全 文 ：中国农学通报 2012,28(36):241-245
Chinese Agricultural Science Bulletin
基金项目：国家自然科学基金“东北地区羊耳蒜种群菌根真菌的多样性及与宿主植物的共生关系研究”(31100299)；高等学校博士学科点专项科研基
金“菌根真菌多样性变化与植物种群遗传多样性关系的研究”(20112103120016)；辽宁省教育厅科学研究一般项目“东北地区兰科野生植物菌根真菌
资源、分类与多样性研究”(L2011107)；沈阳农业大学青年教师科研基金“羊耳蒜种群遗传多样性与其菌根真菌的关系研究”(20101004)；中国博士后
科学基金“羊耳蒜菌根真菌的多样性及与宿主植物的共生关系研究”(2012M510835)。
第一作者简介：管俊杰，男，1986年生，辽宁大连人，硕士研究生，主要从事发育生物学方面的研究。通信地址：110866沈阳农业大学生物科学技术学
院，Tel：024-88487163，E-mail：guanzi.0820@qq.com。
通讯作者：陈旭辉，女，1981年生，河南荥阳人，讲师，硕士生导师，博士，主要从事种群生态学方面的研究。通信地址：110866沈阳农业大学生物科学
技术学院，Tel：024-88487163，E-mail：chenxh017@yahoo.com.cn。曲波，女，1972年生，辽宁朝阳人，副教授，硕士生导师，博士，主要从事入侵生物学
方面的研究。通信地址：110866沈阳农业大学生物科学技术学院，Tel：024-88487163，E-mail：qubo-@163.com。
收稿日期：2012-03-28，修回日期：2012-06-18。
羊耳蒜遗传多样性研究中AFLP反应
体系的建立与初步应用
管俊杰，丁 锐，李梦媛，段 茹，陈旭辉，曲 波，张立军
（沈阳农业大学生物科学技术学院，沈阳 110866）
摘 要：为研究羊耳蒜种质资源遗传多样性，建立并初步应用羊耳蒜AFLP反应体系。以羊耳蒜幼嫩叶
片为材料，采用常规SDS法提取基因组DNA，通过优化AFLP反应体系中的几个关键因素，建立适合羊
耳蒜的AFLP银染反应体系，并利用筛选出的引物组合对羊耳蒜的遗传多样性进行初步研究。经
EcoRⅠ和MseⅠ酶组合37℃酶切3 h后可将500 ng基因组DNA完全切开；酶切产物和接头经16℃连接
过夜后，用带有1个选择性碱基的预扩引物和带有3个选择性碱基的选扩引物分别进行扩增，扩增产物
经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染，能够得到清晰的扩增图谱。3对引物组合对8个羊耳蒜种群共
185个体的扩增共得到221条条带，其中多态性条带195条，多态性条带百分率为88.24%。本研究结果
表明建立的AFLP反应体系可用于羊耳蒜种质资源遗传多样性研究。
关键词：羊耳蒜；AFLP；遗传多样性；体系优化；银染
中图分类号：Q14 文献标志码：A 论文编号：2012-1169
Establishment and Primary Application of AFLP Analysis System
for Genetic Diversity Analysis of Liparis japonica
Guan Junjie, Ding Rui, Li Mengyuan, Duan Ru, Chen Xuhui, Qu Bo, Zhang Lijun
(College of Bioscience and Biotechnology, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866)
Abstract: To establish and apply of AFLP analysis system for genetic diversity analysis of Liparis japonica.
