全 文 ：中国农业科学 2011,44(8):1533-1542
Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2011.08.001

收稿日期：2010-08-20；接受日期：2010-11-12
基金项目：国家自然科学基金项目（30771345）、陕西省“13115”科技创新工程计划项目（2009ZDKG-11，2010ZDKG-08）
联系方式：王玉卿，E-mail：wyq.86@163.com。通信作者赵继新，Tel：13759980881；E-mail：zhjx881@163.com。并列通信作者陈新宏，E-mail：
cxh2089@126.com



华山新麦草 α-醇溶蛋白基因的克隆及原核表达
王玉卿，赵继新，庞玉辉，降彦苗，陈新宏，武 军，刘淑会
(西北农林科技大学农学院，陕西杨凌 712100)

摘要：【目的】克隆华山新麦草（Psathyrostachys huashanica）的α-醇溶蛋白基因，并对其进行生物信息
学分析，构建该基因的原核表达载体，在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白。【方法】采用同源克隆法从华山新麦草基
因组 DNA 中分离克隆出α-醇溶蛋白基因并进行序列分析，将克隆的华山新麦草α-醇溶蛋白基因 Gli-Ns-5 克隆到
表达载体 pET-28a(+)上，获得重组质粒 pET28a-Gli-Ns 转化大肠杆菌 BL21(DE3)并诱导表达。【结果】从华山新麦
草基因组 DNA 中克隆了 4个α-醇溶蛋白基因：Gli-Ns-2（FJ713595）、Gli-Ns-3（GQ139525）、Gli-Ns-4（GQ139526）
和 Gli-Ns-5（GQ139527）。序列分析表明，4 条序列具有α-醇溶蛋白的典型结构特征，含有 8 个或 9 个半胱氨酸
残基，序列 FJ713595 为假基因。利用所构建的大肠杆菌表达载体，经 IPTG 诱导，华山新麦草α-醇溶蛋白基因
Gli-Ns-5（GQ139527）可在原核系统中特异性表达。Western-blot 证实融合蛋白可成功表达。【结论】克隆了 4
个华山新麦草的α-醇溶蛋白基因序列，基因 Gli-Ns-5（GQ139527）可在原核表达系统中成功表达，为小麦品质
改良提供了新的候选基因。
关键词：华山新麦草；α-醇溶蛋白；基因克隆；序列分析；原核表达

Cloning and Prokaryotic Expression of α-Gliadin Gene from
Psathyrostachys huashanica
WANG Yu-qing, ZHAO Ji-xin, PANG Yu-hui, JIANG Yan-miao, CHEN Xin-hong, WU Jun, LIU Shu-hui
(College of Agronomy, Northwest A&F University, Yangling 712100, Shaanxi)

Abstract：【Objective】 The present study aimed at cloning and analyzing the α-gliadin genes from Psathyrostachys
huashanica and expressing it in E.coli.【Method】The α-gliadin genes were amplified from P. huashanica by AS-PCR and then the
cloned gene Gli-Ns-5 was inserted into pET-28a(+). The recombinant plasmids pET28a-Gli-Ns were expressed in a prokaryotic
expression system after its transformation into BL21(DE3) pLysS host strain. 【Result】 Four new α-glidain genes, Gli-Ns-2
(FJ713595), Gli-Ns-3 (GQ139525), Gli-Ns-4 (GQ139526) and Gli-Ns-5 (GQ139527), were isolated and characterized from the
genomic DNA of Psathyrostachys huashanica. Molecular structure analysis revealed that these four genes had the typical structure of
α-gliadin and contained 8 or 9 cysteine residues, respectively. Two internal stop codons were identified in coding region of FJ713595,
indicating that it was a pseudogene. The results of SDS-PAGE and Western-blot demonstrated that the fusion protein could express
normally in the prokaryotic expression system.【Conclusion】The four α-gliadin genes of Psathyrostachys huashanica were cloned
and the gene Gli-Ns-5 (GQ139527) was successfully expressed in E.coli. This study could provide new candidate genes for wheat
quality improvement.
Key words: Psathyrostachys huashanica; α-gliadins; gene cloning; sequences analysis; prokaryotic expression

