全 文 ：中 国 糖 料
SugarCropsofChina
2008年
第1期
文章编号:1007-2624(2008)01-0001-03
应用ISSR标记鉴定斑茅BC2杂种真实性
陈健文 1,PhilipA.Jackson2,劳方业 1,刘 睿 1,陈勇生 1,邓海华 1
(1.广州甘蔗糖业研究所/广东省甘蔗改良与生物炼制重点实验室,广州 510316;2.澳大利亚联邦科学与工业研究组织,
澳大利亚 4814)
摘 要:斑茅 [Erianthusarundinaceus(Retz.)Jeswiet]具有抗病虫、抗旱、抗寒、宿根性强等优点,是一种很好的种质资
源。广大的甘蔗育种者做了大量的尝试,希望能把这些优良性状导入到现代甘蔗品种中,并取得了很大的进步,获得
了一批F1和BC1后代。随后,又获得了一批BC2无性系。我们使用30个ISSR标记,对来自10个杂交组合的164个
BC2无性系的杂种真实性进行鉴定。结果表明,有160个是真正的杂种,其中的138个同时具有父母本的特征带,另
外22个仅具有父本的特征带,余下的4个无性系在本研究中还不能确定其杂种的真实性。总体来看,大部分组合仅
用2个ISSR标记即可鉴定杂种的真实性,少数组合甚至仅用1个标记。这说明利用ISSR标记进行甘蔗杂种真实性
的鉴定是可行且相当有效的。
关键词:斑茅;BC2;ISSR;真杂种
中图分类号:S566.103 文献标识码:A
斑茅[Erianthusarundinaceus(Retz.)Jeswiet]是甘蔗近缘属植物,具有抗病虫、抗旱、抗寒、宿根性强等优
点,在甘蔗育种中有着特殊的育种价值和应用潜力[1]。另一方面,近几年来因育种亲本的利用集中化,“种”
的血缘狭窄,导致育成品种的生活力、适应性、抗逆性、宿根性等均普遍下降[2],促使广大的甘蔗育种家越来
越重视对斑茅的杂交利用,希望通过该方法拓宽现有甘蔗品种的血缘,创制新种质。
然而,在甘蔗的杂交育种中,由于甘蔗螽花的特性,很难做到“完全去雄”,故存在母本自交的情况,加上
在杂交过程中不能完全排除串粉的发生。因此,杂种的真假鉴定显得非常重要。只有这样,才能提高甘蔗杂交
育种的效率。甘蔗杂种真实性的鉴定可以通过植株的形态特征、细胞的染色体特征和同工酶等方法来鉴定,
这些方法虽有一定的效果,但存在着可用的鉴定标记较少及易受环境影响等一些难以克服的缺点[8]。随着分
子生物学技术的迅速发展,人们将目光投向直接基于DNA的分子标记。尤其是PCR技术的出现,基于PCR
技术的分子标记,因其具有快速、有效、灵敏度高等特点,更是受到了广泛重视和应用。简单重复间序列(Inter-
SimpleSequenceRepeat,ISSR)标记即是其中的一种,它是一种基于微卫星序列发展起来的新的分子标记,克
服了RFLP、SSR和RAPD的技术性限制,具有操作简单、可重复性高、模板DNA用量少等优点[15],已开始广
泛应用于种质资源及遗传育种研究[3]。但还未见有用于甘蔗杂种苗真实性鉴定方面的报导。本研究尝试采用
ISSR标记鉴定斑茅回交二代 (BackCross2,BC2)杂种苗的真实性,为今后开展分子标记辅助选择 (marker-
assistedselection,MAS)奠定基础。
1 材料与方法
1.1 供试材料
供试材料为斑茅与甘蔗栽培种的BC2无性系,共164个,分
别属于10个杂交组合(见表1)。材料均采自广州甘蔗糖业研究
所海南甘蔗育种场。
1.2 引物
根据Cordeiro等 [13]所报导甘蔗基因组微卫星序列的特点,选
取 30个来自 UniversityofBritishColumbiaBiotechnologyLab
(UBCBL)primersetUBC#9ISSR引物。引物编号分别为808,809,
811,812,814,815,818,823,824,828,830,832,834,835,836,841,842,843,844,845,848,853,854,857,868,
873,880,888,889,891。这些引物大多有17或18个碱基,且主要为两个核苷酸重复序列以及3简并序列,3～5
核苷酸重复序列及5简并序列的也有少数。由上海生物工程公司合成。
1.3 基因组DNA的提取
采用CTAB法提取甘蔗叶片基因组DNA。
收稿日期:2006-12-15
基金项目:广东省自然科学基金项目(020630);广东省科技计划项目(2003C50215);农业部“948”项目(2006-G37)资助。
作者简介:陈健文(1976-),女,广西藤县人,广州甘蔗糖业研究所农艺师。通讯作者:邓海华。
究研验试
1
料糖国中 年8002
a
b


图1标记823对组合8后代的检测结果
1～20:BC2无性系(5和13仅具有父本的特征带,15为不确定个体);
P1:母本YCE01-108;P2:父本新台糖25;a:父本特征带;b:母本特征带
图2 标记812对组合3后代的检测结果