The genomic DNA in the fresh leaves of L. japonica was extracted using the traditional SDS method, and AFLP
silver-stained analysis system suitable for L. japonica was established by optimizing several main factors and
then applied for genetic diversity analysis of L. japonica populations in northeast China. 500 ng genomic DNA
was digested for 3 h with EcoRⅠ and MseⅠ restriction enzymes, ligated to adaptors for 12 h at 16 ℃ ,
pre-amplified using EcoRⅠ+1 and MseⅠ+1 primers and then amplified using EcoRⅠ+3 and MseⅠ+3
primers. The amplified products were resolved in denaturing ployacrylamide gels and stained with silver, and
then the clear ploymorphic fingerprints were obtained. AFLP analysis of 185 individuals of L. japonica using
three pairs of primers generated a total of 221 bands, of which 195 were polymorphic and the PPB value was
88.24%. The AFLP analysis system could be used in the research of genetic diversity of L. japonica species.
Key words: Liparis japonica; AFLP; genetic diversity; system optimization; sliver staining
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0 引言
兰科植物是生物多样性保护中备受关注的类群，
全世界所有野生兰科植物均被列入1973年制定的《野
生动植物濒危物种国际贸易公约》的保护范围，占该公
约应保护植物的 90%以上[1]。因此，开展对兰科植物
的研究和保育具有重要意义。作为一个特殊的植物
群，兰科植物具有复杂的生活史、与菌根真菌的共生
性、与昆虫高度协同进化的传粉系统和对生态环境的
高度敏感，因此要想制定有效的保育措施，就必须对其
生态生物学特征、繁育特征、传粉系统及种群结构等有
全面深刻的认识。
羊耳蒜(Liparis japonica)为兰科羊耳蒜属多年生
草本植物，主要分布于中国东北、河北、甘肃、四川、云
南、台湾等地以及日本、朝鲜、俄罗斯远东地区，生于柞
树林红松林下腐殖质厚的土壤中或林缘阴湿地[2]。羊
耳蒜作为兰科的球根花卉，具有较高的观赏价值和药
用价值，但由于其植株矮小，终生只具两片叶片，再加
上其生长、繁殖特性和对生长环境的特殊要求以及近
年来的人类干扰等原因，羊耳蒜野生资源丧失较为严
重。目前，国内外对羊耳蒜的研究主要集中在资源分
布、组织培养、化学成分、抗逆生理、共生真菌[2-7]等方
面，而利用分子生物学技术研究其种质资源遗传多样
性的报道较少[8]，从而限制了保育工作的顺利进行。
扩增片段长度多态性 (amplified fragment length
ploymorphism，AFLP)技术是 20世纪 90年代发展起来
的一种检测DNA序列多态性的分子标记技术[9]。该技
术具有DNA用量少、灵敏度高、多态性丰富、不受环境
影响、无需知道基因组序列信息、快速高效等优点，被
广泛应用于种质资源鉴定、遗传多样性研究和遗传连
锁图谱的构建等方面[10-11]。然而，该技术在羊耳蒜属植
物遗传多样性分析方面的研究尚未见报道。本研究以
羊耳蒜幼嫩叶片为实验材料提取基因组DNA，建立了
适合羊耳蒜的AFLP银染反应体系，并利用筛选出的