1534 中 国 农 业 科 学 44 卷
0 引言
【研究意义】普通小麦及其近缘属物种中含有丰
富的醇溶蛋白等位性变异[1]，这些麦醇溶蛋白等位变
异与小麦烘烤品质性状显著相关[2]。定向克隆醇溶蛋
白等位变异基因和对该类型基因的表达及功能鉴定，
是研究醇溶蛋白分子结构及其与品质关系的有效途
径，并为基因工程改良小麦品质提供新的基因资源。
华山新麦草（Psathyrostachys huashanica Keng ex Kuo，
2n=14，NsNs）是禾本科（Poaceae）小麦族（Triticeae）
新麦草属多年生草本植物，为国家Ⅰ类珍稀濒危植物
和急需保护的农作物野生亲缘种，具有抗寒、耐旱、
耐瘠薄、早熟、抗病、籽粒品质优良等优异性状[3-4]。
华山新麦草醇溶蛋白基因的分离克隆、表达及生物信
息学研究，可为小麦品质改良提供新的候选基因，并
对保护和开发利用这一珍稀濒危物种具有重要的理论
意义和参考价值。【前人研究进展】麦醇溶蛋白
（gliadins）是小麦胚乳贮藏蛋白的主要成分，它和麦
谷蛋白以一定的比例相结合，共同决定面粉的加工品
质[5-6]。近年来，国内外在麦醇溶蛋白基因的定向克隆、
分子结构特征及功能研究等方面取得了显著的进展，
已经分离克隆出了普通小麦及其亲缘植物的 1 200 多
个醇溶蛋白基因。朱西平等[7]从普通小麦和粗山羊草
（Aegilops tauschii）中克隆了 7 个 α-醇溶蛋白基因，
并对其结构特征、染色体定位、分子进化等进行了分
析。Claudia 等[8]和 Ferrante 等[9]利用 E. coli 表达系统
实现了普通小麦 γ-醇溶蛋白基因的原核表达，并对体
外表达产物进行了蛋白质组学研究。前人通过小麦与
华山新麦草杂交，获得了普通小麦-华山新麦草的倍半
二倍体材料 H8911[3]、双二倍体材料 PHW-SA[10-11]及
一系列异附加系和异代换系[12-13]；Zhao 等[14]选育出了
携带华山新麦草谷蛋白和醇溶蛋白基因的二体异附加
系 H9021-28-5。对异附加系 H9021-28-5 面粉加工品质
研究表明，由于华山新麦草 HMW-GS、LMW-GS 和
醇溶蛋白基因的影响，其面粉沉降值、稳定时间、弱
化度、拉伸曲线面积等品质指标上均显著高于其亲本
小麦，说明华山新麦草 HMW-GS、LMW-GS 和醇溶
蛋白基因对小麦面粉的加工品质指标具有正向遗传效
应，这些基因可作为小麦品质改良的重要外源基因加
以研究和利用[4]。【本研究切入点】迄今为止，华山
新麦草 α-醇溶蛋白基因的分子克隆和原核表达研究未
见报道。西北农林科技大学小麦远缘杂交课题组前期
通过普通小麦与华山新麦草杂交，采用染色体工程手
段培育出携带华山新麦草醇溶蛋白和谷蛋白基因的
1Ns 二体异附加系，并对其品质效应进行了初步分析。
【拟解决的关键问题】本研究拟从华山新麦草基因组
中分离克隆 α-醇溶蛋白的编码基因，并对其进行生物
信息学分析，以了解华山新麦草 α-醇溶蛋白的基因结
构及其分子特征，构建原核表达系统对该基因编码产
物进行体外鉴定，为揭示该基因品质效应的分子基础
奠定理论依据，并为利用基因工程手段进行小麦品质
改良提供候选基因资源。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试材料为华山新麦草（Psathyrostachys huashanica
Keng ex Kuo），由西北农林科技大学小麦远缘杂交课
题组保存。
1.2 试验方法
1.2.1 基因组DNA提取及引物设计 采用CTAB法[15]
从华山新麦草幼叶中提取基因组 DNA。根据已公布的
普通小麦及其近缘物种 α-醇溶蛋白基因的核苷酸序
列[16-17]，设计 3 对扩增 α-醇溶蛋白基因的引物 CRP1：
