全 文 ：第 34 卷 第 4 期 青 海 医 学 院 学 报 Vol． 34 No． 4
2013 年 JOUＲNAL OF QINGHAI MEDICAL COLLEGE 2013
常炜(1976 ～)，女，汉族，青海籍，主管药师
青海地区五脉绿绒蒿总黄酮含量测定参数
及测定条件设定
常 炜，刘亚蓉
(青海省食品药品检验所，西宁 810016)
摘 要 目的 通过对青海地区五脉绿绒蒿总黄酮含量测定参数及测定条件的比较研究，确
立适用于高海拔试验条件下绿绒蒿属药材中总黄酮含量的测定参数。方法 采用单因素考察法对
样品提取溶剂、水解酸液的浓度、时间进行了考察，对 HPLC法测定五脉绿绒蒿药材中槲皮素、山奈
素、异鼠李素的总含量的色谱系统进行了比较研究。结果 70%甲醇为提取溶剂提取率较高，盐酸
－70%甲醇(5:25)水解 1 h 时酸水解率高。槲皮素、山奈素、异鼠李素 3 种成分进样量分别在
0． 026 ～ 0． 26 μg、0． 0177 ～ 0． 177 μg、0． 0053 ～ 0． 053 μg 范围内呈良好的线性关系，相关系数均为
0． 9999。平均加样回收率(n = 9)分别为 97． 61%、97． 37%、97． 34%。测得青海产 5 批五脉绿绒蒿
总黄酮含量在 0． 513 ～ 1． 271 mg﹒ g －1之间。结论 本研究确定的总黄酮的含量测定参数及测定
条件能够准确测定绿绒蒿属药材中总黄酮含量，与原标准相比能够更好地反映高原地区绿绒蒿药
材的整体质量。
关键词 高原 五脉绿绒蒿 总黄酮 高效液相 参数
中图分类号 Ｒ927． 11 文献标识码 A
SETTING THE PAＲAMETEＲS AND CONDITIONS FOＲ
DETEＲMINATION OF TOTAL FLAVONOID OF
Meconopsis quintuplinervia IN QINGHAI
Chang Wei ，Liu Yarong
(Qinghai institute for Food and Drug control，Xining 810016)
Abstract Objective By comparing the parameters and conditions of the determination of total flavonoid of
Meconopsis quintuplinervia in Qinghai，set the parameters for determination of total flavonoid of medicinal herbs of
MeconoPsis which is applied in high altitude laboratory．Methods Investigated the extraction solvent，content of hy-
drolysis acid and reaction time with single factor exploration． Comparative study was carried on chromatographic sys-
tem for determination of total content of quercetin，kaempferide，isorhamnetin of Meconopsis quintuplinervia by
HPLC． Ｒesults The extraction rate of 70% methanol was higher，and the hydrolysis rate of HCL － 70% methanol
(5:25)was higher as well． Good linearity was obtained for quercetin，kaempferide and isorhamnetin with injection
quantity 0． 026 ～ 0． 26 μg，0． 0177 ～ 0． 177 μg and 0． 0053 ～ 0． 053 μg，respectively，with a correlation coefficient
Ｒ = 0． 9999． The average spiked recovery is 97． 61%，97． 37%，97． 34%，respectively． Total flavonoids of 5 batches
