , 3端是 万五。 工酶切位点的双粘性末端 。 D -
N A
。
( 4 ) 。 D N A 片段的分离和纯化 。 利用低熔点
琼脂 糖 回 收 的方 法 去 掉 A d ap ot sr 和 长度 小 于
4 0 b p的片段 (按分子克隆方法 )[ ` ] 。
(5) 外源 。 D N A 与 砚 A P 的连接与包装 。 将
c D N A 与载体在 毛 D N A 连接酶 的作用下 , 12 ℃ 连
接过夜 。 加人包装蛋白 , 于 2 ℃ (室温 )培养 3 h 。
加人噬菌体缓冲液与氯仿 。 此包装好的噬菌体在
4℃保存 7 d 其效价不会下降 ;可加入明胶至终浓
度为 0 . 01 % , 也可将 DM S o( 体积分数 7% 终浓度 )
加人到上清液 中 , 并分装 成小的工作体积 , 可于
一 70 ℃存贮 1 年 ,而其效价只有微弱下降 。
1
.
2
.
2 所构建的 c D N A 文库滴度及 重组率的 测
定 利用 X L I 一 B l u e M R F 菌种 , 10 nr o l / L 硫酸镁
将细胞稀释至 O D。 为 0 . ;5 用噬菌体缓冲液把包
装反应作一系列的稀释 (重组 噬菌体的适宜稀释
浓度为 :1 1 0 0 或 :l 0r 0 00) ; 在小管中混合 1 拼L
稀释的噬菌体与 10 拼L 准备好 的细菌细胞 ; 37 ℃
培养 30 而;n 加人到 3 m L 顶层培养基 中 , 立即倒
人 NYZ 平板培养基 (含 I刃 G 及 x 一 ga l) 中 , 37 ℃倒
置培养 6 一 s h 就可看到噬菌斑 ,其 中背景斑为蓝
色 , 而重组斑为白色 。 按 下列公式计算噬菌体的
效价 。
滴度 ( p fu / m )L = 噬菌斑数 x 稀释因子
1
.
2
.
3 平板裂解法提取 入噬菌体 D N A 按分子
克隆方法 61[ 。
1
.
2
.
4
。 D N A 文库插入片段检测 ( l) 酶切鉴定 。
以 无 菌 枪 尖 挑 取 20 个 单 个 噬 菌 斑 , 加 入
1 mL l
x 入噬菌体稀释液 中 , 加 20 拼L 氯仿 , 4 ℃过
夜浸提 。 按 “ 1 . 2 . 3 项 ” 平板裂解法提取 入噬菌体
D N A
。 用 百印 R 工 、 Xh 口 工对 所 提 巨nbr da 噬菌体
D N A 进行酶切 , 酶切方法 同基 因组酶切 。 电泳检
测酶切片段大小 。 ( 2) P CR 鉴定 。 按 “ 1 . 2 . 3 项 ”
进行 入噬 菌体 D N A 的提 取 。 利用 毛 引物 (5 , -
A A T T A A C CC TC A CTA A A G G-C 3
`
)
、 工 引物 ( 5 气 G T A -
ATA CGA CCT A CTA TA GGG C
一
3
`
) ; 反应 参数 为 94 ℃
5 而 n : 94 ℃ 1 m in ~ 55 ℃ 30 5~ 7 2℃ 3 m i n , 3 0 个循
环 ;7 2℃ 10 而 ;n 反应体系为 入噬菌体 D N A Z 拼L ,
10 x PC R ih 迁fe r 2 . 5 胖L , 毛 l 拌L , 毛 l 仁L , d N T P
第 2 5卷 第 5期 陆一 鸣等 : 盐胁迫下短芒大麦 D cN A文库的构建
2 仁L , T a q oP l yme asr e l 拼L
, 灭 菌水 25 . 5 产L , 进 行
CP R 扩增 。 电泳检测插人片段大小 。
2 结 果
2
.
, 总 R N A的提取和 m RN A 的分离
高质量的总 NR A和 川 RN A是合成完整 。 D NA
并构建高质量 c DNA 文库的前提条件 。 本实验利
用一步法提取总 RN A , 通过 l % 的琼脂糖凝胶 电
泳检侧 , 可以观察到 2 条典型的 18 5 和 2 85 条带 ,
没有降解 , 说明实验得到 了高质量 的 RNA 分子
(图 l ) 。 利用 olP y ( A ) Qu i k mR撇 ls ol a t i o n K i t 分离
纯化了短芒大麦的 m RN A ,具体结果见图 1。
M 1 M Z
2
.
