全 文 ：江苏农业学报(Jiang su J. of Agr. S ci. ), 2005, 21(2):102～ 105
农杆菌介导法获得草地早熟禾转 B t基因植株
佘建明 1 , 　梁流芳 2 , 　张保龙1 , 　何晓兰 1 , 　陈志一2 , 　倪万潮 1
(1.江苏省农业科学院农业生物遗传生理研究所 , 江苏 南京 210014;2.杭州白云草业研究所有限公司 ,浙江 杭州 310000)
收稿日期:2004-07-14
基金项目:江苏省农业科学院重点领域研究项目(6420301);浙江省
科学技术厅科研项目(2003C32067)
作者简介:佘建明(1945-),男,江苏苏州人 , 大学 ,研究员 ,主要从事
农业生物技术研究。
　　摘要:　以草地早熟禾品种超级伊克利成熟种子为外植体材料 , 当愈伤组织诱导培养基中琼脂的用量增加至
16 g /L时 ,诱导产生的颗粒状胚性愈伤组织占愈伤组织总数的 40%以上。愈伤组织经携带 pGBI4AB 农杆菌
LBA4404的感染和共培养后 , 在继代培养基上添加 50 m g /L筛选剂 G-418,可较好地筛选出具有卡那霉素抗性的愈
伤组织 , 进而获得具有卡那霉素抗性的再生植株。 PCR分子检测结果表明 , B t基因已导入转化植株。生物学抗虫
性鉴定结果显示 , 转 B t基因当代植株对 1 ～ 2龄棉铃虫具有不同程度的抗性。
关键词:　草地早熟禾;颗粒状胚性愈伤组织;农杆菌介导;转 B t基因植株;抗虫性
中图分类号:　S688. 4　　　文献标识码:　A　　　文章编号:　1000-4440(2005)02-0102-04
Acquirement of Bt Transgen ic P lants by Agrobacterium tumefaciens in
K entucky B luegrass(Poa pratensis L. )
SHE Jian-m ing1 , 　LIANG Liu-fang2 , 　ZHANG Bao-long1 , 　HE X iao-lan1 , 　CHEN Zhi-yi2 , 　N IW an-chao1
(1. In stitu te of Ag rob iolog ica lGenet ics and Physio logy , J iang suAcademy ofAgricu ltura lS ciences, Nanjing 210014, Ch ina; 2.HangzhouB a iyun Pratacul-
tura l In st itu te Ltd, Hangzhou 310000, Ch ina)
　　Abstrac t:　The ra te o f pe lle t embryogenic ca lli induced from ma tu re seeds o fPoa pra tensis L. cv. Tota l ec lipsew as
up to 40% by increasing agar quan tity to 16 g /L over the con tro l quantity in the callus induction m edium. Th rough
Agrobacterium-media ted transfo rma tion, the re combinan t plasm id ca rry ing B t gene andNPT Ⅱ gene was introduced in to
Poa pratensis L. A fte r infected w ith Agrobacterium tum efaciens stra in LBA4404 /pGB I4AB, 50 mg /L Geneticin (G-418)
w as added to the callus pro liferation m edium. Regene ra ted plan ts w ith kanam yc in resistance we re ob ta ined. PCR ana ly sis
confirm ed thatB t gene had been in te rgrated into the transgenic p lan.t The insect resistance bioassay showed thatB t trans-
genic plan ts had resistance to the first or second insta r larvae o fHelicoerpa arm igera.
K ey w ords:　Kentucky b lueg ra ss (Poa pratensis L. ); pelle t embryogenic ca llus; agrobac te rium-m edia tion;B t
transgenic plan t; insect resistance
　　草地早熟禾 (Poa pratensis L. )属冷季型草坪
草 ,是北美地区重要的草种之一。由于它具有色泽
美 、抗寒能力强 、耐荫 、耐修剪等优良性状 ,在中国北
方地区已被广泛种植 。但草地早熟禾易受病虫危
害 ,尤其在适宜的水肥条件下病虫害更加严重 。因
此 ,培育抗病虫的草地早熟禾植株具有重要的意义。
由于农杆菌介导法具有操作简便 ,转化插入的
DNA片段多为单拷贝 ,甲基化和基因沉默现象较少 ,
转基因植株的性状遗传稳定性好等特点 ,已被广泛运
用于双子叶植物。近几年 ,农杆菌介导法基因转化技
术已成功应用于禾谷类粮食作物和蔬菜作物[ 1] ,而在
草地早熟禾上的应用 ,迄今为止国内外仅有 2篇报
道[ 2, 3] 。为此 ,本研究试图应用农杆菌介导法将苏云
金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因(B t)导入草地早熟禾 ,
以期获得抗虫转基因工程植株。
102
1　材料与方法
1.1　供试品种与受体材料
草地早熟禾品种超级伊克利 (Poa pratensis L.
