全 文 ：收稿日期:2007-02-10;修回日期:2007-05-16
基金项目:国家自然科学基金(30200023)
作者简介:唐铭霞(1982-),女,硕士 ,从事分子生物学研究.
通讯作者:王丽.E-mail:yz xj@vip.163.com
文章编号:　0490-6756(2008)02-0402-07
黑籽重楼种内 AFLP遗传多样性
及遗传分化研究
唐铭霞 , 王　丽 , 翁　周
(四川大学生命科学学院 , 成都 610064)
摘　要:以四川瓦屋山 、峨眉山和彭州 3个地区的黑籽重楼原变种居群及峨眉山 、彭州 2个地
区的无瓣黑籽居群为供试材料 ,用筛选出的 4对引物 ,对 5个群体共计 74 个个体进行 AFLP
分析 ,每对 AFLP 引物扩增出 61 ～ 78条多态带 ,共得到 235条多态带.黑籽重楼遗传多样性较
高 ,物种水平的多态带百分率 PPB 为 81.88%,Nei s 基因多样性指数 H 为 0.2490 ,Shannon
多样性指数 I 为 0.3867 ,居群间基因流为 1.6870;在变种水平上 ,黑籽重楼原变种 PPB 为
78.40%, Nei s基因多样性指数 H 为 0.2849 ,Shannon多样性指数 I 为 0.4237;无瓣黑籽的
PPB为 63.07%,Shannon 多样性指数 I 为 0.3603 ,Nei s 基因多样性指数 H 为 0.2439.黑籽
重楼种下的两个变种间的遗传分化系数 Gst为 0.0726 ,遗传分化指数 PHIst为 13.33%.聚类
结果无瓣黑籽重楼和黑籽重楼原变种分别分成两支.总而言之 ,黑籽重楼物种水平上有丰富的
遗传多样性 ,居群内遗传分化大于居群间 ,居群间的相似性系数很大 ,但种下的两个变种间有
一定的遗传分化.
关键词:黑籽重楼;无瓣黑籽;AFLP ;遗传分化;遗传多样性
中图分类号:Q949　　　文献标识码:A
AFLP analysis on genetic diversity and differentation of Paris thibetica
TANG Ming-Xia , WANG Li , WENG Zhou
(College of Life sciences , Sichuan University , Chengdu 610064 , China)
Abstract:AFLP was utilized to screen fo r genetic variation within Paris thibet ica .AFLP analy sis using 4
pairs of AFLP primers w as carried out on 74 dif ferent samples f rom f ive populations of Paris thibet ica located
at EMEI Mountain , WAWU Mountain , and Pengzhou in Sichuan Province.Each primer pair produced 61 ～
78 bands , and a to tal of 287 discernible DNA fragments w ere generated w ith 235 polymo rphic bands
(81.88%).In species level , the percentage of polymorphic bands(PPB)was 81.88%;Shannon s informa-
tion index (I)was 0.3867.Nei s genetic diversi ty was 0.2490.Gene f low (Nm)was high (1.6870).The
genetic identities betw een populations were similar (IN=0.8877 ～ 0.9410).Genetic differentiat ion(Gst)a-
mong 5 populations detected by Nei s genetic diversity analysis w as 0.2286.At variety level , the estimates of
P .thibetica var.thibetica were PPB=78.40%, H=0.2849 , I=0.4273 , and the estimates of P .thibetica
var.apetala were PPB=63.07%, H=0.2439 , I=0.3603.As fo r P .thibetica , genetic differentiation co-
efficient among varieties(Gst)was 0.0726.According to the UPGMA cluster analy sis , the differentiation of
2008年 4月 　
第 45卷第 2期　
四川大学学报(自然科学版)
Journal of Sichuan University (Natural Science Edit ion)
　 Apr.2008
Vol.45　No.2
2 varieties were signif icant.Tw o varieties of Paris thibetica were divided into tw o g roups in the of Got and
PHIst dendrog ram , in which.Samples f rom the same population and varieties mostly clustered in the same
cluster.But the result indicated that there w ere relatively low genetic differentiation among the tw o varieties ,
but high genetic diversity in species level.
