全 文 ：书麦类作物学报　２０１２，３２（３）：３８７－３９２
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｔｒｉｔｉｃｅａｅ　Ｃｒｏｐｓ
栽培一粒小麦α－醇溶蛋白新基因的克隆与序列分析
＊?
李玉阁，邢冉冉，李锁平
（河南大学生命科学学院，河南开封４７５００４）
摘　要：α－醇溶蛋白是人们生活中消费最多的蛋白，由于含有引起乳糜泻（ＣＤ）的主要毒性肽成分，也是
引起ＣＤ的最活跃的蛋白。为了解一粒小麦在小麦品质育种中的潜力，利用１对α－醇溶蛋白的特异引物，采
用基因组ＰＣＲ法从栽培一粒小麦中克隆α－醇溶蛋白新基因，共获得片段大小为８５６～８８２ｂｐ的４个基因序
列，分别命名为ＡＡ－６、ＡＡ－８、ＡＡ－９和ＡＡ－２１（ＧｅｎＢａｎｋ登录号为ＪＮ８３１３８２～ＪＮ８３１３８５）。其中，ＡＡ－８、ＡＡ－９
和ＡＡ－２１均在１０２位因Ｃ→Ｔ替换而导致ＴＡＧ终止子出现成为假基因；ＡＡ－６由８８２个 核苷酸构成，可编码
２９３个氨基酸，与已知基因的最高同源性为９９％，推断氨基酸序列具有α－醇溶蛋白的典型结构，是α－醇溶蛋白
家族的新成员。ＡＡ－６的ＣＤ毒性肽分析表明，除不含 Ａ基因组所没有的ｇｌｉａ－α和ｇｌｉａ－α２毒性肽外，其他已
知的７种毒性肽均有分布。ＡＡ－６和８６个来源于小麦及其祖先供体种的α－醇溶蛋白的同源性分析表明，α－醇
溶蛋白基因存在基因组来源的差异性，其中，Ａ、Ｄ基因组来源的α－醇溶蛋白基因的相似性较高。
关键词：栽培一粒小麦；α－醇溶蛋白；基因克隆；乳糜泻；系统进化
中图分类号：Ｓ５１２．１；Ｓ３３０　　　　文献标识码：Ａ　　　　文章编号：１００９－１０４１（２０１２）０３－０３８７－０６
Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｎｅｗα－Ｇｌｉａｄｉｎ
Ｇｅｎｅｓ　ｆｒｏｍＴｒｉｔｉｃｕｍ　ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ
ＬＩ　Ｙｕ－ｇｅ，ＸＩＮＧ　Ｒａｎ－ｒａｎ，ＬＩ　Ｓｕｏ－ｐｉｎｇ
（Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｈｅｎａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｋａｉｆｅｎｇ，Ｈｅｎａｎ　４７５００４，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅα－ｇｌｉａｄｉｎｓ　ｗｅｒｅ　ｔｙｐｉｃａｌｙ　ｔｈｅ　ｍｏｓｔ　ｃｏｎｓｕｍｅｄ　ｓｔｏｒａｇｅ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｌｉｆｅ，ｈｏｗｅｖｅｒ，
ｏｗｉｎｇ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｍａｉｎ　ｔｏｘｉｃ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ　ｔｈｅｙ　ｃｏｎｔａｉｎｅｄ　ｃａｕｓｉｎｇ　ｃｅｌｉａｃ　ｄｉｓｅａｓｅ（ＣＤ），ｔｈｅα－ｇｌｉａｄｉｎｓ　ｗｅｒｅ
ａｌｓｏ　ｔｈｅ　ｍｏｓｔ　ａｃｔｉｖｅ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ　ＣＤ．Ｓｏ　ｔｈｅ　ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　ｏｆ　ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ　ｗａｓ　ｔｏ　ｅｓｔｉｍａｔｅ　ｔｈｅ　ｐｏ－