5′-ACCACAAATCCAACATGA/TAGACCTTC/TA/C
TCAT-3′，CRP2：5′-TTCCCATGC/TTTGAACTAG/CT
ATAGGTA/GG-3′；CRA1：5′-ATGAAGACCTTTCTC
ATCCTTG-3′，CRA2：5′-TCAGTTA/GGTACCA/GAA
GATGCC-3′；CRA3：5′-GG/CTCAATACAAATCCA
C/TCATG-3′，CRA4：5′-TTCTCTTCTCAGTTA/GGT
ACC-3′（“/”表示简并），CRP1、CRA1 和 CRA3
位于起始密码子附近，CRA2 位于终止密码子附近，
CRP2 和 CRA4 位于终止密码子下游约 150 bp。引物
由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
1.2.2 目的基因的克隆与序列分析 分别以
CRP1/CRP2、CRA1/CRA2 和 CRA3/CRA4 为引物对
华山新麦草基因组 DNA 进行扩增。PCR 扩增体系为
20 μL，含模板 DNA 100 ng、dNTPs 200 μmol·L-1、
10×buffer 2 μL、引物各 2 μmol·L-1、Taq 酶 1 U。扩
增程序为 94℃预变性 5 min；94℃变性 1 min，58℃退
火 1 min，72℃延伸2 min，35个循环；72℃延伸10 min。
扩增产物经 1%琼脂糖凝胶电泳检测后，回收目标片
段进行 TA 克隆。对阳性克隆提取质粒进行酶切鉴定
后送交上海生工生物工程技术服务有限公司测序。将
获得的 DNA 序列提交到网站 http://www.ncbi.nlm.
nih.gov/进行同源性搜索和注册；运用 BioEdit 和
DNAMAN 软件进行序列比较和系统进化树构建。
8 期 王玉卿等：华山新麦草 α-醇溶蛋白基因的克隆及原核表达 1535
1.2.3 原核表达载体的构建与鉴定 根据目的基因
GQ139527 的完整编码区，利用 Premier 5.0 设计 1 对
表达引物 CRE1：5′-TGCCATATGGTACTTAGCGGT
CCACAGC-3′，CRE2：5′-CCGGAATTCTTCTCTTCT
CAGTTGGTACC-3′（下划线处分别表示 NdeⅠ和
EcoRⅠ的酶切位点）。用 CRE1/CRE2 对华山新麦草
基因组 DNA 进行 PCR 扩增，反应体系和程序同 1.2.2。
目的片段和表达载体 pET-28a(+)经 NdeⅠ和 EcoRⅠ
（ TaKaRa ） 双 酶 切 后 ， 构 建 重 组 表 达 载 体
pET28a-Gli-Ns，并对重组载体进行酶切鉴定和测序验
证。
1.2.4 重组质粒的诱导及表达产物的鉴定 将重组
质粒 pET28a-Gli-Ns 转化至宿主表达菌株 BL21(DE3)
pLysS，挑取重组单菌落振荡过夜培养，培养物按
1﹕100 接种于选择性 LB 液体培养基，待培养至 OD600
≈0.6 时，加入 IPTG（终浓度为 1 mmol·L-1）诱导表
达融合蛋白。诱导 5 h 后收集菌液，2×SDS 凝胶加样
缓冲液裂解菌体，SDS-PAGE（4%浓缩胶和 12%分离
胶）电泳检测融合蛋白，并将诱导表达产物电转移至
PVDF 膜，然后用封闭液（含 5%脱脂奶粉）封闭，加
入鼠抗 His 抗体、HRP 标记的羊抗鼠 IgG 进行 Western
blotting 分析[18]。
2 结果
2.1 目的基因的克隆
以华山新麦草基因组 DNA 为模板，利用引物组
合CRP1/CRP2、CRA1/CRA2和CRA3/CRA4进行PCR
扩增（图 1）。引物组合 CRP1/CRP2 扩增产物克隆测
序后得到 2 个长度分别为 967 bp 和 1 060 bp 的基因序