Key words:Paris thibetica var.thibetica , Paris thibetica var.apetala ,AFLP , genetic dif ferentiation , ge-
netic diversity
1　引　言
重楼(Paris)是百合科(Lilliaceae)一类多年生
的草本植物 ,中国有重楼属植物22种[ 1] ,以西南各
省区为多[ 2] .重楼属由于属内不同类群内在某些
形态上存在较大变异 ,而不同类群间形态性状的进
化速度又不同步 , 这给重楼的属下分类增加了困
难.Hara把重楼属植物分为 7个种 ,将大多数种归
于多叶重楼(Paris polyphyl la)的变种或变型 ,
Takhtajan则把重楼属植物分为 20个种 ,并将多叶
重楼的许多变种独立成种 , 如华重楼(P .poly-
phyl la var.chinensis),滇重楼(P.polyphy lla var.
yunnanensis)等[ 3 , 4] ,而在李恒系统中 ,重楼属植物
有 24种.因此 ,研究重楼的遗传分化对重楼属植物
的系统分类具有重要意义.
目前重楼属植物的种级水平的研究已经较为
全面 ,而种下水平研究的较多地仅为多叶重楼 ,对
黑籽重楼种下 2个变种的遗传多样性和遗传分化
尚无报道[ 5 ,6] .黑籽重楼种下有 2 变种无瓣黑籽
(Paris thibetica var.apetala)与原变种(Paris thi-
bet ica var.thibet ica),主要分布于西藏东南部 、云
南西北部 、四川 、甘肃南部 、贵州 、不丹和锡金.黑籽
重楼在重楼各分类系统中是争议较多的一个种 ,
Hara认为黑籽重楼是多叶重楼种下的一个变种
(P.polyphylla var.thibetica),而 Takhtajan 认为
黑籽重楼应该命名为 Daiswa thibetica ,而非多叶
重楼种下变种.但有关于黑籽重楼种下水平的研究
也主要在形态分类 、核型分析 、孢粉学 ,目前还没有
分子水平的研究结果来支持现行的分类[ 7 ,8] .
AFLP(Amplified Fragment Length Polymor-
phism)是结 合了 RFLP (Restriction Fragment
Leng th Polymorphism)和 RAPD 的优点一种检验
DNA 多态性的新方法[ 9] .如多态性丰富 、不受环境
影响 、用量小 、灵敏度高 、快速高效 ,因此被广泛用
于遗传多样性研究[ 10] .AFLP 分析可获得基因组
大量的遗传信息 ,并显示较多的多态带 ,特别是对
种下水平的研究来说是较为合适的分子标记[ 11] .
目前 ,已利用 AFLP 技术对蒙古栎(Quercus mon-
golica)、丹参(Salv ia m ilt iorrhiza)、龙舌兰(A-
gave tequilana)等植物群体遗传结构与种间 、种内
遗传多样性进行了研究[ 12-14] .
本研究采用 AFLP 分子标记技术进行黑籽重
楼的遗传多样性和遗传分化分析 ,旨在了解黑籽重
楼种内的遗传变异水平 ,并通过聚类分析 ,对黑籽
重楼 2变种五个居群的 74个个体进行了聚类 ,从
而更清楚地认识这黑籽重楼种内的遗传多样性差
异.
2　材料和方法
2.1　供试材料
74份重楼样品于 2006年 4 ～ 6月采集于我国
重楼主要分布区四川 (表 1).叶片均用硅胶干燥.
由王丽教授鉴定 ,凭证标本藏于四川大学生命科学
学院植物标本室.