ｔｅｎｔｉａｌ　ｖａｌｕｅ　ｉｎ　ｗｈｅａｔ　ｑｕａｌｉｔｙ　ｂｒｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｌｏｎｅｄα－ｇｌｉａｄｉｎ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ　ａｎｄ　ｔｏ
ａｎａｌｙｚｅ　ｔｈｅ　ＣＤ　ｅｐｉｔｏｐｅｓ　ａｍｏｎｇ　ｔｈｅｍ．Ｏｎｅ　ｎｅｗα－ｇｌｉａｄｉｎ　ｇｅｎｅ　ｗｉｔｈ　ｆｕｌ－ＯＲＦ（ｎａｍｅｄ　ａｓ　ＡＡ－６，Ｇｅｎ－
Ｂａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＪＮ８３１３８２）ａｎｄ　ｔｈｒｅｅ　ｐｓｅｕｄｏｇｅｎｅｓ（ｎａｍｅｄ　ａｓ　ＡＡ－８，ＡＡ－９，ＡＡ－２１，ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃ－
ｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＪＮ８３１３８３，ＪＮ８３１３８４ａｎｄ　ＪＮ８３１３８５，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ）ｗｅｒｅ　ｃｌｏｎｅｄ　ａｎｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ．Ｔｈｅ　ｔｈｒｅｅ
ｐｓｅｕｄｏｇｅｎｅｓ　ｒｅｓｕｌｔｅｄ　ｆｒｏｍ　Ｃ　ｔｏ　Ｔ　ｂａｓｅ　ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ，ｗｈｉｃｈ　ｌｅａｄｉｎｇ　ｔｏ　ｔｈｅ　ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ　ｏｆ　ａ　ＣＡＧ　ｃｏｄｏｎ
ｆｏｒ　ｇｌｕｔａｍｉｎｅ　ｉｎｔｏ　ａ　ＴＡＧ　ｓｔｏｐ　ｃｏｄｏｎ　ａｔ　ｔｈｅ　ｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｏｆ　１０２ｂｐ．Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｄｅｄｕｃｅｄ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｓｅ－
ｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ＡＡ－６ｒｅｖｅａｌｅｄ　ｔｈａｔ　ＡＡ－６ｗａｓ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｔｙｐｉｃａｌ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆα－ｇｌｉａｄｉｎｓ，ｗｉｔｈ　ｔｈｅ
ｈｉｇｈｅｓｔ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ｏｆ　９９％．Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｎ　ｉｔｓ　ＣＤ　ｅｐｉｔｏｐｓ　ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｓｅｖｅｎ　ｔｏｘｉｃ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ
ｎｉｎｅ　ｋｎｏｗｎ　ｅｐｉｔｏｐｓ　ｗｅｒｅ　ｐｒｅｓｅｎｔ　ｉｎ　ＡＡ－６ｅｘｃｅｐｔ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ａｂｓｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｇｌｉａ－α２ａｎｄ　Ｇｌｉａ－αｉｎ　ｔｈｅ　Ａ　ｇｅ－
