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响应面法优化多刺绿绒蒿中总黄酮的提取工艺



全 文 :云南师范大学学报(自然科学版)
2014年9月34卷5期(Vol.34No.5)
Journal of Yunnan Normal University
DOI:10.7699/j.ynnu.ns-2014-074
响应面法优化多刺绿绒蒿中总黄酮的提取工艺

罗云演1,2, 张秋龙3,4, 丁晨旭3
(1.青海民族大学 化学与生命科学学院,青海 西宁 810007;
2.青海省青藏高原植物资源化学研究重点实验室,青海 西宁 810007;
3.中国科学院 西北高原生物研究所,青海 西宁810001;4中国科学院 研究生院,北京 100049)
摘 要: 利用响应面法优化多刺绿绒蒿中总黄酮的提取工艺.在单因素试验的基础上,选择乙醇
浓度、液料比和提取时间为自变量,以总黄酮提取率为响应值,进行Box-Behnken中心组合实验设计,采
用响应面法(RSM)分析这些因素对总黄酮提取率的影响.响应面优化设计得出的最佳工艺为乙醇浓度
64%,液料比30:1,提取时间66min,总黄酮提取率达1.521%.
关键词: 响应面分析法;多刺绿绒蒿;总黄酮;提取
中图分类号: Q946.8   文献标志码: A   文章编号: 1007-9793(2014)05-0074-05
    多 刺 绿 绒 蒿 (Meconopsis horridula
Hook.f.& Thomson)为一年生罂粟科绿绒蒿属
草本植物,高约15~20cm,全株包被黄褐色或淡
黄色坚硬而平展的刺,主要分布于中国青海、西
藏、云南和甘肃,缅甸、印度东北部、不丹、锡金和
尼泊尔也有分布,生长于海拔3 000~5 000米的
山坡石缝中.多刺绿绒蒿味苦,有活血化瘀、止痛
功效,主要用于治疗头伤、跌打损伤等症[1-3].通过
查阅相关文献[5-11],绿绒蒿属植物含有大量的黄
酮类化合物,多刺绿绒蒿的化学成分主要为黄酮、
生物碱和挥发油,其中以黄酮类化合物居多,而近
年来的研究表明,黄酮类化合物具有广泛的生物
学活性[12-14].
为了充分开发利用藏药多刺绿绒蒿,本文运
用响应面分析法对多刺绿绒蒿总黄酮的提取条件
进行优化.
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
T6 新世纪紫外-可见分光光度计:北京谱析
通用仪器有限责任公司生产;HH-6数显恒温水
浴锅:国华电器有限公司;AL204电子天平:梅特
勒-托利多仪器(上海)有限公司.
多刺绿绒蒿,采自青海省海北门源地区,由当
地藏医鉴定;芦丁对照品:上海顺勃生物工程有限
公司(含量大于98%),批号:201203;亚硝酸钠、
硝酸铝、氢氧化钠和乙醇均为分析纯.
1.2 标准曲线的制备
1.2.1 芦丁贮备液配制
精密称取芦丁对照品8.75mg,用30%乙醇
溶解于25mL容量瓶中,并稀释至刻度,摇匀,得
浓度为0.35mg/mL贮备液.
1.2.2 制备标准曲线[4]
分别吸取贮备液0.0mL、0.5mL、1mL、1.5
mL、2mL、2.5mL,置于6个25mL容量瓶中,再
分别用30%乙醇约定容至10 mL,摇匀,随后加
入5% NaNO2溶液1.0mL,摇匀,静置4min,加
入 10% Al(NO3)3溶液1.0 mL,摇匀,静置10
min,加入1 mol/L NaOH 溶液5 mL,摇匀,最
后30%乙醇定容至刻度,充分混匀,放置15min,
得相应浓度的对照品溶液.500nm处测吸光度
值,以该系列中1号对照品液(0mg/mL)为参比,
芦丁浓度C(mg/mL)为横坐标,相应的吸光度值
A为纵坐标,作标准曲线,得标准曲线方程为:y
=20.614x+0.000 1,R2=0.999 2.
* 收稿日期:2014-07-30
基金项目:教育部重点科技资助项目(212188).
作者简介:罗云演(1988-),女,湖北松滋人,硕士研究生,主要从事藏药及其开发方面研究.
通信作者:丁晨旭,副研究员,主要从事藏药及开发方面研究.E-mail:13709710391@163.com.
1.3 多刺绿绒蒿中总黄酮的提取
称取多刺绿绒蒿药材粉末(过40目筛)1g,
加入60%乙醇25 mL,超声5min,后于70℃热
回流70min,提取2次,合并滤液.浓缩滤液,并
用30%乙醇10mL溶解,精密量取0.5mL于
25mL容量瓶中,按“1.2.2”项下方法操作,测量
吸光度.
