全 文 ：文章编号:1001 － 4829(2015)04 － 1535 － 07 DOI:10． 16213 / j． cnki． scjas． 2015． 04． 024
收稿日期:2015 － 07 － 22
基金项目:中央公益性科研基本业务费项目(ITBB120504 和 IT-
BB140103)
作者简介:刘 洋(1980 －)，男，博士，主要从事甘蔗分子育种
研究，Email:lyfull@ 163． com。
斑茅过氧化氢酶基因(EaCAT-1a)克隆与序列分析
刘 洋1，姚艳丽1，胡小文1，徐 磊1，邢淑莲1，张树珍2
(1．中国热带农业科学院湛江实验站 /热带旱作农业研究中心，广东 湛江 524000;2．中国热带农业科学院热带生物技术研究所 /
甘蔗研究中心，海南 海口 571101)
摘 要:斑茅是栽培种甘蔗最重要的近缘物种之一，具有抗逆性强等特点。本文以高粱过氧化氢酶基因(NCBI 登录号为 XM
002437586． 1)cDNA序列为探针，对甘蔗属 EST数据库进行同源检索、筛选和拼接，后经基因组 PCＲ、分子克隆、序列分析验证成功
分离了 1 个斑茅过氧化氢酶基因 DNA序列(EaCAT-1a，GenBank登录号为 KF864223)。该序列全长 3831 bp，包含 8 个外显子和 7
个内含子，cDNA序列长为 1532 bp，包含 10 bp的 5’非翻译区(UTＲ)和 43 bp 的 3’UTＲ，以及一个 1479 bp 的开放读码框，编码
492 个氨基酸，此蛋白序列具有过氧化氢酶保守结构域，属于 CAT家族。将推测的 EaCAT-1a 蛋白序列与高粱、水稻、玉米等物种
进行同源进化分析，均表现出较高的保守性。
关键词:斑茅;过氧化氢酶;基因克隆;同源进化分析
中图分类号:S566． 1 文献标识码:A
Isolation and Characterization of Catalase Gene(EaCAT-1a)
in Erianthus arundinaceus(Ｒetz．)Jesw．
LIU Yang1，YAO Yan-li1，HU Xiao-wen1，XU Lei1，XING Shu-lian1，ZHANG Shu-zhen2
(1． Zhanjiang Experiment Station / Tropical Dry Farming Ｒesearch Center，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Guangdong
Zhanjiang 524000，China;2． Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology /Sugarcane Ｒesearch Center，Chinese Academy of Tropical
Agricultural Science，Hainan Haikou 571101，China)
Abstract:Erianthus arundinaceus(Ｒetz．)Jesw． is one of the most important species of sugarcane related species，and with strong resist-
ance． In this paper，one novel full-length catalase gene(EaCAT-1a，GenBank Accession number KF864223)DNA sequence was cloned by
blasting the Saccharum L． EST database using sorghum CAT gene(GenBank Accession number XM 002437586． 1)cDNA sequence as a
querying probe． EaCAT-1a was 3831 bp，containing 8 exons and 7 introns，length of cDNA was 1532 bp，containing 10 bp of 5 untranslat-
ed region(UTＲ)and 43 bp of the 3UTＲ，and a 1479 bp open reading frame encoding a 492 amino acid sequence of the protein which has