表 1　供试材料
Tab.1　Test materials
　　居群编号 分类群 来源 海拔(m) 取样数(个)
1 P.thibetica var.th ibet ica 四川 彭州 1550～ 2560 15
2 P.thibetica var.th ibet ica 四川峨眉山 1680～ 2860 15
3 P.thibetica var.th ibet ica 四川瓦屋山 1500～ 2600 15
4 P.thibet ica var.apetala 四川峨眉山 2070～ 2860 15
5 P.thibet ica var.apetala 四川 彭州 2100～ 3000 14
403第 2期 唐铭霞等:黑籽重楼种内AFLP 遗传多样性及遗传分化研究 　
2.2　基因组 DNA提取
选取干燥重楼叶 ,参照邹喻萍等[ 15] 的 CTAB
法提取重楼基因组 DNA.通过 1%琼脂糖凝胶电
泳检测 DNA浓度和纯度 ,置于-20 ℃冰箱内保存
备用.
2.3　AFLP分析
AFLP 分析参照 Vos和张瑞的方法[ 16] .EcoR
Ⅰ和 Mse Ⅰ限制性内切酶由FERMENTAS(MBI)
公司生产 ,接头和引物由赛百盛公司合成 ,dN TP 、
Taq聚合酶以及 T4 DNA 连接酶由 Takara公司生
产.
2.4　数据收集 、处理方法
AFLP显带的记录方法为:记录胶片上清晰的
200 ～ 1000 bp 之间的条带 ,针对某一具多态性位
点而言 , `有 记作`1 , `无 记作`0 ,只记载清晰易
辨的扩增带 ,将 4对选择性扩增引物产生的 DNA
扩增带数据输入到数据矩阵.所有记录的数据均录
入计算机并计算频率 、方差和变异系数等.采用
POPGENE 分析软件对两个变种分别进行遗传参
数分析[ 17] .分别计算了多态位点百分率(PPB ,
percentage of polymorphic bands)、Nei s 基因多样
性(H)、Shannon s多样性信息指数(I)、两个种的
总遗传多样性(Ht , total genetic diversi ty)、种内遗
传多样性(Hs , genet ic diversity w ithin pulation)、
各变种间的遗传分化指数(Gst , coeff icient of pop-
ulation dif ferentiation)、基因流(Nm , the level of
gene f low)、Nei s 遗传多样性(H).分子方差分析
方法(Analysis of Molecular Variance , AMOVA)用
来分析重楼种内的分子变异[ 18] .用 NTSYS 2.11
版软件计算样品间 Jaccard 遗传相似系数 ,并用
SAHN Clustering 进行不加权成对算术平均法
(UPGMA)聚类分析.
3　结果与分析
3.1　AFLP选择性扩增结果
根据建立的重楼 AFLP 分析体系 ,从 49 对引
物组合中筛选出 4对多态性高 、条带分布均匀 、易
于识别的选择性引物 ,扩增图谱见图 1.
图 1　引物 E-AGG/M-CAT 扩增图谱
Fig.1　AFLP fingerprinting patterns of P.thibetica var.thibetica and P.thibetica var.apetala using the primer
pairs o f E-AGG and M-CAT
　　对 5个居群的 74个 DNA样品进行了 PCR扩
增 ,选取 200 ～ 1000 bp之间的清晰可见的带进行
统计 ,共扩增产生了 287条可统计的条带 ,平均每
条引物可扩增出 71.75条带(表 2).其中具多态性
的条带有 235条 ,占 81.88%.4对引物扩增出黑籽
重楼种下的两个变种的特征带 3条 ,其中无瓣黑籽
有 1条特征带 ,其片断大小约为 550 bp ,黑籽重楼
原变种有特征带 2条 ,其片断大小分别为 450 bp 、
700 bp.5 个个居群的个体间均无其各自的特征
带.这些特征带可区分黑籽重楼原变种和无瓣黑
籽.