182
of Meconopsis quintuplinervia in Qinghai ranged from0． 513 mg /g to 1． 271 mg /g． Conclusion The determination
parameters and conditions setting in this paper is able to accurately determine the total flavonoid of MeconoPsis．
Compared with previous specification，it can better reflect the overall quality of medicinal herbs of MeconoPsis in
plateau．
Keywords Plateau Meconopsis quintuplinervia Total flavonoid HPLC Parameters
五脉绿绒蒿为罂粟科植物五脉绿绒蒿 Meconap-
sis quintuplinervia Ｒegel 的干燥全草，自古以来就为
藏族习惯用药［1 － 3］，我国《卫生部药品标准》藏药分
册有收载。现有三十多个藏药制剂中使用到五脉绿
绒蒿，但《卫生部药品标准》藏药分册对其质量的控
制不全面，仅性状一项内容，无法对其质量优劣进行
控制。有文献报道绿绒蒿属植物主要起到抗炎和镇
痛作用的部位为总生物碱与总黄酮［4］，因此我们参
照有关文献［5］对其总黄酮含量进行了测定方法的
研究。结果表明，文献报道的总黄酮测定参数并不
完全适用于高原地区的试验条件，我们最终优选确
定的总黄酮的含量测定参数能够准确地测定绿绒蒿
属药材中总黄酮的含量，与原标准相比能够较好地
反映高原地区绿绒蒿药材的质量。
1 仪器与试药
1． 1 仪器
高效液相色谱色谱仪(美国 Waters2695，2487
二极管阵列检测器);Milli － QA 超纯水器(瑞士
Millipore);B2500s － MT超声波清洗器(上海必能信
超声波清洗仪有限公司)。
1． 2 试药
槲皮素对照品(批号 100081 － 200406 中国药品
生物制品检定所，含量测定用);山奈素对照品(批
号 110861 － 200405，中国药品生物制品检定所，含
量测定用);异鼠李素对照品(批号 110860 －
200407，中国药品生物制品检定所，含量测定用)。
甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为重
蒸馏水。
1． 3 样品
5 批样品均经青海省食品药品检验所鉴定，为
五脉绿绒蒿 Meconapsis quintuplinervia Ｒegel的干燥
全草。见表 1。
表 1 样品
Table 1 Sample
编号 采、收集地 海拔
1 黄南州泽库县麦秀山 3560 m
2 海南州贵南县森多乡姊妹山 4600 m
3 门源大坂山 3921 m
4 青海省河南县 3567 m
5 兴海县 3406 m
2 实验条件
2． 1 提取溶剂的选择
根据文献报道［5 － 9］分别采用下表溶剂对同一批
样品回流提取后盐酸水解物进行提取和测定，比较
几种方法对溶剂的提取率。实验结果显示，70%甲
醇回流提取后所测指标量最高，因此选择 70%甲醇
为提取溶剂。见表 2。
表 2 不同提取溶剂提取率
Table 2 The extraction rate of different extraction solvent
提取溶剂 95%的乙醇 甲醇 乙酸乙酯 70%甲醇
样品中槲皮素的含量 mg·g －1 0． 382 0． 411 0． 314 0． 523
2． 2 水解盐酸浓度考察
五脉绿绒蒿药材中除游离槲黄酮类成分外，大
多黄酮类是以苷的形式存在，因此供试品制备过程
中采用盐酸水解将黄酮苷水解成苷元，这样测定总
282
黄酮的含量更准确。水解条件的控制极为重要，因
此我们选取同一批样品，采用单因素考察法对水解
的酸浓度和水解时间进行了筛选 。
分别取用药材细粉约 1． 0 g，精密称定，置具塞
锥形瓶中，精密加入 70%甲醇 50 mL，加热回流1 h，
放冷，再称定重量，用 70%甲醇补足减失的重量，摇
匀，滤过，精密量取续滤液 25 mL，置具塞锥形瓶中，
分别加盐酸 1、3、5、7、9 mL，加热回流水解0． 5 h，立