M：Marker DL2000；1：CRP1/CRP2 PCR 产物；2：CRA1/CRA2 PCR
产物；3：CRA3/CRA4 PCR 产物
M: Marker DL2000; 1: PCR product of CRP1/CRP2; 2: PCR product of
CRA1/CRA2; 3: PCR product of CRA3/CRA4

图 1 PCR 产物电泳分析
Fig. 1 PCR amplified products separated on 1% agarose gel
列，GenBank 登录号分别为 FJ713595 和 GQ139525，
将其暂命名为 Gli-Ns-2 和 Gli-Ns-3 ；引物组合
CRA1/CRA2扩增产物克隆测序后得到 1个长度为 996
bp 的基因序列，GenBank 登录号为 GQ139526，暂命
名为 Gli-Ns-4；引物组合 CRA3/CRA4 扩增产物克隆
测序后得到 1 个长度为 1 022 bp 的基因序列，GenBank
登录号为 GQ139527，暂命名为 Gli-Ns-5。
2.2 核苷酸序列分析
利用 NCBI 网站 BLASTN 工具对这 4 条序列进行
相似性比对，结果显示，序列 FJ713595 和 GQ139525
与中间偃麦草（Thinopyrum intermedium）、多年生簇
毛 麦 （ Dasypyrum breviaristatum ） 、 拟 鹅 观 草
（Pseudoroegneria spicata）和高冰草（Agropyron
elongatum）等亲缘植物的 α-醇溶蛋白基因序列具有很
高的相似性，达到 80%以上，最高达 99%。序列
GQ139526 和 GQ139527 与澳冰草（Australopyrum
retrofractum）、拟鹅观草（Pseudoroegneria spicata）、
纤毛鹅观草（Elymus ciliaris）和柔软赖草（Leymus
mollis）等亲缘植物的 α-醇溶蛋白基因序列也具有很
高的相似性，达到 80%以上，最高达 86%。对这 4 条
序列相互比较显示，序列 GQ139526 与 GQ139527 相
似性很高，达到 99.6%，2 条序列仅在长度和编码区
内有个别位点的碱基出现差异（图 2）。序列 FJ713595
与其它 3 条序列的相似性均较低，编码区内有许多的
单核苷酸位点变异以及插入和缺失序列，该序列在起
始密码子后第 397 和 519 位点，碱基 C 突变成了 T，
导致编码区出现提前终止密码子（图 2），该基因可
能为假基因。
2.3 氨基酸序列分析
在推导的氨基酸一级结构中（图 3），这 4 条序
列均具有 α-醇溶蛋白的典型结构，包括信号肽区
（signal peptide）、N-末端重复区（repetitive domain）、
多聚谷氨酰胺Ⅰ区（polyglutamineⅠ）、特征Ⅰ区
（ unique domain Ⅰ ） 、 多 聚 谷 氨 酰 胺 Ⅱ 区
（polyglutamineⅡ）和特征Ⅱ区（unique domainⅡ）
等区域。信号肽区由 19 或 20 个（FJ713595）氨基酸
组成，在此区有少数几个氨基酸残基差异，如第 13
位，FJ713595 是缬氨酸（V），其余为丙氨酸（A），
第 15 位，FJ713595 和 GQ139525 是苏氨酸（T），而
GQ139526 和 GQ139527 是甘氨酸（G）。N-末端重复
区富含脯氨酸（P）和谷氨酰胺（Q），均由若干较为
一致的重复单元 P（F/Y）P（P/Q）（P/Q）Q1-2 组成
（图 3），将重复区从脯氨酸（P）开始，按照六肽或
1536 中 国 农 业 科 学 44 卷


–表示缺失 Represented the deletions

图 2 华山新麦草α-醇溶蛋白基因核苷酸序列比对
Fig. 2 Alignment of the nucleotide sequences of α-gliadin genes from P. huashanica