ｎｏｍｅ．Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ａｍｏｎｇ　ＡＡ－６ａｎｄ　８６ｇｅｎｅｓ　ｆｒｏｍ　ｃｏｍｍｏｎ　ｗｈｅａｔ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ａｎｃｅｓｔｒａｌ　ｓｐｅｃｉｅｓ
ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ａ　ｃｌｅａｒ　ｃｌｕｓｔｅｒ　ｃａｎ　ｂｅ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ａｃｃｏｒｄｉｎｇ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｏｒｉｇｉｎ　ｏｆ　ｔｈｅｉｒ　ｇｅｎｏｍｅ．Ｔｈｅ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ｏｆ
Ａ　ｇｅｎｏｍｅ　ａｎｄ　Ｄ　ｇｅｎｏｍｅ　ｗａｓ　ｍｏｒｅ　ｃｌｏｓｅ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｏｆ　Ｂ　ｇｅｎｏｍｅ．
＊收稿日期：２０１１－１２－１２　　　修回日期：２０１２－０１－２８
基金项目：国家自然科学基金项目（３０９７１７７４）；“十二五”农村领域国家科技计划课题（２０１１ＢＡＤ０７Ｂ００）；河南省教育厅自然科学基
金项目（２００８Ａ１８０００６）。
作者简介：李玉阁（１９７７－），女，在读博士，讲师，主要从事小麦分子生物学研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｙｇｚｉｘｉｕ＠ｈｅｎｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
通讯作者：李锁平（１９６２－），男，博士生导师，教授，主要从事小麦遗传育种研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｉｓｕｏｐｉｎｇ＠ｈｅｎｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ，α－ｇｌｉａｄｉｎ，ｇｅｎｅ　ｃｌｏｎｉｎｇ，ｃｅｌｉａｃ　ｄｉｓｅａｓｅ，ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ
　　麦谷蛋白和醇溶蛋白是面筋蛋白的主要成
分，是影响小麦加工品质的重要因素，尤其是醇溶
蛋白和谷蛋白的数量、比例及组成与小麦面团的
粘性和弹性密切相关。麦谷蛋白主要决定面团的
强度和弹性，醇溶蛋白决定面团的粘性和延展
性［１－２］。根据酸性聚丙烯酰胺凝胶 电 泳 （Ａ－
ＰＡＧＥ）的迁移率及结构，醇溶蛋白可分为α、γ和
ω（或α／β、γ和ω）３种类型。在醇溶蛋白中，α－醇
溶蛋白含量最丰富，占种子储藏蛋白的１５％～
３０％，是人类消费量最大的蛋白质［３－５］。Ｍｅｔａｋ－
ｏｖｓｋｙ等［６］研究表明，等位基因Ｇｌｉ－Ｂ１ｂ、Ｇｌｉ－Ｂ２ｃ
和Ｇｌｉ－Ａ２ｂ 与高面筋强度显著相关。晏月明等［７］
研究认为，醇溶蛋白等位基因的变异与小麦品种
间品质差异有关，可通过对醇溶蛋白的选择来改
良小麦品质。同时，人们发现醇溶蛋白，尤其是
α－醇溶蛋白也是人类乳糜泻（Ｃｅｌｉａ　ｄｉｓｅａｓｅ，ＣＤ）
的主要诱发因素［８，９］。
乳糜泻是最常见的一种遗传性的肠紊乱疾
病，又称面筋过敏性肠病，主要是由于机体对所摄
取的麦类作物（包括小麦、大麦及黑麦）中富含脯