P1:父本YCE01-105;P2:母本粤糖73-204;
1～10:BC2无性系;箭头所示为父本特征带
1.4 ISSR扩增及产物检测
扩增反应在EppendorfMastercyclerGradient(Germany)扩增仪上进行,反应体积为20μL,其成分包括:
12.1μLddH2O,2.5μL10×bufer,2μL10mMMgCl2,1.2μL2.5mMdNTPs混合液,1μL30μM引物,0.2
μLTaq酶(5U/μL)以及1μL15~30ng的模板。所用的10×bufer、MgCl2,dNTPs及Taq酶均购自上海生物工
程有限公司。ISSR的扩增条件为:95℃5min1个循环;94℃30s,52℃45s,72℃1min,40个循环;72℃10
min1个循环。扩增产物在浓度为3%的聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离、银染显色,利用SonyDSC-P5(Japan)照
相机拍照保存及分析。
2 结果与分析
2.1 ISSR扩增产物的多态性
分别以各组合的两个亲本为模板,对30个ISSR引物进行扩增,除
引物830外(各组合均不出带,可能是引物质量有问题),都能获得扩增
产物(数据未列出),但各组合中均存在少数几个引物扩增效果较差的
情况。另一方面,所筛选引物在两亲本间有多态性的比率达到95%以
上,但有些多态性条带的扩增较弱,不宜进一步用于后代鉴定。在两亲
本间能获得如此高的多态性,除了与ISSR标记本身的特点相关外,还
与两亲本间的亲缘关系较远有着密切的联系。
2.2 斑茅BC2杂种的鉴定
在各组合中选取3～5个BC2后代,对可扩增出亲本多态性且多态性条带较清晰的引物作进一步的筛选。
结果表明,少数引物在双亲中的多态性条带没有在子代中出现;有相当一部分引物其双亲中的多态性条带在
子代中出现了分离。而用来进行杂种鉴定的引物,有两种类型:其一,在父本和母本中分别扩增出各自的特征
带,并且在子代中同时具有父本和母本的特征带[4];其二,在父本中扩增出区别于母本的特征带,且在子代中
也具有父本的特征带。选择具有上述特点的引物,对164个BC2无性系的杂种真实性进行鉴定。鉴定结果见表
2。由表2可知,在所鉴定的164个无性系中,有160个是真正的杂种,其中的138个同时具有父母本的特征带
(参图1),另外22个仅具有父本的特征带(参图2),余下的4个无性系(来自组合1和8)在本研究中还不能确
定其杂种的真实性。从总体来看,在本研究中的大部分组合,仅用2个ISSR标记即可鉴定杂种的真实性,少数
组合甚至仅用1个标记即可。这说明利用ISSR标记进行甘蔗杂种真实性的鉴定是可行且相当有效的。
3 讨论
根据我们目前的了解,对甘蔗杂种真实性进行鉴定所利用的分子标记主要是RAPD和SSR标记 [4,5,7,12]。
另外,根据甘蔗ITS区的保守序列设计引物,用于杂种鉴定的也有报导[5,6,14]。但利用ISSR标记鉴定杂种真实
性,本研究还是首次报导。ISSR标记在引物设计上比SSR技术简单得多,不需要知道DNA的序列,又可以揭
示比RFLP、RAPD和SSR更多的多态性,而且比RAPD标记稳定,它融合了RAPD标记和SSR标记的优点,
具有很广泛的应用前景。
以往用同工酶鉴定斑茅后代杂种的研究表明,因酶带在后代中有分离现象,故通常是容易判断出真杂种
而难以排除假杂种,即当后代没有亲本的特征带时,并不能证明该个体不是真杂种[8-10]。这种现象在本研究
中也存在。但由于分子标记比可用的同工酶标记要多得多,故对于上述现象,可以通过增加标记的方法来解
决。在本研究中,即使在这种情况下,绝大多数组合所使用的标记也只需2个。这样无疑能节省大量的人力
和物力,更好地被甘蔗杂交生产所利用。
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 P1 P2 P1 P2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
2
世界各国的甘蔗育种者对斑茅的利用研究,已有120多年的历史,但研究工作一直停留在育成F1杂种
的水平上。其重要原因是:甘蔗与斑茅亲缘关系较远,杂交时亲和性很差,不易授粉成功,即使偶然授粉成功
获得F1,也因其生活力弱或可育性差而很难进一步利用。另外,只靠形态学特征来选择后代,可靠性差,很难
准确选到真正的斑茅后代[14]。广州甘蔗糖业研究所海南甘蔗育种场在斑茅利用方面做了大量的研究,并取
得了重大进展。于2001年育成了国际上首批经分子标记鉴定的斑茅BC1真杂种[10,12]。至今,又育成了BC2后
代。利用Cai等[12]所筛选到的2个SSR标记:mSSCIR21和mSSCIR33,对本研究所鉴定的160个斑茅BC2后
代进行鉴定,表明它们均含有斑茅的血缘(数据未列出)。这进一步说明了使用ISSR标记鉴定斑茅真杂种的