七肽重复单元进行分段，按先后顺序列于表。可见，
序列 FJ713595 和 GQ139525 都含有较长的重复区，其
中，六肽单元 PFPPQQ 和 PYPQPQ 重复次数较多，且
基本上连续交替排列；序列 GQ139526 和 GQ139527
重复区很短，仅有 41 个氨基酸残基，且完全一致，其
主要含有 PFPLPQQ、PYPQTQQ 和 PYPQPQL 等 3 种
相似的七肽单元（表）。多聚谷氨酰胺Ⅰ区和Ⅱ区主
要由谷氨酰胺残基（Q）组成，通过与其它序列比对
（图 3）发现，这 4 条序列在多聚谷氨酰胺Ⅰ区，长
度基本一致，仅有个别氨基酸残基出现差异；在多聚
谷氨酰胺Ⅱ区，序列 FJ713595 和 GQ139525 的该区较
短，分别含有 5 和 22 个谷氨酰胺（Q）；而序列
GQ139526 和 GQ139527 的该区域变异很大，不但包
含由大量非谷氨酰胺残基组成的插入片段，而且还含
有 1 个额外的半胱氨酸残基（C）。特征Ⅰ区为低脯
氨酸区，这 4 条序列变异不大。特征Ⅱ区为 C-末端区，
与其它序列相比，序列 FJ713595 和 GQ139525，在终
止密码子之前，多了一段 30（FJ713595）或 40
（GQ139525）个氨基酸残基的多肽。
大多数 α-醇溶蛋白在特征区有 6 个保守的半胱氨
酸残基（C），位置比较保守。本研究获得的 4 条
序列中半胱氨酸残基（C）数目和位置与其它 α-醇
溶蛋白相比有较大差异（图 3），序列 GQ139526 与
GQ139527 都有 8 个半胱氨酸残基，在 N-末端重复区
8 期 王玉卿等：华山新麦草 α-醇溶蛋白基因的克隆及原核表达 1537


▽：6 个保守的半胱氨酸残基；–：缺失；方框表示额外的半胱氨酸残基。EU018294：普通小麦；FJ600499：柔软赖草；FJ600505：纤毛鹅观草；GQ223387：
粘果山羊草；EU325718：多年生簇毛麦；EU849651：长穗偃麦草
▽: Six conserved cysteine; –: deletions; Additional cysteine residues were boxed. EU018294: Triticum aestivum; FJ600499: Leymus mollis; FJ600505: Elymus
ciliaris; GQ223387: Aegilops kotschyi; EU325718: Dasypyrum breviaristatum; EU849651: Thinopyrum intermedium

图 3 华山新麦草α-醇溶蛋白氨基酸序列比对
Fig. 3 Alignment of the deduced amino acid sequences of α-gliadin genes from P. huashanica

和多聚谷氨酰胺Ⅱ区各有了一个额外的半胱氨酸残
基，替代了原来的丝氨酸（S）；在特征Ⅰ区有 4 个
半胱氨酸残基，特征Ⅱ区有 2 个半胱氨酸残基；序列
FJ713595 和 GQ139525 都含有 9 个半胱氨酸残基，其
中，序列 FJ713595 在特征Ⅰ区和特征Ⅱ区分别有 1
个和 2 个额外的半胱氨酸残基（C），序列 GQ139525
在特征Ⅱ区有 3 个额外的半胱氨酸残基（C）。
2.4 系统进化分析
将得到的 4 条华山新麦草 α-醇溶蛋白 DNA 序列
与 GenBank 已登录的小麦属、山羊草属、拟鹅观草属、
簇毛麦属等亲缘物种的 20 个 α-醇溶蛋白基因序列进
行同源性比对分析，并构建系统进化树（图 4）。结
果显示，具有相对较近亲缘关系的基因序列，均可以
聚在一起，如小麦属和山羊草属的 α-醇溶蛋白基因被
聚为一类，簇毛麦属 2 个种的 α-醇溶蛋白基因序列被
聚为一类。这 24 个基因序列被聚为 2 大类，其中，华
山新麦草 α- 醇溶蛋白基因序列 GQ139526 和
GQ139527 聚为一类，其余 22 个序列聚为一类。本研
究获得的序列 FJ713595 和 GQ139525 与柔软赖草（L.
moills）和纤毛鹅观草（E.ciliaris）的 α-醇溶蛋白基
因聚在一起，说明华山新麦草的 α-醇溶蛋白基因序
列 FJ713595 和 GQ139525 与柔软赖草和纤毛鹅观草
的 α-醇溶蛋白基因具有相对较近的亲缘关系；而序
列 GQ139526 和 GQ139527 没有与其它亲缘物种 α-醇
1538 中 国 农 业 科 学 44 卷