a conserved domain of catalase belonging CAT family． The putative EaCAT-1a protein sequence was very homologous with sorghum，rice，
maize and other species，and have shown a high conservatism by homologous evolutionary analysis．
Key words:Erianthus arundinaceus L．;Catalase;Clone;PCＲ;EST database
甘蔗(Saccharum officinarum L．)是世界上重要
的糖料和能源作物，也是我国种植面积最大的热带
作物。我国甘蔗大多种植在没有灌溉条件的山坡和
丘陵地，容易受到旱灾的影响［1］。因此，培育耐旱
的甘蔗品种，特别是利用现有技术挖掘抗旱基因已
成为目前迫切需要解决的问题。斑茅(Erianthus
arundinaceus)是甘蔗属近缘野生种之一［2］，为禾本
科蜀黍族蔗茅属、多年生、高大、丛生草本，具有分布
区域广、耐干旱、耐贫瘠和分蘖能力强等优良特
性［3］。目前，斑茅和甘蔗、割手密等已成功杂交，因
此被认为是最有潜力的甘蔗育种材料之一［4 ～ 6］。因
此，进一步挖掘斑茅的优异基因资源，从而利用生物
技术手段提高甘蔗的抗逆性具有重要的意义和应用
价值。
过氧化氢酶(Catalases，CAT )广泛存在于动
物、植物和微生物体内，属于末端氧化酶类。它通过
催化电子的转移，将 H2O2(过氧化氢)分解为 H2O
和 O2(水和氧气)，从而有效清除植物光呼吸、线粒
5351
2015 年 28 卷 4 期
Vol. 28 No. 4
西 南 农 业 学 报
Southwest China Journal of Agricultural Sciences
表 1 2 个基因克隆所用引物信息
Table 1 Two primer sets information used for cloning
引物名称
Primer name
引物序列(5’-3’)
Primer sequence(5 -3)
扩增区域
Amplified region
PCＲ片段大小(bp)
PCＲ fragment size
C1 正向:AGGCGTCTGCTCTCTGCTCC
反向:ATAGGCGTAACAACCATTCT 98 ～ 4040 3943
C2 正向:ACCGGCAGCCATGGATCCG
反向:CTGTATCCTCGGACACCGGC 158 ～ 3988 3831
注:扩增区域大小以假定的割手密 CAT基因克隆参考序列大小计算。
Note:Amplified region was counted from the cDNA sequence of SsCAT-1c．
体电子传递等过程中产生的 H2O2，在植物防御、应
答胁迫、细胞氧化还原平衡的控制以及延缓衰老等
方面起着重要作用［7 ～ 8］。在植物体内，CAT 家族由
多基因编码，所编码蛋白主要分布在过氧化物酶体、
乙醛酸循环体和细胞质中，少数分在线粒体内。
CAT 基因的表达受干旱、低温、光照、高盐、重金属
等非生物因子的诱导，并随时空的变化出现不同的
表达模式［9 ～ 10］。
目前，对甘蔗 CAT 基因研究已有报道，陈珊珊
等(2012)利用同源克隆技术成功分离了 1 个甘蔗
CAT基因 cDNA 序列［11］。但是，对斑茅 CAT 基因
的研究还未见报道。因此，本研究利用同源克隆技
术克隆斑茅 CAT 基因，并对其进行生物信息学分
析，希望此结果能对今后深入了解甘蔗及其近缘材
料 CAT基因家族的信息提供帮助，从而为进一步通
过生物技术改良甘蔗品种抗逆性提供理论依据。
1 材料与方法
1． 1 植物材料
供试材料斑茅 Er-26，为本研究团队采集并经过
鉴定的材料［12］。2013 年 5 月在中国热带农业科学
院湛江实验站试验基地种植，采用盆栽实验，常规管
理，保证良好的水肥条件。正常出苗后 2 个月，用剪
刀剪下幼嫩的无损伤叶片，放入液氮中带回，保存于
－ 70 ℃冰箱中，用于总 DNA的提取。
1． 2 总 DNA的提取
总 DNA提取参考天跟生化(北京)公司的植物
总 DNA提取试剂盒进行，DNA保存与 － 70 ℃冰箱。
1． 3 基因克隆策略
以高粱 CAT 基因(XM 002437586． 1)cDNA 序
列为探针，对 NCBI 中的甘蔗属 EST 库进行 BLAST
检索，筛选出与高粱 CAT 基因相似性较高的甘蔗
EST序列。然后进一步筛选，将能覆盖整个编码区
的序列进行拼接，获得假定的斑茅 CAT基因克隆参
考序列。根据获得的参考序列，设计 2 对巢式引物，