氨酸和谷氨酸的面筋蛋白产生过敏所导致的一种
过敏反应。该病是一种终身性疾病，发病率高达
１％［８］，与人类白细胞抗原（ｈｕｍａｎ　ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　ａｎｔｉ－
ｇｅｎ，ＨＬＡ）家族的ＤＱ２和ＤＱ８分子密切相关，
而对面筋蛋白能产生特异反应的ＣＤ＋Ｔ细胞也
对该病的发生有重要的影响［９］。根据Ｃｉｃｃｏｃｉｏｐ－
ｐｏ等［１０］和 Ｖａｃｃｉｎｏ等［１１］的综述，目前已检测出
１８种在体内或体外具有活性、能刺激ＣＤ症发生
的面筋蛋白肽段（ＣＤ肽），分布于醇溶蛋白的有
１４种，并根据其产生的过敏反应的不同，分为“毒
性肽”和“免疫肽”两种，前者诱导的过敏反应会引
起肠道粘膜的损伤，而后者仅对 ＨＬＡ－ＤＱ２或
ＨＬＡ－ＤＱ８特异的Ｔ 细胞产生刺激。研究表明，
大部分面筋蛋白多肽为“免疫肽”。在已知的１８
种毒性肽中，仅有４种为“毒性肽”，除ＰＱＱＰＦ－
ＰＱＱ 分 布 于 ω－醇 溶 蛋 白 外，ＬＧＱＱＱＰＦＰ－
ＰＱＱＰＹＰＱＰＱＰＦ，ＰＱＰＱＰＦＰＳＱＱＰＹ，ＬＧＱＧＳ－
ＦＲＰＳＱＱＮ均分布于α－醇溶蛋白。而且，在已知
的１８种毒性肽中，诱发ＣＤ症的五个主要优势多
肽（免疫活性命名为＋＋＋，而其他的命名为＋），
除ＱＱＰＱＱＳＦＰＥＱＱ分布于γ－醇溶蛋白外，ｇｌｉａ－
α２０ （ＰＦＲＰＱＱＰＹＰＱＰＱＰＱ ）、ｇｌｉａ－α９ （ＰＦ－
ＰＱＰＱＬＰＹ）、ｇｌｉａ－α２（ＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＬＰＹ）和
ｇｌｉａ－α（ＰＳＧＱＧＳＦＱＰＳＱＱ）均分布于α－醇溶蛋白。
可见，α－醇溶蛋白是诱发 ＣＤ 病的主要活性蛋
白［４，１１］。
栽培一粒小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ，ＡＡ）
是普通小麦Ａ基因组的供体，是小麦遗传改良的
重要种质资源，目前，在 ＧｅｎＢａｎｋ注册的具有完
整编码区的α－醇溶蛋白功能基因为２５６个，其中
来源于一粒小麦的仅有１２个，而有关栽培一粒小
麦在诱发ＣＤ症的潜在危险性方面，目前还存在
争议。因此，本研究采用基因组ＰＣＲ法对实验室
收集的栽培一粒小麦的α－醇溶蛋白基因进行克
隆和ＣＤ肽分析，以期为小麦品质育种提供基础
的参考资料。
１　材料与方法
１．１　材 料
栽培一粒小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ，ＡＡ，
２ｎ＝２ｘ＝１４）种子由本实验收集。
１．２　基因组ＤＮＡ的提取及ＰＣＲ扩增
随机抽取２０粒栽培一粒小麦种子培养黄化
苗，采用改良的ＣＴＡＢ法从黄化苗嫩叶中提取基
因组ＤＮＡ［１２］，根据已注册的α－醇溶蛋白基因序
列的保守区域设计 １ 对简并引物，Ｆ：５′－ＡＴ－
ＧＡＡＧＡＣＣＴＴＴＣＴＣＡＴＣＣＴ－３′， Ｒ：５′－ＴＣＡ－
ＧＴＴＲＧＴＡＣＣＲＡＡＧＡＴＧＣＣ－３′。该 引 物 的 扩
增范围包括从起始密码子“ＡＴＧ”到终止密码子
“ＴＧＡ”之间的编码序列。ＰＣＲ 反应体系为５０
μＬ，含有ＤＮＡ模板１００ｎｇ，４种ｄＮＴＰ各１００
μｍｏｌ·Ｌ
－１，２×ＧＣ　ｂｕｆｆｅｒ　Ｉ　２５μＬ，引物Ｆ和Ｒ
各０．５μｍｏｌ·Ｌ
－１，１．５Ｕ 的 ＬＡＴａｑ酶（ＴａＫａ－
Ｒａ）。ＰＣＲ的反应条件为９４℃预变性４ｍｉｎ；然
后９４℃变性３０ｓ，６２℃退火４５ｓ，７２℃延伸６０ｓ，
共３２个循环，最后７２℃延伸１５ｍｉｎ。
１．３　ＰＣＲ产物纯化及克隆测序
ＰＣＲ 产物经 １．０％ 琼脂糖凝胶电泳，用
ＴａＫａＲａ公司的 ＤＮＡ凝胶回收试剂盒 Ｖｅｒ２．０
对目的片段回收纯化，纯化产物连接到ｐＭＤ１９－Ｔ