图 4 华山新麦草α-醇溶蛋白基因的系统进化树
Fig. 4 The phylogenetic tree of α-gliadin genes from P. huashanica

表 α-醇溶蛋白重复区的比较
Table Comparison of the repeated regions of α-gliadin
Gli-Ns-2
FJ713595
Gli-Ns-3
GQ139525
Gli-Ns-4
GQ139526
Gli-Ns-5
GQ139527
PQNPSQQQ PQLQPQN PQQQLQLQQ PQQQLQLQQ
PQEQS PSLQQPQQL PCLQQPQQQI PCLQQPQQQI
PLMQQV PSMRQQ PLMQQQ PLMQQQ
QFPWPQL QFPGQQQ PFPLPQQ PFPLPQQ
PFPSQQ PFPPQQ PYPQTQQ PYPQTQQ
PYPQQQ PYPQPQ PYPQPQL PYPQPQLL
PFPPRQ PFPPQQ PISQQQQ PISQQQQ
PYPQPQ PYPQPQ PFPLPQQ PFPLPQQ
PFPQPQ PFPPQQ PYPQQQ PYPQQQ
PFPPQQ PYPQPQ
PYPQPQ PFPPQQ
PFPPQQ PYPQPH
PYPQPQQQ PFPPQQ
PYPQSQQ
溶蛋白基因序列聚在一起，说明序列 GQ139526 和
GQ139527 与这些基因的亲缘关系相对较远。
2.5 原核表达载体的构建及酶切鉴定
利用 NdeⅠ和 EcoRⅠ对纯化目的基因 Gil-Ns-5
（GQ139527）以及 pET-28a(+)分别进行双酶切。然后
纯化、连接，构建重组表达载体。双酶切鉴定（图 5）
显示，可从重组质粒中酶切出一条950 bp左右的片段。
重组质粒经再次测序表明，插入片段与克隆序列完全
一致，开放阅读框（ORF）正确，目的基因 Gil-Ns-5
的阅读框与原核表达载体上的 His-Tag 阅读框正确融
合。说明华山新麦草 α-醇溶蛋白基因 Gil-Ns-5
（GQ139527）的原核表达载体 pET28a-Gli-Ns 构建成
功。
2.6 SDS-PAGE 分析
重组质粒 pET28a-Gli-Ns 经 IPTG 诱导后，在大肠
杆菌 BL21(DE3)中进行表达。SDS-PAGE 电泳（图 6）
显示，在分子量约为 37.5 kD 的位置上存在 1 条融合
8 期 王玉卿等：华山新麦草 α-醇溶蛋白基因的克隆及原核表达 1539


M：DNA 分子量标准；1：重组质粒
M: Marker Ⅲ; 1: Positive colonies

图 5 重组质粒双酶切鉴定
Fig. 5 Double enzymes digestion of recombinant plasmids

蛋白诱导表达的条带，除去 His-tag 标签蛋白 2.16 kD，
目的蛋白的分子量约为 35.34 kD，这与外源华山新麦
草 α-醇溶蛋白基因 Gil-Ns-5（GQ139527）编码区蛋白
的分子量理论值相符。
2.7 Western blotting 分析
重组质粒 pET28a-Gli-Ns 诱导表达产物经 12%
SDS-PAGE 后，电转移至 PVDF 膜上，经 5%脱脂奶
粉封闭后，依次加入小鼠抗 His 一抗，HRP 标记的羊