3 文库滴度的测定
试验结果表 明 : 本试验构建的盐胁迫下短芒
大麦 。 DN A 文库 的滴度 为 2 x l口 vfu /mL ;经蓝 白
斑筛选测定表明 ,文库的重组率约为 % % 。
2
`
4 文库擂入片段大小检测
随机挑选 2 0 个克隆 , 提取 功 N A 后 , 经酶切
和 CP R 鉴定 ,发现有插人片段 , 介于 0 . 5 一 3 . o kb
之间 ,符合文库构建要求 (图 3 和图 4) 。
h刁 1 , 飞 4 气 6 7 只
M I肠 l司 der ; 1 一习 .肠 e 御 d招 of er .颐 e七i o n e n yz m e 山 g翻 t i o n
图 3
F ig
.
3
. 仆 e ld e n幻fj ca jt on
酶切鉴定
ot er s tr jjCt on e n yZ m e d i卯 s tio n
M l 夕 飞 6 7 城
M
.
DU仪X) ; 1 . oT目 RN A ; 2 . m R N A
圈 1 总 RN A , m RN A 电泳结果
F ig
.
1
.
hT e er s u jt ot ot 妇 1 RN A . m R NA e le c切hP o er s iS
2
.
2 双链 c D NA 合成
进一步克隆和分析短芒大麦耐盐相关基因 ,
为后续工作打下良好基础 ,在合成双链 。 DN A 时 ,
采用 01 90 ( d )T 18 而非随机引物来合成第一链 , 以 M . Ik b la dd e r
期使合成的
见图 2
c D N A 具有完整的 3’ 末端 。 电泳结果 圈 4
l · 8 几 e 花 s』 rs of P C R
P C R 鉴定
M 2
F jg
.
4
.
,I’h e id e n t什Ica 舫o n of P C R
3 讨 论
M
. 口以以刀 ; 1 . F i sr t s xanr d e D N A: 2 .
图 2 一链 、 双链 OO N A
Fgl
.
2
. 仆 e er s u胜 ot 有吸 日 n d 名 e c o n d
pho 阳 S治
跳 c o dn s tm n d e D N A
电泳结果
右 tra n d CDN A 6 le tC m -
c DNA 文库的构建是研究 特定组织基 因表达
情况和筛选 目的基因的有利工具 。 获得高质量的
总 NR A和 mR NA 是试验成功的先决条件 。 关键
是如何防止任何外源或 内源 RN S e 可能的污染 ,
其中双链 cD N A 的合成 、 A d aP t or 的连接与去除 、外
源片段与载体的连接体系的建立 、 包装蛋 白的制
备和滴度测定等每一个反应步骤均可以影响试验
的成功 。
植物耐盐基因工程的最终 目的应该是创造出
高度耐盐的植 物品种 ,而植物的耐盐性是多种机
制综合作用的结果 。 科学工作者对植物耐盐机制
5 0 2吉 林 农 业 大 学 学 报 刀犯3 年
的研究做了大量的工作 ,探讨了一些机制 , 克隆到
了一些耐盐相关基因 ,用这些 目的基因进行转基
因植物 , 以便 获得 具有较高耐盐性 的转基 因植
物卜 l0] 。 为此我们利用 砚 A P 表达载体 , 首次构建
出重组率达 % % 、滴度为 2 x l。 , 画 /mL 的盐胁迫
下短芒大麦 c DN A 文库 , 为进一步研究耐盐分子
机理莫定了基础 。 关于从此文库中克隆与研究盐
胁迫相关基因的工作 , 目前本课题组正在进行之
中 。
参考文献 :
[ l ]
[ 2〕
[ 3 ]
2蕊u J , U 丫 F . elS ec it o n for S OD功M 南ior de to le . m t v面 an ts of
iwl d 肠月叮蒯 p l朋 t 叱 e .翻 ion 【J] . 加师目 of N呵 ing N。门回
U in v . 旧i ty (N a t ur 目 cS i
enc 蹦 t i皿 )
.
1卯 8 . 1 : 眨名5 .
陆一呜 ,李彦舫 , , 明富 ,等 , 短芒大麦耐盐杖新品系 的生
理生化和分子生物学分析〔J] . 中国农业科学 ,么拍 2 , 3 5( 3) :
湘2 . 2 86 .
nI 日圈 n l J , 日州目。 D . 仆 e 励1倪曰ar b . i s 成 d曲y如il on tol 。画二
i n IP 曲t 【lJ . nA n RVe ” 以 M ol iB ol . 19 6 , 47 : 37 7训旧3 .