包含起始和终止密码子。经过 PCＲ、克隆测序后利
用 DNASTAＲ 6． 0 软件进行分析，最后获得完整的斑
茅 CAT基因序列。
1． 4 引物设计与合成
根据假定的斑茅 CAT 基因克隆参考序列设计
合成 2 对特异引物(表 2)，引物由英潍捷基(上海)
贸易有限公司合成。C1 用于第 1 轮 PCＲ 扩增，C2
用于第 2 轮 PCＲ扩增。
1． 5 PCＲ扩增与克隆
以供试斑茅基因组 DNA为模板扩增特异片段。
C1 和 C2 所用 PCＲ程序为 94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，
60 ℃ 30 s，72 ℃ 120 s，共 30 个循环，72 ℃ 10 min，
4 ℃保存。取 5 μl PCＲ产物加 1μl 上样缓冲液进行
1 %琼脂糖凝胶电泳，后将凝胶放入凝胶成像系统
中进行分析。PCＲ 产物回收与克隆参照试剂盒的
说明书进行，挑选 2 个阳性克隆送到英骏(广州)生
物技术公司测序部进行测序。DNA 聚合酶采用
TAKALA(日本)公司的Mix Taq;DNA Marker、dNTPs
和 DNA纯化试剂盒均购自天根生化(北京)科技公
司;克隆试剂盒采用全式金(北京)公司的 pEASY-
T5 Zero Cloning Kit。
1． 6 数据分析
利用 DNASTAＲ 6． 0 软件进行序列比对、蛋白预
测和同源进化分析，制作系统发育树。利用 DNA-
MAN 7． 0 软件制作基因结构图。登陆 NCBI 网站
(http:/ /www． ncbi． nlm． nih． gov /)，对获得的基因序
列和推测的蛋白序列进行 Blast 检索分析。利用
Protparam 软件在线分析氨基酸残基性质、分子式、
分子量和等电点(PI)等理化性质;ProtScale 软件在
线分析蛋白质的疏水性;Interpro在线分析软件预测
信号肽和跨膜区;将推测的蛋白序列在 SWISS-
MODEL数据库(http:/ / swissmodel． expasy． org)中进
行蛋白功能和三级结构预测。
2 结果与分析
2． 1 以高粱 CAT基因为探针检索甘蔗 EST数据库
登陆 NCBI(http:/ /www． ncbi． nlm． nih． gov /)网
站，以高粱 CAT基因 cDNA序列(XM 002437586． 1)
为探针，对甘蔗属(Saccharum L．)EST数据库检索，
6351 西 南 农 业 学 报 28 卷
表 2 筛选出的 5 条甘蔗 EST序列特征
Table 2 Characterization of five sugarcane ESTs
GenBank登录号
GenBank
片段大小(bp)
Accession
位置
Number
相似性(%)
Fragment
期望值(E)
Size
CN606452． 1 405 37 ～ 441 92 6e － 163
CA160849． 1 711 143 ～ 842 96 0
CN606452． 1 801 529 ～ 1325 96 0
CA131322． 1 886 873 ～ 1768 94 0
CN606452． 1 692 1385 ～ 2072 91 0
图 1 利用高粱 CAT cDNA序列检索出的 5 条甘蔗 EST序列
Fig． 1 Five sugarcane ESTs with the sorghum CAT gene cDNA sequence as a probe
检索出多条甘蔗 CAT 相关的 EST 序列。其中 5 条
序列与高粱 CAT 基因 cDNA 序列相比都具有很高
的相似性(表 1)，且包含 CAT 基因的完整编码区
(图 1)。将这 5 条序列进行拼接，得到 1 条长度为
2047bp的序列，这条假定的 CAT基因序列作为斑茅
CAT基因克隆引物设计的参考序列。
2． 2 EaCAT-1a PCＲ验证与序列结构特征
对斑茅叶片总 DNA进行提取和凝胶电泳检测，
DNA质量可靠，可用于基因克隆。利用设计的 2 对
引物 C1 和 C2(表 1)，以斑茅 DNA为模版进行 PCＲ
扩增，第二轮 PCＲ 扩增结果出现单一条带，大小分
别约为 3800 bp(图 2)。将 C2 PCＲ 产物回收、克隆
并测序，得到 1 条 DNA 序列信息，最后将得到的序
列信息与 NCBI 网站进行比对，获得 1 条具有起始
和终止密码子的完整 DNA序列，命名为 EaCAT-1a，
将这条序列提交 Genbank 数据库，获得登录号为
KF864223。
EaCAT-1a全长均为 3 831 bp，包含 8 个外显子