引物组合对分布于东北地区的羊耳蒜的遗传多样性进
行了初步分析，旨在为科学利用和合理保护现有的羊
耳蒜野生资源提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料
植物材料：选取分布于东北地区的 8个羊耳蒜不
同地理种群（表1）。于2011年6月采集各种群羊耳蒜
植株的幼嫩叶片，快速硅胶干燥保存。
主要试剂：EcoRⅠ酶、MseⅠ酶购自生工生物工程
（上海）有限公司；T4连接酶、TaqDNA聚合酶购自宝
生物工程（大连）有限公司；引物及接头均由生工生物
工程（上海）有限公司合成。其他相关试剂均为实验常
规药品。
表1 羊耳蒜种群取样样地的地理位置与生境特征
种群代码
DL1
DL2
GG
GMS
CBS
LTDZ
DQG
QS
采样地点
沈阳东陵公园
沈阳东陵公园
本溪高官
本溪关门山森林公园
吉林长白山
本溪老秃顶子自然保护区
阜新大清沟自然保护区
鞍山千山自然保护区
经度(E)
123°3439
123°3453
124°0232
124°0930
127°4755
124°5356
122°1203
123°0748
纬度(N)
41°4953
41°5032
41°2019
41°0741
42°3035
41°1809
42°4355
41°0121
海拔/m
81
85
274
438
741
817
194
163
森林类型
针阔混交林
针阔混交林
针阔混交林
阔叶林
针阔混交林
针叶林
阔叶林
针阔混交林
1.2 方法
1.2.1 基因组DNA的提取及质量检测 以羊耳蒜幼嫩
叶片为材料，按照常规SDS法[12]提取其基因组DNA。
分别用 0.8%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度仪检测
其浓度和纯度。
1.2.2 模板DNA的双酶切与连接 采用 EcoRⅠ酶和
MseⅠ酶组合对提取出的基因组DNA进行双酶切，并
与EcoRⅠ和MseⅠ接头连接，分步完成模板DNA的
酶切-连接反应。其中酶切反应体系如下：DNA模板
(250 ng/μL) 2 μL，10 ×酶切缓冲液 1.5 μL，EcoRⅠ
(10 U/μL) 0.25 μL，MseⅠ(10 U/μL)0.25 μL，加灭菌双
蒸水至总体积为 15 μL，混匀，37℃酶切后 70℃水浴
10 min灭去酶活性。取 5 μL双酶切产物用 0.8%琼脂
糖凝胶电泳检测，分别考察酶切1、2、3、4、5、6 h的酶切
效果并选定合适的酶切时间。选择充分酶切的产物进
行连接反应，连接反应体系为：DNA酶切产物5 μL，E-
接头(5 μmol/L) 0.5 μL，M-接头(50 μmol/L) 0.5 μL，T4
连接酶(3 U/μL) 0.2 μL，10×连接缓冲液 1 μL，加灭菌
双蒸水至总体积为10 μL，混匀，16℃过夜。
1.2.3 预扩增 预扩增反应体系总体积为 20 μL，其中
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管俊杰等：羊耳蒜遗传多样性研究中AFLP反应体系的建立与初步应用
包括DNA酶切-连接产物1 μL，10 × PCR缓冲液2 μL，
dNTP (10 mmol/L) 0.4 μL，E00引物(10 μmol/L) 2 μL，
M00引物(10 μmol/L) 2 μL，Taq DNA聚合酶(5 U/μL)
0.1 μL，灭菌双蒸水12.5 μL。PCR扩增程序为：94℃预
变性 5 min；94℃变性 30 s，56℃退火 1 min，72℃延伸
1 min，共 25个循环；4℃保存。扩增反应结束后，取
5 μL产物在 1.5%琼脂糖凝胶上检测扩增效果。取
5 μL预扩增产物用灭菌双蒸水稀释 40倍，混匀后
于-20℃保存，用于选择性扩增。
1.2.4 选择性扩增 选择性扩增反应体系总体积为
20 μL，其中包括DNA预扩增产物的1/40稀释液1 μL，
10×PCR缓冲液 2 μL，dNTP (10 mmol/L) 0.4 μL，Taq
DNA 聚合酶 (5 U/μL) 0.1 μL，E-引物 (10 μmol/L)
0.8 μL，M-引物 (10 μmol/L) 0.8 μL，双蒸水 14.9 μL。
PCR 扩增程序为：94℃ 5 min；94℃ 30 s，65℃ 30 s
(touch down 0.7℃/cycles)，72℃ 1 min，12个循环；94℃