载体（ＴａＫａＲａ公司），并转化 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ
（ＤＨ５α）感受态细胞，通过菌液ＰＣＲ鉴定阳性克
隆，ＤＮＡ序列测定由北京六合华大生物技术公司
测定完成。
·８８３· 麦　类　作　物　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　第３２卷
１．４　序列分析和系统树的构建
利用Ｃｌｕｓｔａｌ　Ｗ　ｖｅｓｉｏｎ　１．８和Ｂｉｏｅｄｉｔ　７．０软
件进行克隆基因的序列分析，并用本试验中所克
隆基因与８６个来源于小麦及其祖先种的α－醇溶
蛋白基因进行同源性比较，用 Ｍｅｇａ　４．０构建
ｎｅｉｇｈｂｏｒ－ｊｏｉｎｉｎｇ 树。根 据 Ｃｉｃｃｏｃｉｏｐｐｏ 等［１０］和
Ｖａｃｃｉｎｏ等［１１］的综述识别克隆基因所编码的ＣＤ肽。
２　结果与分析
２．１　ＰＣＲ扩增、克隆和序列分析
引物Ｆ和Ｒ用来扩增栽培一粒小麦α－醇溶
蛋白的完整编码区，得到一个约８００ｂｐ左右的单
一条带（图１），目的条带纯化回收克隆到ｐＭＤ１９－
Ｔ载体，通过菌液ＰＣＲ共鉴定到四个阳性克隆，
分别命名为ＡＡ－６、ＡＡ－８、ＡＡ－９和 ＡＡ－２１。四个
序列均为完整的编码区，与已知的经典α－醇溶蛋
白基因具有较高的相似性（大于９５％），均为α－醇
溶蛋白基因家族的新成员。四序列的 ＧｅｎＢａｎｋ
注册序列号为ＪＮ８３１３８２－ＪＮ８３１３８５。
　　通过Ｂｉｏｅｄｉｔ　７．０对序列进行分析表明，ＡＡ－
８、ＡＡ－９和ＡＡ－２１均因碱基替换或移码突变而导
致终止子的提前出现，均为假基因。除移码突变
外，碱基替换导致的终止子中均为Ｃ→Ｔ替换导
致 ＣＡＡ、ＣＡＧ 变成了终止子 ＴＡＡ 和 ＴＡＧ。
ＡＡ－６为功能基因，由８８２ｂｐ核苷酸组成，可编码
２９３个氨基酸。ＡＡ－６的推断氨基酸序列与已知
的定位于６Ａ染色体的四个α－醇溶蛋白基因的比
对（图２）表明，ＡＡ－６具有α－醇溶蛋白的典型结
构，没有内含子，且以ＴＧＡ为终止密码子，有２０
个氨基酸构成的信号肽（Ｓｉｇｎａｌ　ｐｅｐｔｉｄｅ，Ｓｉｇ）、一
个Ｎ－末端重复区（Ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ　ｄｏｍａｉｎ，Ｒｅｐ）、多聚
谷氨酸Ｉ区（ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｎｅ　ｄｏｍａｉｎ　Ｉ，ＰｌｏｙＩ）、特
征区Ｉ（ｕｎｉｑｕｅ　ｄｏｍａｉｎＩ，Ｕｎｉｑ　Ｉ）、多聚谷氨酸ＩＩ
区（ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｎｅ　ｄｏｍａｉｎＩＩ，Ｐｌｏｙ　ＩＩ）和一个Ｃ－末
端特征区ＩＩ（ｕｎｉｑｕｅ　ｄｏｍａｉｎＩＩ，Ｕｎｉｑ　ＩＩ），在两个
特征区含有六个保守的半胱氨酸（ｃ）。
２．２　系统进化分析
目前，ＧｅｎＢａｎｋ中已注册的α－醇溶蛋白的核
苷酸序列８５８个，大部分是假基因，只有３２５个序
列可编码部分或者完整编码区（２６６个）的α－醇溶
蛋白序列。Ｖａｎ　Ｈｅｒｐｅｎ等［４］的研究表明，α－醇溶
蛋白基因推断氨基酸序列的序列相似性和多聚谷
氨酰重复区的平均长度存在基因组来源的差异
性。为了揭示所克隆基因与已注册基因的同源
性，ＡＡ－６与来源于普通小麦的已进行染色体定
位的１５个基因（藁城８９０１的８个，郑优９５０７的７
个）、来源于粗山羊草（Ａｅｇｉｌｏｐｓ　ｔａｕｓｃｈｉｉ，ＤＤ）的
２７个具有完整编码区的基因、栽培一粒小麦
（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ，ＡＡ）的２７个基因（１２个