〔41 李子银 , 张劲松 . 陈受宜 , 等 . 水箱盐胁迫应答基 因的克隆 、
表达及染色体定位〔J] . 中国科学 , 19 99 , 29 ( 6) : 56 1 . 5 70 .
〔5J 卢圣栋 . 现代分子生物学实脸技术 (第 2 版 )【M J . 中国协和
医科大学出版社 , 19 9 .
〔61 萨姆布鲁克 J . 分子克隆 (第 2 版 ) 〔M l . 金冬服译 . 北京 : 科
学出版社 . 19 8 .
【7] K州 苟山 or P B ,勘心 ie HO嗯 , Go-u H u a 翻 ao . et 目 . 伽峨即附 -
的。 试△ ’ . p打m】i-ne -5 “ d ” x y al t e 卿山。 . 比 i。一 p . l i. 帅 ·d刚 on . d co nfe o .o m o t 0 l e m朋。 i n atr n叱乒 n i。 p l朋 at [ J ] . ” . t
巧 y s i o , 19 5 , 108 : 13 87 · 13 94 .
【8] IT 锐” . C . arT n吃 e n icaD y e x p佗. 闭 be 面 ne ` d曲der d曲 ydor . e n ase
心 e i e n公y e a回y别 , 画山 6 on of d io hyt l s己 fo n i p功 Pi o aln d e卜yd e a n d
, a而 n司 dhey d e [ J ] . n an t外” 101 , l期 , 一 3 : 一朽 7一 l肠1 .
[ 9 ] u
u Q
.
I osl at i
o n a记 份 p到 , . . on a耐” 15 of wt o ` ce , . e cn“ i n。
山。 amj or i而丽。 orP 闲 n[ J] . 饰 nt 枷 c6 己at iB o l叼 , 194 , 26
( 6) : 岌刃3一万刃, .
[ 10 ] A娜 M p . 灿 t ol~
e
co 刊阮民月 by o v . 旧 x p~
. o n of 。 v二 u o zar
N。 十 lH
令
an ti脚 rt’ r i n An山 idios . [ J ] . 跳 i , 199 9 , 邓 5 ( , 3 1 ):
125 6
·
! 25 8
.
(上接第 49 8页 )
〔2 ] 段川川 n一。 P , n 。肠 P , 书` er M H , et 公 . L犯 . “ on of P口3` , a 脚w ·
d哪 而 ld. w . ” i . . n c吧 目肠lie 。 , h叫 , 场画嗯 a . 旧 n o . 田 . I c a l l . 】-
” 抽耐 by ide ” I如吧~ 的`记耐倪日公 四吐 e o f J]
.
E叩 .明卜
ca
,
19 99
,
1 10 : 19 3
· 198
.
〔3〕 朱文华 , 任明见 , 张庆肠 , 等 . 三个小麦新品系抗白粉病基
因分析〔J〕. 植物病理学报 . 2以X) , 30 ( l) : 25一
〔4」 扬作民 .唐伯让 , 沈克全 , 等 . 小麦抗病育种的战略间题一
小麦对锈病 、 白粉病第二线扰裸的建立和利用【lJ . 作物学
报 , 」卯呼. 功`4) : 3那· 3叫 ,
〔5〕 刘金元 , 刘大钧 . 小麦白粉病抗性基因研究进展 【J] . 植物
病理学报 , 2X( 刃 , 30 ( 4 ) 二刀拍 . 2 95 .
〔6〕 张书绅 . 邱永春 . 东北春麦区小麦抗锈病和 白粉病育种策
略及多样化二线抗裸加速利用方法【J] . 沈 阳农业大学学
报 , 19卯 , 30 ( 3) : 3 37 . 3 42 .
【7〕 盛宝钦 , 用 反应型 记载小 麦 苗期白粉病【J] . 植物保护 .
19 88 ( l ) : 49
〔s] 庞家智 ,刘俊秀 . 孙芳华 ,等 . 小麦对白粉病菌 (召 , 护心脚 -
” ` 山 f .即 . 口公翻 )的抗性特点和遗传评价〔 J〕 . 作物学报 .
1卯 5 . 2 1 ( l ) : l肠一 1 10 .
〔刃 ` “ J, ` 。 D , aoT w , 以 目 . M o l eC 目ar ln . 瓜-er 俪七扭喇 仍 . 口`d -
i叱 吐击瓜门 n t , esn of : 脚树 d衅 m i ld , n湘 1.恤 n伪 i n w haet [ J ] .
月魄 Em司 i叱 , 2以X) , l玲 : 2 1 · 24 .