30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，共23个循环；4℃保存。
1.2.5 扩增产物的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 取 5 μL
选择性扩增产物与等体积的变性胶上样缓冲液（100%
去离子甲酰胺，10 mmol/L EDTA，0.1%溴酚蓝，0.1%二
甲苯青）混合，95℃变性 5 min后立即放入冰盒内以防
复性，用 6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。配制 6%
聚丙烯酰胺凝胶 60 mL，加入 10%的 APS 200 μL和
TEMED 40 μL制板。凝胶聚合后，恒功率 50 W预电
泳 30 min。预电泳结束后，加入变性DNA样品 5 μL，
50 W恒功率下电泳2 h左右，直到二甲苯青跑到2/3胶
长处，停止电泳。
1.2.6 银染 电泳结束后，将玻璃板小心分开，把贴有胶
的长玻璃板放入 1 L 10%冰醋酸溶液中摇晃固定
30 min直至染料线消失。用去离子水洗涤 3次，每次
3 min，然后放入1 L 0.12%的硝酸银溶液中（含1.5 mL
甲醛）摇晃染色 30 min。用去离子水短时漂洗不超过
5 s后，迅速放入预冷过的新鲜配制的碳酸钠显影液中
显影，至大部分条带清晰可辨时用 10%的冰醋酸溶液
固定1 min。最后再用去离子水漂洗2次，室温晾干拍
照。
1.2.7 羊耳蒜不同地理种群的AFLP遗传多样性分析
利用建立的AFLP反应体系及筛选出的引物组合对分
布于中国东北地区的8个羊耳蒜种群进行遗传多样性
研究。以100 bp DNA ladderⅡ为标准分子量确定扩增
片段的分子量大小，对同一个体在各位点上的扩增结
果进行记录，有带记为“1”，无带记为“0”，数据形成0/1
矩阵后输入计算机。利用POPGENE软件计算多态性
条带数和多态性条带百分率。
2 结果与分析
2.1 基因组DNA的提取
用传统的SDS法提取羊耳蒜叶片基因组DNA，经
紫外分光光度仪检测，OD260/OD280在 1.6~2.0之间，经
0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性的结果显示（图
1），基因组DNA条带清晰，无拖尾现象，纯度和质量均
较高，符合AFLP分析的要求。
2.2 不同酶切时间的比较
本实验采用EcoRⅠ酶和MseⅠ酶组合对基因组
DNA进行双酶切，考察酶切 1、2、3、4、5、6 h的酶切效
果。结果显示，在该酶切体系下酶切超过3 h以上时，
均能得到 100~1000 bp左右的酶切片段，分布均匀且
呈明显的“smear”状，表明酶切已充分。酶切时间延长
的效果与酶切3 h无明显差别。因此，将最佳酶切时间
确定为3 h。
2.3 选择性扩增引物的筛选
通过对8条EcoRⅠ酶切位点接头选择性引物和8
条MseⅠ酶切位点接头选择性引物组合成的 64对引
物进行筛选，其中3对引物组合能扩增出清晰、稳定且
多态性较高的条带，扩增产物分子量在100~600 bp之
间（图2）。
2.4 羊耳蒜不同地理种群AFLP遗传多样性分析
用筛选出的 3对引物组合对 8个羊耳蒜种群共
185个植株进行扩增，共产生221条扩增条带，其中195
条为多态性条带，占扩增总条带数的 88.24%。3对引
物组合扩增出的多态性条带范围从 63~68条，平均每
对引物为65条（表2）。羊耳蒜种群内多态位点百分率
的范围从 15.38%~75.57%，平均 48.42%，种水平上的
多态位点百分率为88.24%（表3）。
1~6分别为LTDZ种群羊耳蒜不同个体基因组DNA；
7为Marker DL5000
图1 羊耳蒜基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图
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3 讨论与结论
本研究对适合羊耳蒜基因组DNA的AFLP反应
体系进行摸索，通过对酶切时间、预扩增模板浓度、选
择性扩增模板浓度进行优化试验，建立了分辨率高、重
复性好的羊耳蒜AFLP银染技术体系，即 500 ng DNA
经EcoRⅠ和MseⅠ酶组合 37℃酶切 3 h后灭活；酶切
产物 16℃连接过夜(≥12 h)；扩增反应中，以 1 μL连接
产物作为预扩增模板，预扩增产物稀释40倍作为选择
性扩增模板。用筛选出的引物组合对东北地区羊耳蒜