和 7 个内含子，与高粱等基因组 DNA 比对，与高粱
CAT基因结构类似(图 3)。NCBI上 Blast的结果也
M 1
3800 bp
M:Marker，500 bp DNA ladder
泳道 1 为 C2 引物扩增产物(引物信息详见表 1)
Line 1 is PCＲ fragments amplified with C2 prime sets(information a-
bout primers see table 1)
图 2 斑茅 CAT基因 PCＲ产物
F ig． 2 PCＲ fragments amplified with C2 prime sets on a 1 % agrose gel
表明，EaCAT-1a与高粱 CAT序列相似性达 99 %(E
= 0． 0)。
EaCAT-1a cDNA序列长为 1532 bp，包含 10 bp
的 5’非翻译区(UTＲ)和 43 bp的 3’UTＲ，以及一个
1479 bp的开放读码框，编码 492 个氨基酸(图 4)。
黑色剪头表示外显子
The black arrow was exon
图 3 EaCAT-1a基因结构
Fig． 3 DNA structure of EaCAT-1a gene
73514 期 刘 洋等:斑茅过氧化氢酶基因(EaCAT-1a)克隆与序列分析
图 4 斑茅 EaCAT-1a cDNA序列及编码蛋白
Fig． 4 cDNA and protein sequence of EaCAT-1a
2． 3 蛋白理化性质、结构及功能预测
该蛋白质的分子式为 C2545H3857N719O721 S20，预测
分子量为 56． 7 kD，等电点为 6． 71;包含 20 种常见
氨基酸，含量最高的为天冬氨酸和亮氨酸(7． 3 %)，
最低的是 Cys和 Trp(0． 7 %);含 60 个负电荷残基，
56 个正电荷残基，水溶液在 280 nm 处的消光系数
为 70 860(假设所有的 Cys 残基对均来自半胱氨
酸);不稳定指数为 30． 56，说明该蛋白稳定;平均亲
水系数为 － 0． 517。
该蛋白中第 375 位亲水性最强，得分为 － 2． 433
(分值越低亲水性越强;分值越高疏水性越强)，第
326 位疏水性最强，得分为 2． 889，整个肽链表现为
亲水性(图 5)。经分析表明，该蛋白不存在信号肽，
属于非分泌蛋白，也不存在跨膜结构(图 6)。
8351 西 南 农 业 学 报 28 卷
32
1
0
-1
-2
-3
Sc
or
e
50 100 150 200 250 300 350 400 450
Position
图 5 斑茅 EaCAT-1a基因编码蛋白疏水性分析
Fig． 5 Hydrophobicity analysis of EaCAT-1a gene encoding protein
Sc
or
e
Position
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0 10 20 30 40 50 60 70
C-score
S-score
Y-score
Signal P.4.1 prediction(euk networks):CAT
图 6 斑茅 EaCAT-1a基因编码蛋白跨膜区预测
Fig． 6 Trans-membrane region prediction of EaCAT-1a gene enco-
ding protein
将 EaCAT-1a 编码蛋白与 SWISS-MODEL 数据
库(http:/ / swissmodel． expasy． org)进行蛋白功能和
三级结构预测。结果表明，EaCAT-1a 蛋白序列与数
据库目标蛋白 2j2m． 1． A匹配的氨基酸范围为 15 ～
488，序列相似度分别为 49． 16 %，期望值为 0．
00e －1，QMEAN4 值分别为 － 4． 86，三级结构如图 7
所示。将这个蛋白序列在 NCBI 上进行 BLASTP 检
索和结构功能预测分析，发现此蛋白包含 1 个血红
素结合的过氧化氢酶保守结构域(16 ～ 486 个氨基
酸)(图 8)。因此推测此蛋白具有分解过氧化氢的
功能。
2． 4 CAT蛋白进化分析
将 EaCAT-1a编码蛋白序列在 NCBI网站上进
图 7 EaCAT-1a编码蛋白三级结构分析
Fig． 7 Tertiary structure analysis of encoded protein by EaCAT-1a
行 BLASTP 检索，结果表明其与高粱、玉米、水稻等
物种的 CAT 蛋白具有较高的同源性(83 % ～ 98