M：蛋白质分子质量标准；1、3、5：IPTG 诱导后的重组质粒；2、4、
6：IPTG 诱导后空载体；7、9：未诱导的重组质粒；8、10：未诱导的
空载体；箭头示基因 Gli-Ns-5 的表达产物
M: Protein molecular weight marker; 1, 3, 5: Protein of recombinant
plasmid pET28a-Gli-Ns induced by IPTG; 2, 4, 6: Protein of pET-28a(+)
plasmid induced by IPTG; 7, 9: Protein of recombinant plasmid
pET28a-Gli-Ns without induction; 8, 10: Protein of pET-28a(+) plasmid
without induction; Arrow shows expression product of Gli-Ns-5

图 6 诱导表达产物的 SDS-PAGE 分析
Fig. 6 Analysis of induced expression products by SDS-PAGE
抗小鼠 IgG 二抗，最后显示 1 条分子量为 37.5 kD 左
右的条带（图 7），证明融合表达蛋白可成功表达。



M：蛋白质分子质量标准；1：未经诱导的重组质粒；2：诱导后的重组
质粒；箭头示基因 Gli-Ns-5 表达产物
M: Protein molecular weight marker; 1: Uninduced recombinant plasmid
pET28a-Gli-Ns; 2: Induced recombinant plasmid pET28a-Gli-Ns; Arrow
shows expression product of Gli-Ns-5

图 7 重组质粒 pET28a-Gli-Ns 表达产物的 Western blot
分析
Fig. 7 Western blot of expression product of the recombinant
plasmid pET28a-Gli-Ns