不同地理种群植株进行DNA扩增，在种群及种水平均
呈现十分丰富的多态性，能够进一步用于羊耳蒜遗传
多样性研究。
尽管AFLP技术在20世纪90年代已经发展起来，
但由于其反应流程较多，需要经过DNA提取、酶切、连
接、预扩增、选择性扩增、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、银
染等步骤，涉及因素较多，且不同植物的反应体系也有
差异，因此需要对反应体系的各关键因素进行优
化[13-15]。以往的研究表明模板DNA的质量是最基本的
要求，会直接影响酶切、连接的效果等。高质量的植物
基因组DNA的提取方法常用的有CTAB法、SDS法或
试剂盒提取法，人们可以针对不同的植物材料选择合
适的方法并加以改良[16-18]。羊耳蒜叶片组织中的多糖
1~18为用引物组合E-AAG/M-CAC对GMS种群的18份样品的扩增结果；
19~42为用引物组合E-AAG/M-CAC对GG种群的24份样品的扩增结果
图2 羊耳蒜选择性扩增图谱
引物组合
E-AGG/M-CTA
E-AAC/M-CAC
E-AAG/M-CAC
总计
平均
扩增
总条带数
75
67
79
221
77
多态性
条带数
63
64
68
195
65
多态性条带
百分率/%
84
95.52
86.08
88.24
88.53
表2 3对引物组合对羊耳蒜种群的AFLP扩增结果
表3 利用3对引物对8个羊耳蒜种群及种水平的
遗传多样性统计结果
种群
DL1
DL2
GG
GMS
CBS
LTDZ
DQG
QS
平均
种水平
样品数
22
29
30
18
10
24
26
26
23.13
185
多态位点百分数
109
145
167
76
34
64
107
154
107
195
多态位点百分率/%
49.32
65.61
75.57
34.39
15.38
28.96
48.42
69.68
48.42
88.24
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管俊杰等：羊耳蒜遗传多样性研究中AFLP反应体系的建立与初步应用
和酚类物质含量不高，因此本研究选择羊耳蒜植株的
幼嫩叶片，采用常规SDS提取方法，已能获得纯度高、
符合AFLP要求的基因组DNA。
模板DNA的酶切也是AFLP反应成功的关键，酶
切必须彻底，才能得到分子量相对集中且数量较多的
预扩增产物。不同植物基因组DNA大小不同，为了保
证酶切充分，有必要针对不同的植物材料对酶切时间
进行梯度检测，以保证扩增结果的真实性。对羊耳蒜
来说，本研究所建立的酶切-连接体系可以得到较好的
扩增结果。
AFLP的预扩增反应既可以检测酶切-连接效果的
好坏，又是选择性扩增成功的前提。预扩增的目的是
为选择性扩增提供足够的模板DNA，同时对模板进行
选择性纯化[9]。一般来说，若预扩增产物的分子量分
布在50~600 bp之间，量多且样品之间的一致性较好，
则说明预扩增效果好，可以进入下一步实验。在进行
选择性扩增时，应注意对预扩增产物进行适当稀释，否
则会因为模板浓度过高而不能得到清晰的谱带。本研
究中选择稀释40倍的预扩增产物进行选择性扩增，扩
增结果稳定，能够获得分辨率高的清晰条带。
凝胶检测手段和染色技术的完善对实验结果的优
劣也有重要影响。AFLP扩增结果需要通过聚丙烯酰
胺凝胶电泳进行检测，因此制备高质量的胶板非常关
键。其中玻璃板是否清洗干净、凝胶的聚合是否充分、
硅烷的涂抹是否均匀等因素均会影响实验的顺利进
行。此外，为了避免泳道染色过深，在上样前应充分吹
打点样孔以除去孔中的杂质和残存尿素。银染过程中
则应严格控制时间，以防止条带染色太深或太浅而难
以辨认。
AFLP分子标记技术以其重复性好、多态性强、可
靠性高、不需知道基因组DNA的序列信息等优点已被
广泛应用于生物基因组研究的各个方面。羊耳蒜具有
较高的观赏价值，同时也是一种珍稀濒危兰科植物，开
展其相关分子生物学研究，能为种质资源的有效利用
和保护提供科学依据和基础，但是在其基因组DNA序
列信息未知，分子遗传背景了解不足的条件下，AFLP
分子标记技术具有极大的应用前景和优势。实验证
明，利用优化好的AFLP反应体系对东北地区羊耳蒜
不同地理种群的遗传多样性进行初步分析，能够得到
较为丰富的多态性条带，这为羊耳蒜野生种质资源的
科学利用和合理保护奠定了基础。
参考文献
[1] 罗毅波,贾建生,王春玲.中国兰科植物保育的现状和展望[J].生物
多样性,2003,11(1):70-77.