有完整编码区、１５个为部分的编码区）、四倍体小
麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍｔｕｒｇｉｄｕｍ，ＡＡＢＢ）的１　２个基因和
图１　 栽培一粒小麦α－醇溶蛋白基因的ＰＣＲ扩增
Ｆｉｇ．１　ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅα－ｇｌｉａｄｉｎ
ｇｅｎｅ　ｆｒｏｍＴ．ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ
图２　ＡＡ－６与４个经典α－醇溶蛋白基因推断氨基酸序列比对图
Ｆｉｇ．２　Ｍｕｔｌｉｐｌｅ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｄｅｄｕｃｅｄ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ＡＡ－６ａｎｄ　ｏｔｈｅｒ　ｆｏｕｒ　ｔｙｐｉｃａｌα－ｇｌｉａｄｉｎ　ｇｅｎｅｓ．
·９８３·第３期　　　　　　　　　李玉阁等：栽培一粒小麦α－醇溶蛋白新基因的克隆与序列分析
来源于拟斯卑尔脱山羊草（Ａｅｇｉｌｏｐｓ　ｓｐｅｌｔｏｉｄｅｓ，
ＳＳ）的５个部分编码区的基因的推断氨基酸的同
源性进行比较分析，并构建了系统进化树（图３）。
　　从图３可以看出，８７个基因在遗传距离约为
０．０５处可聚为四组，其中第一组（Ｇｒｏｕｐ　１）又可
分为两个亚组（Ａ、Ｄ），Ａ亚组共包括３２个基因，
其中来源于栽培一粒小麦的２４个、四倍体小麦４
个、粗山羊草１个、来源于小麦品种并定位于６Ｂ
或６Ｄ染色体的基因３个，所以该亚组主要代表
Ａ染色体组来源的α－醇溶蛋白基因，而本文所克
隆的ＡＡ－６基因正分布于此组。Ｄ亚组共包括２７
个来源于粗山羊草或小麦并定位于Ｄ染色体的
基因，表明Ｄ亚组代表来源于Ｄ染色体来源的α－
醇溶蛋白基因。同样，第二组（Ｇｒｏｕｐ　２）和第三组
（Ｇｒｏｕｐ　３）代表Ｂ基因组来源的α－醇溶蛋白基
因，而第四组（Ｇｒｏｕｐ　４）则包含４个亚组，分别由
来源于Ａ、Ｂ、Ｂ、Ｄ基因组的α－醇溶蛋白基因构
成。说明α－醇溶蛋白序列的同源性的确存在基
因组来源的差异性，其中，Ａ、Ｄ基因组来源的α－
醇溶蛋白同源性更高。
２．３　ＣＤ毒性肽识别及毒性肽基因组来源的差
异性分析
研究表明，每种毒性肽在α－醇溶蛋白序列中
都有出现的特定区域［１１］。在已知分布于α－醇溶
蛋白的 ９ 种毒性多肽序列中，ｇｌｉａ－α２０（ＰＦＲ－
ＰＱＱＰＹＰＱＰＱＰＱ）、ｇｌｉａ－α９（ＰＦＰＱＰＱＬＰＹ）、ｇｌｉ－
ａ－α２（ＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＬＰＹ）、ＱＮＰＳＱＱＱＰＱＥ－
ＱＶＰＬＶＱＱＱ、Ｌ／ＰＧＱＱＱＰＦＰＰＱＱＰＹＰＱＰＱＰＦ
和ＰＱＰＱＰＦＰＳＱＱＰＹ这六种多肽通常以不同的
组合出现在Ｎ－末端重复区，特征区Ｉ没有或只出
现（ＱＬＩＰ）ＦＣＭＤＶＶＬＱ 多肽序列，ｇｌｉａ－α（ＰＳ－
ＧＱＧＳＦＱＰＳＱＱ）或 ＬＧＱＧＳＦＲＰＳＱＱＮ 通常出
现在Ｃ－末端特征区ＩＩ。另外，研究还表明，四种
主要的 Ｔ细胞毒性肽ｇｌｉａ－α、ｇｌｉａ－α２、ｇｌｉａ－α９和
ｇｌｉａ－α２０的数量和分布存在基因组来源特异性，
来源于Ａ基因组的α－醇溶蛋白通常含有ｇｌｉａ－α９
和ｇｌｉａ－α２０，而没有完整的ｇｌｉａ－α、ｇｌｉａ－α２，来源于
Ｄ基因组的α－醇溶蛋白四种都可能含有或者是含
图３　ＡＡ－６与来源于普通小麦及其祖先种的８６个α－醇溶蛋白推断氨基酸的系统进化树