%)。系统发育树的结果表明，斑茅 CAT 蛋白与高
粱亲缘关系最近，而与辣椒、拟南芥、桃树等作物亲
缘关系较远。对现有的 35 个物种的 CAT 蛋白进行
分类比较，可以分为 A和 B2 个类群，斑茅 CAT蛋白
属于 B类群(图 9)。
3 讨 论
同源克隆相比具有快速、高效等特点，但对该基
因的信息量和准确性要求较高。高粱与甘蔗具有很
近的亲缘关系［13］，可以利用高粱 CAT 基因为本实
验提供信息。本实验以高粱 CAT 基因 cDNA 序列
为探针，在甘蔗属 EST 库中找到了 5 条与此基因相
似性很高的甘蔗 EST 序列。假设这些 EST 片段为
甘蔗 CAT基因的 EST片段，并根据这些片段设计引
物。这与传统的同源克隆不同，传统的同源克隆是
根据亲缘关系较近的物种的 DNA 序列直接设计引
物，但如果设计的引物中存在 SNP 或者 DNA 差异，
那么很难得到理想的结果。本实验是则是根据该物
种本身的 EST 设计引物，大大提高了准确性。如果
检索到的 EST片段能拼接成为一个完整的序列，并
包含了甘蔗 CAT基因的编码框，那么可以先假定这
个序列为甘蔗 CAT基因 DNA全序列，然后再进行
图 8 EaCAT-1a 编码蛋白保守结构域分析
Fig． 8 Size and location of conserved protein domains encoded by EaCAT-1a
93514 期 刘 洋等:斑茅过氧化氢酶基因(EaCAT-1a)克隆与序列分析
图 9 主要物种 CAT蛋白系统发育树
Fig． 9 Phylogenetic tree of the protein encoded by EaCAT-1a and other species
PCＲ验证。要想获得准确的结果，必须选择与高粱
相似性非常高的 EST序列。本实验选择的甘蔗 EST
序列与高粱的 CAT 基因同源性都在 90 %以上，且
恰好能拼接成一个完整序列，这就保证了后续实验
的可靠性。然后再与高粱 CAT 以及其他物种的
CAT基因进行了逐个比对，并根据内含子的结构特
点推测斑茅 CAT 基因 DNA 序列中外显子的位置，
后根据外显子的位置设计引物，保证设计的每条引
物都处在一个完整的外显子内。实践证明，只要实
验设计准确，利用此方法克隆基因是完全可行的。
生物在面临自然选择压力时，其基因在许多物
种中往往是保守的，且多以家族的形式存在［14］。迄
今为止的研究表明，CAT 也是一类大的家族，几乎
存在与所有需氧微生物、动物和植物体内。Zmocky
and Koller(1999)按照结构和序列水平的异同将
CAT 划分为 3 个亚群，即单功能 CAT(Mono-func-
tional catalase)、双功能 CAT(Catalase-peroxidase，
CAT-POD)和锰 CAT(Mn-catalase)［15］。按照催化
中心结构差异 CAT 可分为两类:①含铁卟啉结构的
CAT，又称铁卟啉酶(Fe-CAT);②含锰离子结构的
CAT，又称锰过氧化氢酶(Mn-CAT)［16］。现有的研
究表明，生物体内的 CAT 绝大多数都属于 Fe-CAT，
0451 西 南 农 业 学 报 28 卷
而 Mn-CAT 只在少数生物体内存在。根据比较发
现，本研究获得的 EaCAT-1a属于 Fe-CAT家族。
过氧化氢酶是在原核生物和真核生物中普遍存
在的一种酶。它主要作用是催化 H2O2 分解为 H2O
和 O2，也可利用 H2O2 来氧化各种基质，如醇或酚。
过氧化氢酶一般包含有一个相对小亚基(55 ～ 69
kDa)，并结合一个血红素 IX(血红素 b)基团，从而
形成四聚体复合物［17］。在真核细胞中，过氧化氢酶
存在于过氧化物酶体。本研究获得的 EaCAT-1a 序
列经过蛋白的结构和功能预测，推测该蛋白可与血
红素相结合，具有催化 H2O2 分解的能力。现有的
研究表明，过氧化氢酶与植物的抗逆性关系密切，受
到光照、温度以及细胞分裂素、水杨酸和二氧化硫的
诱导［18］，因此初步判断 EaCAT-1a 编码的蛋白应该
是诱导表达的，但是有关此基因的表达模式以及分
子生物学功能仍然需要更加深入的了解。
致 谢:感谢中国热带农业科学院生物技术研究所
给予的经费支持，感谢中国热带农业科学院湛江实
验站提供本实验所需的科研条件，感谢在本研究中
给予帮助和关心的各位老师和工作人员!
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(责任编辑 李 洁)
14514 期 刘 洋等:斑茅过氧化氢酶基因(EaCAT-1a)克隆与序列分析