cv. Tota l eclipse)成熟种子为外植体材料;从种子诱
导产生的颗粒状胚性愈伤组织为农杆菌介导法基因
转化的受体材料 。
1.2　培养基
基本培养基主要由 MS无机盐 、B5 维生素组
成 [ 4, 5] ,并添加蔗糖 3%和琼脂条 0.8%。愈伤组织
诱导 、继代培养基为基本培养基附加 2, 4-D
2.0mg /L和 BAP 0.2 mg /L。绿苗分化培养基为基
本培养基添加 CPPU 2.00 mg /L和 NAA 0.05mg /L。
上述各种培养基均在高压灭菌前调整 pH值至 5.8。
1.3　质粒与菌株
携带 pGBI4AB的农杆菌菌株 LBA4404由中国农
业科学院生物技术研究所郭三堆先生惠赠 ,其 T-DNA
区结构示意图为:RB-Nos. P-NptⅡ-Nos. T-2E35SP-Ψ-
GFM B t-PolyA-Nos. T-35SP-Gus-Nos. T-LB。
1.4　卡那霉素抗性筛选
颗粒状胚性愈伤组织在农杆菌菌液中浸泡
2 m in后 ,与农杆菌在继代培养基上共同培养 1 ～
2 d,再分别转入含 30mg /L、 40 mg /L、 50 mg /L和
60 mg /L筛选剂 G-418的 4个愈伤组织筛选培养基
(均添加 250 mg /L羧苄青霉素和 250mg /L头孢霉
素 )上进行卡那霉素抗性筛选。
1.5　植株 DNA提取和 PCR检测
取移栽成活的抗卡那霉素再生植株的幼嫩叶
片 ,按 CTAB法[ 6]提取 DNA。 PCR扩增所用试剂购
自宝生物公司 ,其中 B t基因检测正向引物序列为
CCATACAACTGCTTGAGTAACCCDAGAAGTT;B t基
因检 测反向 引物序 列为 GGGCCCGCTGAATC-
CAACTGGAGAGGC。 PCR扩增程序为 94℃3m in,
(94 ℃ 30 s, 60 ℃ 50 s, 72 ℃ 90 s)35个循环。
1.6　抗虫性鉴定
取对照植株 (非转基因植株)和通过 PCR分子
检测确认为转基因植株的新鲜叶片 ,分别放入直径
为 9 cm的培养皿内 ,叶片两端用湿棉花包裹保湿 ,
每个培养皿中投入 10条 1 ～ 2龄棉铃虫 ,置于 26 ℃
培养室内培养 , 3 d后统计各培养皿中成活幼虫数 ,
计算幼虫校正死亡率 。幼虫校正死亡率 (%) =
[ (处理组死亡率 -对照组死亡率 ) /(100% -对照
组死亡率 )] ×100%。
2　结　果
2.1　琼脂用量对颗粒状胚性愈伤组织的诱导效果
在愈伤组织诱导培养基其它成分不变的情况
下 ,增加固化剂 ———琼脂的用量 ,可以使超级伊克利
的成熟种子诱导产生的浅黄色 、干燥 、颗粒状胚性愈
伤组织占愈伤组织诱导总数的比例显著提高 ,当琼
脂用量增至 16 g /L时 ,颗粒状胚性愈伤组织占愈伤
组织诱导总数的比例可达 40%以上(表 1)。
表 1　培养基中不同琼脂用量对颗粒状胚性愈伤组织的诱导效果
Table 1　Effect o f different agar quantity in m edium on induction ra te of pel let embryogenic ca llus
琼脂用量
Agar quan tity
(g /L)
颗粒状愈伤组织数
No. of p ellet calli
粘状愈伤组织数
No. of sticky calli
颗粒状愈伤组织数占愈伤组织诱导总数的比率
Rat io of p ellet calli to all calli induced(%)
8　　　 　3　　　　　 63 4. 5　　　　　
12 10 55 15. 4
16 28 41 40. 6
2.2　卡那霉素抗性愈伤组织的筛选
胚性愈伤组织经农杆菌感染和共培养后分别转
移到附加不同浓度 G-418的愈伤组织筛选培养基
上 ,培养 20 d, 结果表明:筛选剂 G-418 浓度为
30 mg /L、40mg /L时 ,只有 20% ～ 30%的愈伤组织
呈现棕褐色 ,筛选效果不佳;筛选剂 G-418浓度为
50 mg /L时 ,约 40%的愈伤组织呈现不同程度的棕
褐色 ,并从中选择到了外观仍保持浅黄色 、具有卡那
霉素抗性的愈伤组织 (图 1);当筛选剂 G-418浓度
为 60mg /L时 ,愈伤组织的褐化率接近 70%,获得
的抗性愈伤组织转到绿苗分化培养基上未能再生出
植株 ,表明筛选压力过大 。
2.3　PCR检测
挑选具有卡那霉素抗性的愈伤组织 ,在不附加