3 讨论
α-醇溶蛋白约占小麦醇溶蛋白总量的 25％左右，
主要由位于小麦第 6 同源群染色体短臂上的 Gli-2 位
点编码[1]。部分第 6 同源染色体可能是通过由部分第 1
同源染色体的复制或（和）置换产生的[19]，并导致了
基因家族的分化[20]。α-醇溶蛋白基因家系在不同小麦
品种和小麦近缘属物种中变化显著，有 25 到 150 个不
等的拷贝数[16]，导致这种情况的原因可能是 α-醇溶蛋
白基因的大量复制，且在复制过程中产生了碱基突变，
并由此产生了基因组上丰富的 α-醇溶蛋白基因位点。
α-醇溶蛋白基因约有 50%是假基因[21]。本研究获得的
4 条华山新麦草 α-醇溶蛋白基因中，序列 FJ713595 在
第 397 和 520 位点处产生了碱基 C 到 T 的转换，导致
了 2 个提前终止密码子出现。其原因可能是 α-醇溶蛋
白基因序列中含有丰富的谷氨酰胺密码子 CAA 和
CAG，碱基 C 到 T 的转换很容易导致提前终止密码子
的出现。
Anderson 等[22]认为 α-醇溶蛋白的基因编码区依
次包含信号肽区、N-末端重复区、多聚谷氨酰胺Ⅰ区、
1540 中 国 农 业 科 学 44 卷
特征Ⅰ区、多聚谷氨酰胺Ⅱ区和特征Ⅱ区等区域，其
重复区主要由重复单元为 P（F/Y）PQ0-1PQ1-2 的重复
短肽组成[8]。本研究分离克隆到的 4 条华山新麦草 α-
醇溶蛋白基因序列均具有这些典型的结构特征。同时，
这些序列又反映出一定的华山新麦草物种特异性，序
列 GQ139526 与 GQ139527 与其近缘植物的 α-醇溶蛋
白基因序列相比，重复区较短，主要以七肽重复单元
为主，多聚谷氨酰胺Ⅱ区较长，除含有大量非谷氨酰
胺残基外，还有插入/缺失（InDel）变异存在；此外，
在这 2 个区域，2 条序列都出现了额外的半胱氨酸残
基（C），导致其各含有 8 个半胱氨酸残基（图 3）。
目前这些变异类型还未见报道。此外，系统进化分析
表明序列GQ139526和GQ139527被单独聚为一类（图
4），与其它 α-醇溶蛋白基因的亲缘关系相对较远，
由此推测，华山新麦草 α- 醇溶蛋白基因序列
GQ139526 和 GQ139527 可能为 α-醇溶蛋白基因家族
中的新类型。
稳定的分子间和分子内二硫键的形成，有助于将
多个蛋白质亚基连在一起，从而影响小麦面粉的黏弹
性和延展性[23]。多数 α-型醇溶蛋白具有 6 个半胱氨酸
残基（C）。半胱氨酸的数目和相对位置非常保守，
这对于形成稳定的分子间和分子内二硫键非常重要[24]。
Susan 等[25]研究表明 α-醇溶蛋白中额外的半胱氨酸残
基能够促使醇溶蛋白结合在谷蛋白聚合体上。刘千
等[26]报道 α-醇溶蛋白基因中出现了额外的半胱氨酸
以及保守半胱氨酸残基被替换的现象，这些特殊的变
异可能会影响二硫键的形成，从而对面团特性造成影
响。Anderson 等[27]曾报道 γ-醇溶蛋白基因中出现额外
半胱氨酸现象，并认为这样的醇溶蛋白基因可能为聚
合体的形成提供更多因素。本研究获得的 4 条华山新
麦草 α-醇溶蛋白基因序列中，半胱氨酸残基数目均比
前人报道的数目多，达到 8 个（序列 GQ139526 和
GQ139527）和 9 个（序列 FJ713595 和 GQ139525），
这些额外半胱氨酸残基的出现或许可与麦谷蛋白亚基
形成分子间二硫键，并与之相互交织在一起，形成巨
大而稳定的网状结构，从而有可能对面团的加工品质
产生有利影响。
蛋白质的体外表达系统为研究种子贮藏蛋白的表
达和功能提供了—条有效途径。胚乳蛋白在体外的大
量表达有助于鉴定和验证蛋白的工艺和营养特性，有
助于更好的了解蛋白结构和功能的关系[9]。迄今为止，
虽然已经分离克隆了许多小麦及其近缘物种的醇溶蛋
白基因，但对绝大多数醇溶蛋白的体外表达和功能验
证研究还很少。本研究将华山新麦草 α-醇溶蛋白基因
Gil-Ns-5（GQ139527）与表达载体 pET-28a(+)重组，
转入大肠杆菌 BL21（DE3）中进行诱导融合蛋白表达，
通过抗 His 单抗与诱导蛋白做 Western-blot 分析表明，
华山新麦草 α-醇溶蛋白 Gil-Ns-5（GQ139527）可与
His 标签蛋白形成融合蛋白，并可在原核表达体系中
得到正确表达。华山新麦草 α-醇溶蛋白基因的分离克
隆和原核表达研究为小麦品质改良提供了新的候选基
因，对进一步纯化该蛋白或将该基因转入普通小麦，
研究单个华山新麦草 α-醇溶蛋白基因对小麦品质的影
响效应奠定了理论基础，同时对研究、保护和利用华
山新麦草的优异基因提供了参考依据。
4 结论
本研究从华山新麦草基因组中分离克隆出 4 个 α-
醇溶蛋白基因，GenBank 登录号分别为 FJ713595、
GQ139525、GQ139526 和 GQ139527；序列分析表明，
这 4 个基因序列具有 α-醇溶蛋白家族的一般结构模型
和基本特征，并且都含有 8 或 9 个半胱氨酸残基，序
列 GQ139526 和 GQ139527 在重复区和多聚谷氨酰胺
Ⅱ区具有特殊的结构变异；系统进化分析表明，序列
FJ713595 和 GQ139525 与柔软赖草和纤毛鹅观草的 α-
醇溶蛋白基因具有相对较近的亲缘关系，序列
GQ139526 和 GQ139527 单独成一类，其可能为 α-醇
溶蛋白基因家族中的新类型；将华山新麦草 α-醇溶蛋
白基因 GQ139527 与原核表达载体 pET-28a(+)构建了
融合表达载体 pET28a-Gli-Ns，并成功地在大肠杆菌
BL21(DE3)中实现表达，获得与理论值相符的 37.5 kD
的融合蛋白，为小麦品质改良提供新的候选基因，并
对研究华山新麦草 α-醇溶蛋白基因的品质效应，及保
护和利用华山新麦草的优异基因提供了理论参考。

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（责任编辑 李 莉）