Ｆｉｇ．３　Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－ｊｏｉｎｉｎｇ　ｔｒｅｅ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｄｅｄｕｃｅｄ　ａｍｎｉｏ　ａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｌｏｎｅｄα－ｇｌｉａｄｉｎ
ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　８６ｏｔｈｅｒ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｇｅｎｅｓ　ｆｒｏｍ　ｃｏｍｍｏｎ　ｗｈｅａｔ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ａｎｃｅｓｔｒａｌ　ｓｐｅｃｉｅｓ
·０９３· 麦　类　作　物　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　第３２卷
有不同组合的部分毒性肽，而来源于Ｂ基因组的
α－醇溶蛋白大多数不含有任何一种 Ｔ细胞毒性
肽，少数仅含有ｇｌｉａ－α［４］。因此，可根据四种Ｔ细
胞毒性肽的分布来进行α－醇溶蛋白的基因组定
位。本实验所克隆的 ＡＡ－６基因符合 Ａ染色体
组来源的α－醇溶蛋白的毒性肽分布特点，除不含
有Ａ染色体所不具备的ｇｌｉａ－α、ｇｌｉａ－α２毒性肽外，
其他７种毒性肽均有分布。
为进一步了解α－醇溶蛋白ＣＤ毒性肽分布的
基因组差异性，对分布于α－醇溶蛋白的９种ＣＤ
毒性肽的分布频率作了统计分析（表１），结果表
明，四种主要的Ｔ细胞毒性肽的分布和数量与前
人的研究结果一致，存在明显的基因组差异
性［４，１２］。其他五种毒性肽只在分布频率上存在一
定的基因组来源差异性。相比而言，除多肽序列
ＱＮＰＳＱＱＱＰＱＥＱＶＰＬＶＱＱＱ 在 Ｂ基因组分布
的频率较高外，９种已知的ＣＤ毒性肽在Ｂ基因
组来源的α－醇溶蛋白中分布的种类和频率均相
对较低。与Ａ基因组相比，Ｄ基因组来源的α－醇
溶 蛋 白 除 ＱＬＩＰＣＭＤＶＶＬＱ 和 ＬＧＱＧＳＦＲＰ－
ＳＱＱＮ分布的频率显著较低外，其他毒性肽的分
布频率均高于或与Ａ基因组接近。
表１　９种ＣＤ毒性肽在Ａ、Ｂ、Ｄ基因组中出现的频率比较
Ｔａｂｌｅ　１　Ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ　ｏｆ　９ｋｉｎｄｓ　ｏｆ　ｋｎｏｗｎ　ＣＤ　ｅｐｉｔｏｐｓ　ｉｎ　Ａ，Ｂ　ａｎｄ　Ｄ　ｇｅｎｏｍｅ
出现区域 ＣＤ肽序列
ＣＤ肽在不同基因组出现的频率／％
Ａ基因组 Ｂ基因组 Ｄ基因组
Ｎ－重复区 ＱＮＰＳＱＱＱＰＱＥＱＶＰＬＶＱＱＱ　 ２５．８１　 ８８．２９　 ８５．７１
＊Ｐ／ＬＧＱＱＱＰＦＰＰＱＱＰＹＰＱＰＱＰＦ　 ３８．７１　 ２２．２２　 ６５．７１
＊ＰＱＰＱＰＦＰＳＱＱＰＹ　 ７４．１９　 ３３．３３　 ８８．５７
ＰＦＰＱＰＱＬＰＹ（ｇｌｉａ－α９） ８３．８７　 ０．００　 ６２．８６
ＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＬＰＹ（ｇｌｉａ－α２） ０．００　 ０．００　 ２２．８６
特征区Ｉ　 ＰＦＲＰＱＱＰＹＰＱＰＱＰＱ（ｇｌｉａ－α２０） ８３．８７　 ０．００　 ７７．１４
ＱＬＩＰＣＭＤＶＶＬＱ　 ８３．８７　 １１．１１　 ５．７１
Ｃ－特征区 ＰＳＧＱＧＳＦＱＰＳＱＱ（ｇｌｉａ－α） ０．００　 ２２．２２　 ６８．５７
＊ＬＧＱＧＳＦＲＰＳＱＱＮ　 ７７．４２　 １１．１１　 ８．５７
　　＊表示毒性肽。
３　讨 论
３．１　α－醇溶蛋白的变异、分子结构及其与功能的
关系
α－醇溶蛋白存在很多与面粉加工品质密切相
关的变异［６，１３］。Ｋｈａｔｋａｒ等［１４］通过向基础面粉中