表 2　不同引物的扩增结果
Tab.2　Number of bands generated by
primer combinations
引物组合 总条带数(条)
多态带数
(条)
多态带
百分率(%)
E-AGG/M-CAT 61 52 85.25
E-AGG/M-CAC 75 67 89.33
E-AAC/M-CAC 73 65 89.04
E-ACC/M-CTG 78 46 58.97
合计 287 235
平均 71.75 58.75 81.88
404 四川大学学报(自然科学版) 第 45卷
3.2　遗传多样性
从表 3可以看出 ,在黑籽重楼物种水平上多态
性位点百分率(PPB)为 81.88%,Shannon 指数为
0.3867 ,Nei′s 基因多样性指数为 0.2490.黑籽重
楼原变种和无瓣黑籽的 PPB 分别为 78.40%和
63.07%,Shannon指数为 0.4273和 0.3603 ,Nei s
基因多样性指数为 0.2849和 0.2439 ,因此黑籽重
楼原变种遗传多样性高于无瓣黑籽.五个居群中 ,
分布于彭州的无瓣黑籽居群的多态位点百分比
(PPB)(50.52%)、Shannon指数(0.3084)和 Nei′s
基因多样性指数(0.2128)均为最高 ,而分布在峨嵋
的无瓣黑籽居群的 PPB 值(45.64%)、Shannon指
数(0.2653)和 Nei′s 基因多样性指数(0.1821)较
低.黑籽重楼各居群的 PPB值相差不大 ,最高值与
最低值相差仅为 7.66个百分点.
表 3　2 变种内的遗传多样性水平
Tab.3　Genetic diversity o f the two varia tions
de tected by AFLP
居群 PPB(%) I H
th ibet ica 78.40 0.4273 0.2849
1(彭州黑籽) 42.86 0.3016 0.2097
2(峨眉黑籽) 46.34 0.2777 0.1908
3(瓦屋山黑籽) 48.78 0.2915 0.2007
apetala 63.07 0.3603 0.2439
4(峨眉无瓣) 45.64 0.2653 0.1821
5(彭州无瓣) 50.52 0.3084 0.2128
Species level 81.88 0.3867 0.2490
H=Nei s(1973)gene diversity;I=Shannon s Information
index [ Lew ontin(1972)] ;PPB=Percentage of polymorphic
loci
3.3　遗传分化分析
根据 POPGENE 的计算结果 ,物种水平总遗
传多样性 Ht =0.2493 、种内遗传多样性 Hs=
0.1923 ,种间的基因分化系数(Gst)达 0.2286(表
4).即在物种水平上有 22.86%的遗传变异存在于
居群间 ,而有 77.14%的遗传变异存在于居群内 ,
也就是说居群内分化较大.5 居群间基因流(Nm)
为1.6870.而在变种水平上 ,基因分化系数(Gst)
为 0.0726 , 即变种间有 7.26%的遗传变异 , 有
92.74%的遗传变异存在于变种内 ,亦即变种内遗
传变异远大于变种间.
表 4　2 变种间的遗传分化分析
Tab.4　Analysis of genetic differentiation
among two varia tions
分析内容 Ht H s Gst Nm
Species level 0.2493 0.1923 0.2286 1.6870
thibet ica/ apetala 0.2851 0.2644 0.0726
分子方差分析法(AMOVA)分析结果也显示 ,
2变种间及 5 居群间均存在显著性分化(P <
0.001).5个居群间遗传变异为 15.77%,居群内变
异为 84.23%,物种水平上各居群分化指数 PHIst
为 0.158.变种水平上 , 变种内遗传变异为
86.67%,变种间遗传变异仅占 13.33%,分化指数
PHIst=0.133(表略).该分析结果与 Gst 的结果
较一致.