G-418的分化培养基上培养 ,再生出 14株植株 ,移
栽后均成活(图 2),对其中 11株的基因组 DNA进
103佘建明等:农杆菌介导法获得草地早熟禾转 B t基因植株
行 PCR扩增 ,结果显示 ,有 5株与阳性质粒的条带
一致(图 3),说明 B t基因已整合到这 5株转基因植
株的基因组中。
白色为浅黄色抗性愈伤组织;黑色为褐色非抗性愈伤组织。
Wh ite:ligh t ye llow kanam ycin-resistan t ca llus;B lack:brown non k a-
namycin-resistant callu s.
图 1　50 mg /L卡那霉素筛选的愈伤组织
F ig. 1　50 m g /L kanamycin-screened ca lli
图 2　移栽成活的具有卡那霉素抗性的再生植株
F ig. 2　Transplan ted kanam ycin-res is tant regenera ted plants
1为非转基因植株(对照); 2～ 12为具有卡那霉素抗性的植株;
13为质粒; 14为标记。
1:CK;2— 12:transgenic kanamycin-res is tan t p lan ts;13:pGBI4AB;
14:m ark er.
图 3　具有卡那霉素抗性植株的 PCR检测
F ig. 3　PCR assay o f transgen ic kanam ycin-resistan t plants
2.4　转基因植株的抗虫性鉴定
采用室内人工饲喂棉铃虫对 5株转基因当代植
株进行抗虫性鉴定 ,结果显示:饲喂 3 d后 ,转基因
植株的叶片受损轻微 ,而非转基因植株叶片的叶肉
则被耗尽;转 B t基因植株对 1 ～ 2龄棉铃虫均具有
抗性 ,其中用转基因植株 6号饲喂的棉铃虫幼虫校
正死亡率高达 70%以上(表 2)。
3　讨　论
柴宝峰等指出 ,影响草地早熟禾农杆菌介导法
转基因效率的主要因素是愈伤组织的胚性 、光照条
件 、共转化时间 、抗生素浓度和选择压力 [ 2] 。我们
认为草地早熟禾农杆菌介导法转基因成败的关键因
表 2　转基因当代植株对棉铃虫的抗性
Table 2　Resistance toH elicoerpa arm igerm in the transgen ic plants(T0)
植株
Code of p lant
处理虫数
No. of larvae tested
平均存活虫数
No. of su rvival larvae
幼虫校正死亡率
Correctedm orta li ty (%)
转基因植株 5号
T ran sgenic p lan t no. 5
10 6. 0 39. 95
转基因植株 6号
T ran sgenic p lan t no. 6
10 2. 7 72. 95
转基因植株 10号
T ran sgenic p lan t no. 10
10 4. 0 59. 95
转基因植株 11号
T ran sgenic p lan t no. 11
10 5. 7 42. 95
转基因植株 12号
T ran sgenic p lan t no. 12
10 5. 3 46. 95
非转基因植株(对照)
Non-tran sgenic p lan t (CK)
10 9. 5 -
104 江 苏 农 业 学 报 　2005年 第 21 卷 第 2期
子在于建立适宜的转基因受体系统。国内外学者通
过对愈伤组织诱导培养基添加无机盐和有机化合
物 、调整不同外源激素种类及配比 ,从草地早熟禾种
子诱导出胚性愈伤组织[ 2, 7 ～ 12] ,但这些胚性愈伤组
织大多数呈半透明 、粘状结构 ,绿苗分化率偏低 ,且
经过继代培养后植株再生频率显著下降 ,从而影响
草地早熟禾转基因研究工作的进行。在我们的前期
工作中 ,通过外源激素调控仅获得少量颗粒状愈伤
组织 ,但这些愈伤组织在继代培养过程中 ,大多数始
终保持颗粒状结构 ,经过连续 3代继代培养 ,绿苗分
化率仍保持 30%左右 [ 13] 。本研究采用增加愈伤组
织诱导培养基中固化剂———琼脂的用量即培养基渗
透压调控技术 ,草地早熟禾超级伊克利成熟种子诱
导产生的浅黄色 、干燥 、颗粒状胚性愈伤组织占到愈
伤组织总数的 40%以上 ,这些颗粒状愈伤组织在继
代培养过程中保持较高的植株再生频率。由此可
见 ,培养基渗透压调控技术为开展草地早熟禾农杆
菌介导法转基因工作提供了必要的条件。