即冷却，移至 50 mL 量瓶中，用适量 70%甲醇洗涤
容器，洗液并入同一量瓶中，加 70%甲醇至刻度，摇
匀，滤过，测定槲皮素值。结果显示，加入 5 mL盐酸
水解最为合适。见表 3。
表 3 不同水解盐酸浓度提取率
Table 3 The extraction solvent of different hydrochloric acid concentration
盐酸 － 70%甲醇比例 1:25 3:25 5:25 7:25 9:25
样品中槲皮素的含量 mg·g －1 0． 467 0． 501 0． 523 0． 521 0． 514
2． 3 水解时间的考察
分别取用药材细粉约 1． 0 g，精密称定，置具塞
锥形瓶中，精密加入 70%甲醇 50 mL，加热回流 1 h，
放冷，再称定重量，用 70%甲醇补足减失的重量，摇
匀，滤过，精密量取续滤液 25 mL，置具塞锥形瓶中，
分别加盐酸 5 mL，加热回流水解 0． 5、1． 0、1． 5、2． 0、
2． 5 h，立即冷却，移至 50 mL量瓶中，用适量 70%甲
醇洗涤容器，洗液并入同一量瓶中，加 70%甲醇至
刻度，摇匀，滤过，测定槲皮素值。结果显示，水解
1 h最为合适。见表 4。
表 4 不同水解时间提取率
Table 4 The extraction solvent of differdnt hydrolysis time
水解时间(h) 0． 5 1 1． 5 2 2． 5
样品中槲皮素的含量 mg·g －1 0． 366 0． 524 0． 523 0． 527 0． 525
2． 4 检测波长的选择
由 3 种待测成分的 DAD 光谱图可知，槲皮素、
山奈素、异鼠李素均在 256 nm 和 364 nm 处有最大
吸收波长，其中 364nm 波长处吸收强度较大，故最
终确定在 360 nm处检测。
2． 5 流动相的选择
查阅有关文献［5 － 9］对流动相进行了筛选，选择
分离效果最好的流动相系统，结果见表 5、图 1。实
验结果显示，以甲醇 － 0． 4% 磷酸溶液 － 乙腈
(40:60:5)等度洗脱能取得较好的分离效果。
2． 6 色谱柱温度的选择
由于青海省海拔较高，昼夜温差较大，故对色谱
柱的温度进行恒温控制对于样品的测定结果有较大
影响。本研究设定在 20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃对样
品进行测定，结果显示，柱温在 30 ℃时，各色谱峰分
离较好，保留时间较为合适。
2． 7 色谱柱的选择
根据文献报道［5 － 10］，比较几种常用色谱柱的分
离效果。实验结果显示，四种色谱柱分离度均能达
到中国药典相关要求。见表 6。
表 5 不同流动相下的分离效果
Table 5 The separation effect of different mobile phase
编号 流动相
1 乙腈 － 0． 1%磷酸溶液(45:55)
2 甲醇 － 1%冰醋酸溶液(40:60)
3 乙腈 －甲醇 －四氢呋喃 － 0． 5%冰醋酸溶液(40:5:55)
4 甲醇 － 0． 4%磷酸溶液(30:70)
5 甲醇 － 0． 4%磷酸溶液 －乙腈(40:60:5)
382
图 1 流动相 HPLC谱图
Figure 1 The HPLC chromatogram of different mobile phase
表 6 不同色谱柱下的分离效果
Table 6 The separation effect of different chromatographic column
色谱柱型号 分离度
ZorbaxμExtend C18柱 ≥1． 5
Hypersil ODS2 柱 ≥1． 5
Acquity UPLC BEH C18柱 ≥1． 5
Dikma TechnologiesSunfire C18柱 ≥1． 5
3 实验方法与结果
3． 1 分析溶液的制备
3． 1． 1 混合对照品溶液制备
分别精密称取对照品槲皮素 12． 94 mg、山奈素
5． 89 mg、异鼠李素 5． 28 mg，分别置于 100 mL 量瓶
中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，分别制成槲皮
素对照品溶液(0． 1294mg·mL －1)、山奈素对照品溶
液(0． 0589mg· mL －1)、异鼠李素对照品溶液