3.4　居群间的遗传一致度和遗传距离
为了进一步分析两变种间的遗传分化程度 ,计
算了 Nei s 遗传一致度(IN)和遗传距离(D)(表
5),居群的遗传一致度在 0.8877 ～ 0.9410之间 ,遗
传距离在 0.0608 ～ 0.1191之间 ,说明居群间的相
似程度较高 ,遗传距离较小.其中 ,无瓣黑籽两个居
群的相似性最高 ,遗传距离为 0.0608;峨眉山黑籽
重楼原变种与彭州无瓣黑籽间的遗传距离较大(D
=0.1191), 遗传分化程度较大.彭州黑籽重楼原
变种与无瓣黑籽 2个居群的遗传距离稍小于峨嵋
以及瓦屋山的黑籽重楼原变种居群.
表 5　Nei s 遗传相似度与遗传距离
Tab.5　Nei s genetic identity and genetic distance
居群编号 1 2 3 4 5
1 0.8994 0.9123 0.9254 0.9225
2 0.1060 0.9336 0.8991 0.8877
3 0.0918 0.0687 0.9062 0.8911
4 0.0775 0.1064 0.0985 0.9410
5 0.0807 0.1191 0.1153 0.0608
Above diagonal:Nei s genet ic identity;
Below diagonal:genetic distance
3.6　聚类分析结果
根据 Jaccard s遗传相似系数 ,通过NTSYS-pc
软件 ,用 UPGMA 法构建个体间的遗传关系图 ,
(图 2).
由图 2我们可以看到黑籽重楼种下的两个变
种的个体基本都聚集到一起 ,并且明显的分成两个
分支 ,一支由黑籽重楼原变种 3个居群构成 ,另一
支由无瓣黑籽的 2个居群构成.且各居群的大多数
405第 2期 唐铭霞等:黑籽重楼种内AFLP 遗传多样性及遗传分化研究 　
个体都能很好的聚在一起.5 个居群中 ,彭州原变
种的情况较复杂 ,虽然大多数仍与峨嵋及瓦屋山的
原变种聚在一起 ,但仍有极少数个体与无瓣黑籽聚
在了一起.图 2中箭头标示的个体即为与无瓣黑籽
聚合在一起的分别于彭州的黑籽重楼原变种.
图 2　黑籽重楼两变种 Jaccard相似性系数经 UPGMA法获得的树系图
Fig.2　Dendrog ram of UPGMA analysis of the 2 variaties based on the Jaccard similarity coefficient by NTSYS-pc
406 四川大学学报(自然科学版) 第 45卷
4　讨　论
4.1　黑籽重楼的遗传多样性分析
多态位点百分率(PPB)一般可作为衡量遗传
多样性高低的指标.本文对 5个黑籽重楼居群的
AFLP 分析得到多态位点百分率在 42.86%和
50.52%之间 ,物种水平的 PPB 为 81.88%.唐荣
华[ 19]对 11种重楼属植物进行了 RAPD分析 ,得出
重楼属 11种植物 PPB为 79.1%～ 90.2%,其中黑
籽重楼的 PPB值为 85.7%,与本研究结果相近.张
金渝用 RAPD 技术对多叶重楼的 2 变种和凌云重
楼(P .cronquisti i)共 5个居群的研究表明 , PPB
为 42.66%～ 57.75%,多叶重楼物种水平 PPB为
92.05%.与之相比 ,黑籽重楼遗传多样性要高于凌
云重楼 ,而低于多叶重楼.Shannon s多态性信息
指数的大小 、Nei s基因多样性与多态位点百分率
的大小趋势一致.因此黑籽重楼遗传多样性低于多
叶重楼 ,但比凌云重楼有更多的遗传多样性.AFLP
遗传多样性分析表明黑籽重楼物种水平上存在较
高的遗传多样性.这说明黑籽重楼具有丰富的遗传
多样性和进化潜力.