参考文献:
[ 1] 　佘建明 ,何晓兰 ,蔡小宁 ,等. 转 CpTI基因不结球白菜的抗虫
性表现 [ J] .江苏农业学报 , 2004, 20(4):230～ 232.
[ 2] 　Chai BF, Liang AH , W angW , et a l. Agrob acterium-m ediated
tran sform ation ofKentucky B luegrass[ J] . Acta Botan ica S inica,
2003, 45(8):966～ 973.
[ 3] 　佘建明 ,张保龙 ,陈志一 ,等.草地早熟禾农杆菌介导法基因转
化条件研究 [ J] .草地学报 , 2005, 13(1):39～ 42.
[ 4] 　M urashige T, Sk oog F. A revised m ed ium from rap id g row th and
b ioassaysw ith tobacco tissu e cu ltures[ J] . Physiol Plan t, 1962,
15:473～ 497.
[ 5] 　Gam borg OL, M iller RA , O jima K. Nu trient requ irem en ts of su s-
pens ion cu ltures of soybean root cells[ J] . Exp C ell Res, 1968,
50:151～ 158.
[ 6] 　Pich U, S chubert I. M in ip rep m ethod for isolation of DNA from
p lan tsw ith a high con tent of polyphenolics[ J] . Nucleic Acid sRe-
search, 1993, 21(14):28 ～ 33.
[ 7] 　B oyd LA , D ale PJ. C allu s p roduction and p lan t regeneration from
m atu re em bryos of Poa pratensis L. [ J] . P lan t B reed ing, 1986,
97:246～ 254.
[ 8] 　Griff ia JD , D ibb le MS. H igh-frequency p lan t regeneration from
seed-derived cal lus cu ltu res ofK en tucky B luegrass (Poa pra ten sis
L. )[ J] . P lan tC ell Reports, 1995, 14:721～ 724.
[ 9] 　M cDonnell RE, C onger BV. Ca llus induction and p lan tlet form a-
tion from m ature em bryo exp lants ofK en tucky B luegrass[ J] . C rop
Sci, 1984, 24:573～ 578.
[ 10] N ielsen KA, Knudsen E. Regeneration of g reen p lan ts from em-
bryogenic suspension cu ltu res ofK en tucky B lueg rass (Poa praten-
sis L. )[ J] . J P lan t Physiol, 1993, 141:589～ 595.
[ 11] Ke S, Lee CW. Plan t regeneration in Ken tucky B luegrass (Poa
pra ten sis L. )via coleopt ile tissue cu ltu res[ J] . P lan tC ellReports,
1996, 15:882～ 887.
[ 12] 马忠华 ,张云芳 ,徐传祥 ,等.早熟禾的组织培养和基因枪介导
的基因转化体系的初步建立 [ J] . 复旦学报(自然科学版 ),
1999, 38(5):540～ 544.
[ 13] 佘建明 ,张保龙 ,陈志一 ,等.草地早熟禾成熟胚离体培养植株
再生技术的研究 [ J] .草地学报 , 2003, 11(1):58 ～ 62.
105佘建明等:农杆菌介导法获得草地早熟禾转 B t基因植株