可靠性。毫无疑问,本研究所鉴定到的斑茅BC2真杂种,在今后必将成为甘蔗育种材料中的新鲜血液,为甘蔗
品种改良、提高甘蔗育种效率开创新的途径。
致谢:海南甘蔗育种场的符成,张垂民等5位同志提供甘蔗叶片样本,广州甘蔗糖业研究所生物中心的
陈仲华,杨湛端等同志参与了部分实验室工作。
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IdentificationofBC2ProgenyfromSaccharumoficinarum×Erianthus
arundinaceusbyISSRMarkers
CHENJian-wen1,JACKSONPhilipA.2,LAOFang-ye1,LIURui1,etal
(1.GuangzhouSugarcaneIndustryResearchInstitute/GuangdongKeyLabofSugarcaneImprovementandBiorefinery,Guangzhou
510316,China;2.CSIROPlantIndustry,DaviesLaboratory,UniversityDrive,Townsvile,Qld.4814,Australia)
Erianthusarundinaceus (Retz.)Jeswietisofgreatinterestasagermplasmsourcetosugarcane
breedersforitsgoodratoonability,tolerancetoenvironmentalstress,diseaseresistanceandvigor.Many
atemptswereperformedtointroducethesecharactersintomodernsugarcanecultivars,andgreatprogresshas
beenmade.Inthispaper,amicrosatelite-basedtechnique,viz.inter-simplesequencerepeat(ISSR),wasused
toidentifygenuinehybridsfromsomeputativeBC2clones,whichcomefromE.arundinaceus (Retz.)Jeswiet.
ThirtyISSRmarkerswerescreenedusingthetwoparentaltemplatesDNAineachcross.Themarkers,which
producedparentsspecificbandsoronlypaternal-specificband(s),wereusedtodetecttheputativeBC2clones.
Atotalof164putativeBC2clones,selectedfrom10crossesbetweensugarcanecultivars(Saccharumspp.)and
E.arundinaceus-derivedBC1progenies(designatedasYCE01series),weretested.Theresultsshowedthat160
genuinehybridswereidentifiedasE.arundinaceusdescendants,ofwhich138hybridshavebothparentsspecific
bands,andtherestjusthavethepaternal-specificband(s).Only4clones,derivedfrom2crosses,werenot
genuinehybridsinthepresentresearch.Asawhole,2ISSRmarkerswouldbeenoughtoidentifythegenuine
hybridsinmostcrosses,whileinothercrosses,fewer,evenonlyonemarker.ThisisthefirstverificationofBC2
progeniesfromE.arundinaceus×sugarcanecultivarswithISSRmarkers.Thisstudyshowedtheusefulnessof
ISSRmarkersformarker-assistedselectionoftruecrossprogenyintheconventionalcrossingprocedure.
Keywords:Erianthusarundinaceus;BC2;ISSR;Genuinehybrid
陈健文,等:应用ISSR标记鉴定斑茅BC2杂种真实性第1期
Abstract:
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