Gst及 PHIst的分析结果表明 , 80%左右的遗
传分化发生在居群内 ,只有 20%在居群间 ,说明黑
籽重楼的居群间有一定的遗传分化 ,但大部分仍存
在于居群内.Hamrick 等曾多次对植物居群遗传结
构与植物生活史特性和生态因子之间的关系进行
综合研究 ,结果表明 ,繁育系统 、分布范围和习性是
影响植物居群遗传变异大小的主要因素 ,自交繁育
的植物有 51%的遗传变异存在于居群之间 ,而异
交植物居群间的遗传变异为 9.9%[ 20] .黑籽重楼
居群间遗传变异介于二者之间 ,但更接近于异交植
物 ,因此推断黑籽重楼采取的是以异交为主的繁育
方式 ,但也有自交的情况存在.因此 ,黑籽重楼居群
的遗传分化取决于其繁育系统的特性.目前有关于
黑籽重楼繁育系统较少 ,有待于更进一步的研究.
Slatkin认为基因间的相互交流会引起种内遗
传变异量的增加 ,维持种的均一性 ,阻止种内的分
化 ,产生与遗传漂变相互颉抗的作用[ 21] .如果每代
迁入个体数 Nm 大于 1而小于 4时 ,基因流就足以
部分抵制由漂变引起的遗传结果 ,维持遗传变异的
多样性 ,防止近交衰退[ 22] .Nm=1.6870 ,表明黑籽
重楼各居群间基因流较大 ,可以维持种内遗传变异
的多样性.黑籽重楼虽属广布种 ,但由于其较大的
基因流 ,可能因此而导致居群间遗传分化不大.
聚类树中 ,相同位点的居群并没有聚在同一分
支上 ,而是按变种明显地分为两个大支 ,且各居群
个体能很好地聚在一起 ,这表明居群间分化不是由
地理隔离所造成 ,而是由于居群间遗传分化所致.
4.2　黑籽重楼 2变种的遗传分化
黑籽重楼原变种PPB(78.40%)大于无瓣黑籽
PPB(63.07%),因此黑籽重楼原变种遗传多样性
大于无瓣黑籽 ,但由于在瓦屋山没有采集到足够的
无瓣黑籽 ,因此分析中缺少瓦屋山的黑籽重楼 ,这
也可能导致无瓣黑籽遗传多样性偏低.IN 及 D 遗
传一致度在 0.8877 ～ 0.9410 之间 ,遗传距离在
0.0608 ～ 0.1191之间 ,也表明相似程度较高 ,遗传
距离较小.可能是由于居群间基因 流较大
(1.6870),影响了 2变种间的遗传分化 ,因此二者
之间遗传相似性较高.
在检测到的 235条多态带中 ,黑籽重楼种下的
两个变种特征带有 3条 ,分析中可根据这 3条特征
带区分黑籽重楼种下的两个变种.Wright认为遗
传分化系数(PHIst)为 0.133是属于中等程度的分
化[ 23 ,24] ,且黑籽重楼种下的两个变种间 Gst 值为
0.0726 ,也表明遗传分化虽然主要存在于黑籽重楼
种下各变种内 ,但黑籽重楼种下两个变种间仍有一
定的分化.
在聚类分析中 ,除少数的彭州原变种个体与无
瓣黑籽聚合外 ,可以清楚地看到黑籽重楼原变种与
无瓣黑籽聚合成两支 ,说明黑籽重楼种下两个变种
之间存在明显的遗传分化.但遗传距离和聚类分析
均表明 ,彭州原变种与无瓣黑籽更为接近 ,因此推
测彭州的黑籽重楼原变种可能是两变种的过渡种
群.
黑籽重楼种下两个变种在形态上区别不显著 ,
仅在于有无花瓣的差别.AFLP 结果通过特征带能
鉴别二者 ,AMOVA 分析也表明两变种间有明显的
遗传分化 ,表型是由遗传及环境饰变决定 ,由于黑
籽重楼种下两个变种分布区重叠 ,常有混生 ,故其
表型差异主要是由遗传差异决定.因此从分子水平
来看支持现行的分类 ,即将黑籽重楼分为两个变种
是适合的.
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[责任编辑:白林含]
408 四川大学学报(自然科学版) 第 45卷