[2] 中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志[M].北京:科学
出版社,1992,18:62-64.
[3] 齐佳,岳桦,王莹.羊耳蒜对土壤自然干旱胁迫的响应[J].江西农业
学报,2009,21(3): 83-85.
[4] 纪春艳.北方羊耳蒜的组织培养与植株再生[J].植物生理学通讯,
2008,44(2):288.
[5] 纪春艳,李强,秦玉芳.北方羊耳蒜形态解剖学研究[J].林业科技,
2009,34(5):64-65.
[6] 张淑梅,王云锁,李东良,等.曲唇羊耳蒜在中国东北分布的真实性
研究[J].植物研究, 2009,29(1):118-119.
[7] McCormick M K, Whigham D F, O’Neill J. Mycorrhizal diversity
in photosynthetic terrestrial orchids[J]. New Phytologist, 2004,163:
425-438.
[8] Chung M Y, Nason J D, Chung M G. Patterns of hybridization and
population genetic structure in the terrestrial orchids Liparis
kumokiri and Liparis makinoana (Orchidaceae) in sympatric
populations[J]. Molecular Ecology, 2005,14:4389-4402.
[9] 周延清.DNA分子标记技术在植物研究中的应用[M].北京:化学
工业出版社, 2005:111-114.
[10] Vos P, Hogers R, Blecker M, et al. AFLP: a new technique for DNA
fingerprinting[J]. Nucleic Acids Research, 1995, 23(21):4407-4414.
[11] Nybom H. Comparison of different nuclear DNA markers for
estimating intraspecific genetic diversity in plants[J]. Molecular
Ecology, 2004,13:1143-1155.
[12] 顾红雅,瞿礼嘉.植物分子生物学实验手册[M].北京:高等教育出
版社,1998:3-12.
[13] 陈旭辉,高玉葆,朱敏杰,等.小叶锦鸡儿基因组 DNA的提取及
AFLP反应体系的建立[J].植物研究, 2009,29(5):529-533.
[14] 王喆,张铮,褚会娟,等.三叶木通AFLP反应体系的建立及优化[J].
中草药,2010,41(12):2074-2078.
[15] 苏军虎,张艳萍,娄忠玉,等.甘肃金鳟AFLP体系建立及应用[J].中
国农学通报, 2011,27(7):400-404.
[16] Chen X H, Gao Y B, Zhao N X, et al. An AFLP analysis of genetic
diversity and structure of Caragana microphylla populations in
Inner Mongolia steppe, China[J]. Biochemical Systematics and
Ecology, 2009,37:395-401.
[17] Cai X Y, Feng Z Y, Zhang X X, et al. Genetic diversity and
population structure of an endangered Orchid (Dendrobium
loddigesii Rolfe) from China revealed by SRAP markers[J].
Scientia Horticulturae, 2011,129:877-881.
[18] George S, Sharma J, Yadon V L. Genetic diversity of the
endangered and narrow endemic Piperia yadonii (Orchidaceae)
assessed with ISSR polymorphisms[J]. American Journal of Botany,
2009,96(11):2022-2030.
·· 245