添加总的醇溶蛋白和醇溶蛋白的不同组分（α、β、γ
和ω）来研究醇溶蛋白与小麦加工品质的关系，结
果表明，添加醇溶蛋白及其组分会显著降低面筋
强度和增大面包体积，而α－醇溶蛋白对面包体积
的增大效果最大，对面筋强度的降低最小（ω＞γ
＞β＞α）。有关α－醇溶蛋白结构与功能的关系的
研究表明，长的重复区和高的半胱胺酸数量与面
粉的加工品质呈正相关［１５－１８］。另外，高的谷氨酰
胺残基的含量对提高面筋的粘弹性也有重要影
响，因为大部分的谷氨酸盐链间的相互作用可作
为氢键的供体和受体［１９］。然而，大约 ５０％［２０］，
甚至８７％ ［４］的α－醇溶蛋白基因都是假基因，且大
多数假基因都是由于Ｃ→Ｔ碱基替换或缺失、插
入导致的移码突变所导致的。
ＧｅｎＢａｎｋ中已注册的α－醇溶蛋白基因的重
复区的长度在８２－１００个氨基酸残基之间，通常在
两个特征区还包含６个可形成三个分子内二硫键
的保守半胱氨酸残基［１４］。谷氨酰胺的比例在
４．６９％（ＡＤＡ８３６９２）到２１．７３％ （ＡＢＱ９６１１９）之
间。本研究中所克隆到的４个序列，其中３个序
列均为假基因，而所产生的终止子中，除移码突变
外，均为Ｃ→Ｔ碱基替换所导致的ＣＡＡ或ＣＡＧ
密码子变成了ＴＡＡ或ＴＡＧ终止子。ＡＡ－６基因
具有典型的α－醇溶蛋白结构，谷氨酰胺残基的含
量为１０．５８％，有６个保守的半胱氨酸残基，与已
知基因的最高相似度为９９％，为α－醇溶蛋白基因
家族的新成员。
３．２　α－醇溶蛋白的ＣＤ毒性肽分布的基因组来
源差异性
α－醇溶蛋白不仅是生活中消费量最大的蛋
白，也是诱导ＣＤ的最活跃的蛋白。且α－醇溶蛋
白的序列同源性及四种主要的 Ｔ细胞毒性肽均
存在基因组差异性。本实验所克隆的ＡＡ－６基因
中，除不含有 Ａ 基因组没有的ｇｌｉａ－α和ｇｌｉａ－α２
外，其他７种ＣＤ毒性肽均有分布。而且对已知
并进行基因定位的７５个α－醇溶蛋白的ＣＤ毒性
·１９３·第３期　　　　　　　　　李玉阁等：栽培一粒小麦α－醇溶蛋白新基因的克隆与序列分析
肽的分布类型的分布频率的分析来看，Ｂ染色体
组来源的α－醇溶蛋白的ＣＤ肽毒性无论在分布频
率还是分布频率上均相对较低，而栽培一粒小麦
（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ）和Ｄ基因组来源的α－醇溶蛋
白的ＣＤ肽毒性的分布数量和频率均较高。
３．３　系统进化分析
栽培一粒小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ，ＡＡ）
是四倍体小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ｔｕｒｇｉｄｕｍ）Ａ基因组的
供体，而关于Ｂ基因组的供体，目前还没有定论，
一般认为拟斯卑尔脱山羊草（Ａｅｇｉｌｏｐｓ　ｓｐｅｌ－
ｔｏｉｄｅｓ，Ｓ）单独或与其近亲物种，如双角山羊草
（Ａｅｇｉｌｏｐｓ　ｂｉｃｏｒｎｉｓ，Ｓｂ）或高大山羊草（Ｔｒｉｔｉｃ－
ｕｍ．ｌｏｎｇｉｓｓｉｍａ，Ｓｌ）共同提供了Ｂ基因组。栽培
一粒小麦的Ａ基因组和普通小麦的Ａ基因组，粗
山羊草的Ｄ基因组与普通小麦的Ｄ基因组亲缘
关系十分相近；但普通小麦的Ｂ基因组与二粒小
麦的Ｂ基因组虽然也很相似，但不如Ａ基因组和
Ｄ基因组的同源程度高［４，２１］。本文对所克隆基因
以及８６个来源小麦及其祖先供体种的α－醇溶蛋
白的同源性分析与前人的研究一致，α－醇溶蛋白
序列的确存在基因组特异性，且Ａ、Ｄ基因组的同
源性更高。
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·２９３· 麦　类　作　物　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　第３２卷