(0． 0528mg·mL －1);再分别精密吸取 3 种对照品溶
液 1． 0、1． 5、0． 5 mL置于同一 10 mL量瓶中，用甲醇
稀释至刻度，制成每 1 mL 含槲皮素 12． 94 μg、山奈
素 8． 84 μg、异鼠李素 2． 64 μg的混合对照品溶液。
3． 1． 2 供试品溶液制备
取用药材细粉约 1． 0 g，精密称定，置具塞锥形
瓶中，精密加入 70%甲醇 50 mL，加热回流 1 h，放
冷，再称定重量，用 70%甲醇补足减失的重量，摇
匀，滤过，精密量取续滤液 25 mL，置具塞锥形瓶中，
加盐酸 5 mL，加热回流水解 1 h，立即冷却，移至
50 mL量瓶中，用适量 70%甲醇洗涤容器，洗液并入
同一量瓶中，加 70%甲醇至刻度，摇匀，滤过，即得。
进样量 10 μL。在此色谱条件下 3 种对照品以
槲皮素峰计，理论塔板数大于 3500。绿绒蒿样品的
482
色谱分离结果见图 2。可见样品中黄酮类化合物分 离良好。
1．槲皮素(quercetin) 2．山奈素(kaempferide) 3．异鼠李素(isorhamnetin)
图 2 对照品(A)及样品(B)HPLC图
Figure 2 The HPLC chromatogram of reference substance(A)and sample(B)
3． 2 分析方法及实验
3． 2． 1 线性关系考察
精密吸取混合对照品溶液 2、4、8、12、16、
20 μL，按上述条件分别注入色谱仪测定，3 种成分
均以进样量 X(μg)为横坐标，峰面积 Y 为纵坐标进
行线性回归，结果见表 7。
表 7 线性关系
Table 7 linear relationship
组分 回归方程 相关系数 线性范围(μg)
槲皮素 Y =52007X + 1401． 3 0． 9999 0． 026 ～ 0． 26
山奈素 Y =33104X － 5910． 3 0． 9999 0． 0177 ～ 0． 177
异鼠李素 Y =11071X － 4587． 3 0． 9999 0． 0053 ～ 0． 053
582
3． 2． 2 精密度考察
精密吸取上述混合对照品溶液 10 μL，重复进
样 5 次，测定峰面积。结果表明精密度良好。见表
8。
表 8 精密度
Table 8 Precision
组分 槲皮素 山奈素 异鼠李素
ＲSD% 1． 01 1． 26 1． 54
3． 2． 3 稳定性试验
取供试品溶液分别在 0、2、6、9、12、16 h 进样，
测定峰面积，结果槲皮素、山奈素、异鼠李素峰面积
ＲSD分别为 1． 45%、1． 58%、1． 97%。结果表明，供
试品溶液在 16 h内稳定。
3． 2． 4 重复性试验
分别称 1 号样品 5 份，按“3． 1． 2”项下方法制
备供试品溶 5 份，进样 10 μL，测定峰面积，连续进
样 2 次，计算槲皮素、山奈素、异鼠李素含量的平均
值及 ＲSD。结果表明，试验重复性良好。见表 9。
表 9 重复性试验
Table 9 Ｒepeatability experiment
组分 平均含量(mg·g －1) ＲSD(%)
槲皮素 0． 523 1． 11
山奈素 0． 523 1． 49
异鼠李素 0． 111 1． 84
3． 2． 5 回收率试验
精密称取 1 号样品粉末 0． 5 g，共 9 份，平均分
为 3 组，每组分别加入“3． 1． 1”项下槲皮素对照品
溶液(0． 1294mg·mL －1)1． 5、2． 0、2． 5 mL，山奈素
对照品溶液(0． 0589mg·mL －1)2． 0、2． 5、3． 0 mL，
异鼠李素对照品溶液(0． 0528mg·mL －1)0． 8、1． 0、
1． 2 mL，按“3． 1． 2”项下方法制备溶液，进样测定，
计算平均回收率，结果见表 10。
表 10 加样回收率结果
Table 10 The result of sample recovery rate experiment
检测成分 原有量(mg) 加入量(mg) 测定量值(mg) 回收率(%) 平均回收率(%) ＲSD(%)
槲皮素 0． 262 0． 194 0． 439 96． 24
0． 262 0． 194 0． 441 96． 72
0． 268 0． 194 0． 452 97． 85
0． 261 0． 259 0． 515 99． 01 97． 61 1． 13
0． 267 0． 259 0． 507 96． 33
0． 261 0． 259 0． 511 98． 31
0． 263 0． 324 0． 568 96． 78
0． 268 0． 324 0． 581 98． 20
0． 261 0． 324 0． 579 98． 99
山奈素 0． 141 0． 118 0． 249 96． 01
682
续表:
检测成分 原有量(mg) 加入量(mg) 测定量值(mg) 回收率(%) 平均回收率(%) ＲSD(%)
0． 141 0． 118 0． 251 96． 82
0． 144 0． 118 0． 261 99． 44
0． 141 0． 148 0． 278 96． 26 97． 37 1． 08
0． 144 0． 148 0． 286 97． 90
0． 141 0． 148 0． 279 96． 67
0． 142 0． 177 0． 312 97． 80
0． 145 0． 177 0． 314 97． 64
0． 141 0． 177 0． 311 97． 82
异鼠李素 0． 056 0． 0422 0． 095 97． 10
0． 056 0． 0422 0． 094 96． 11
0． 057 0． 0422 0． 096 96． 91
0． 055 0． 053 0． 105 96． 84 97． 34 0． 73
0． 057 0． 053 0． 107 97． 51
0． 055 0． 053 0． 106 97． 84
0． 056 0． 0634 0． 116 97． 23
0． 057 0． 0634 0． 118 98． 08
0． 055 0． 0634 0． 117 98． 42
3． 3 样品测定结果
分别精密称取 5 批绿绒蒿样品，按“3． 1． 2”项
下方法制备供试品溶液，进样，测定色谱峰面积，计
算含量，结果见表 11。
表 11 样品测定结果
Table 11 The determination result of samples
编号 采收集地 海拔
槲皮素
(mg·g －1)
山奈素
(mg·g －1)
异鼠李素
(mg·g －1)
总黄酮
(mg·g －1)
1 黄南州泽库县麦秀山 3760 m 0． 523 0． 282 0． 111 0． 916
2 海南州贵南县森多乡姊妹山 4600 m 0． 652 0． 394 0． 225 1． 271
3 门源大坂山 3921 m 0． 534 0． 292 0． 143 0． 969
4 河南县 3567 m 0． 284 0． 143 0． 086 0． 513
5 兴海县 4206 m 0． 597 0． 346 0． 203 1． 146
782
4 讨论
4． 1 曾有文献报道五脉绿绒蒿中槲皮素的含量测
定［8］结果显示，方法并不适用于高原地区的实验条
件，因此我们将测定条件重新进行了考察，并增加了
山奈素和异鼠李素的含量测定。经方法学验证，我
们新确定的试验方法简便、准确，为高原地区不同种
绿绒蒿的科学使用提供了试验依据，与原标准相比
能够较好地反映高原地区绿绒蒿药材的质量。
4． 2 按照本研究确立的试验条件，测定了 3 批收集
自药材市场的全缘绿绒蒿及 3 批多刺绿绒蒿，结果
3 批全缘绿绒蒿总黄酮平均含量为 0． 868 mg·g －1，
3 批多刺绿绒蒿的平均含量为 0． 667 mg·g －1。表
明此方法也适用于其他绿绒蒿属药材中总黄酮的测
定。
4． 3 采自青海省境内的 5 批五脉绿绒蒿总黄酮含
量结果显示，海拔越高总黄酮含量越高。因为采集
样品批数有限，本文结果并不能完全代表绿绒蒿总
黄酮含量与海拔成正相关。
4． 4 试验前期试验组为实地采集五脉绿绒蒿植物
标本曾赴青海省主要产地果洛州、黄南州、海南州、
海东地区进行样品采集，还先后与甘肃省、西藏自治
区等绿绒蒿产区相关人员联系，结果仅采集到 5 批
样品。绿绒蒿属植物由于分布区域狭窄，同时又具
有较高经济价值，因而面临来自自然和人为因素的
威胁，资源极为匮乏，但目前仍未引起足够重视。合
理开发和保护此类植物的生境和种质资源已迫在眉
睫，建议有关部门应尽快制定相关检测标准推行人
工引种。
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收稿日期 2012 － 04 － 07
882