1.4 多刺绿绒蒿中总黄酮的提取工艺设计
选择乙醇浓度(A)、液料比(B)和提取时间(C)
等影响总黄酮提取率较大的因素,并根据影响多刺
绿绒蒿中总黄酮提取因素考察试验的结果选择相
应的实验水平.采用Design expert.V.8.0.6软件中
Box-Behnken中心组合实验设计三因素三水平方
案,以多刺绿绒蒿总黄酮提取率为考察指标,通过
软件分析得出提取多刺绿绒蒿中总黄酮的最优工
艺参数.实验设计见表1.
表1 中心组合设计表
Table 1 The central composite design
实验因素
水平
-1  0  1
乙醇浓度(A)/% 50  60  70
液料比(B)/(ml/g) 20  25  30
提取时间(C)/min  60  70  80
2 结果与分析
2.1 影响多刺绿绒蒿中总黄酮提取因素考察
试验
2.1.1 乙醇浓度考察试验
称取药材粉末1g,按“1.3”项下方法,于
70℃,料液比1∶25的条件下,乙醇浓度分别为
40%、50%、60%、70% 和 80%,热 回 流 提 取
70min,考察试验结果如图1所示.
图1 乙醇溶液浓度考察试验结果
Fig.1 The test results of ethanol concentration
由图1可知,在乙醇浓度小于60%时,提取
率随着乙醇浓度的增大而增大,当乙醇浓度大于
60%时,提取率反而随之下降,且叶绿素等物质的
溶出增加,不利于测定,故选择乙醇浓度为60%
左右.
2.1.2 液料比考察试验
称取药材粉末1g,按“1.3”项下方法,于
70℃,乙醇浓度60%条件下,液料比分别为10∶
1、15∶1、20∶1、25∶1和30∶1,热回流提取70
min,考察试验结果如图2所示.
图2 液料比考察试验结果
Fig.2 The test results of ratio of liquid to solid
由图2可以看出,当液料比达到20∶1左右
时,随着提取剂用量增加,提取率变化不大,而
25∶1之后,可能是杂质的溶出增加,影响了总黄
酮的溶出,提取率故略有所下降,所以选择液料比
为25∶1左右.
2.1.3 提取时间考察试验
称取药材粉末1g,按“1.3”项下方法,于
70℃,乙醇浓度60%,液料比25∶1条件下,分别
热回流提取50min、60min、70min、80min和
90min,考察试验结果如图3所示.
图3 提取时间考察试验结果
Fig.3 The test results of extracting time
由图3可知,提取时间在由50min逐渐上升
至70min时,总黄酮提取率显著增加,而70min
后,随着提取时间的延长提取率有所下降,可能是
·57· 第5期         罗云演,等: 响应面法优化多刺绿绒蒿中总黄酮的提取工艺
多刺绿绒蒿中黄酮类物质结构对热具有一定的不
稳定性,故选择提取时间为70min左右.
2.1.4 提取温度考察试验
图4 提取温度考察试验结果
Fig.4 The test results of temperature
称取药材粉末1g,按“1.3”项下方法,于乙醇
浓度60%,液料比25∶1条件下,分别于40℃、
50℃、60℃、70℃和80℃水浴中浸提70min,考
察试验结果如图4所示.
由图4可见,70℃以后,随着提取温度的升
高,提取率有所下降,可能是多刺绿绒蒿中黄酮类
物质结构遭到破坏所致,另一方面杂质的溶出量
增加,影响测定,所以选择提取温度为70℃左右.
2.2 响应面实验方案与相关数据分析结果
本文采用 DesignExpert.V.8.0.6软件,对
表2中响应面实验数据进行分析,得出回归方程
方差分析表及相应的响应曲面图.
表2 响应面实验方案及实验结果
Table 2 The experiment designs and results of RSM
实验编号 乙醇浓度 液料比 提取时间 提取率
1 -1 -1  0  1.174
2  1  0  1  1.297
3  0 -1  1  1.223
4 -1  1  0  1.362
5 -1  0  1  1.055
6  1 -1  0  1.468
7  0 -1 -1  1.356
8  0  1  1  1.312
9  0  0  0  1.464
10  0  1 -1  1.526
11  1  0 -1  1.441
12 -1  0 -1  1.292
13  0  0  0  1.436
14  1  1  0  1.483
15  0  0  0  1.352
16  0  0  0  1.408
17  0  0  0  1.397
  响应面软件程序对表2中实验结果进行二次
回归响应面分析,得到的回归方程:多刺绿绒蒿总
黄酮的提取率=1.41+0.10*A+0.058*B-
0.091*C-0.043*A*B+0.023*A*C-0.020
*B*C-0.061*A2+0.022*B2-0.079*C2
·67· 云南师范大学学报(自然科学版)               第34卷 
表3 回归方程方差分析表
Table 3 ANOVA for quadratic polynomial model
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性
模型 0.23  9  0.026  23.20  0.000 2 ***
A  0.081  1  0.081  73.56 <0.000 1 ***
B  0.027  1  0.027  24.17  0.001 7 **
C  0.066  1  0.066  60.01  0.000 1 **
AB  7.482E-003  1  7.482E-003  6.78  0.035 3 *
AC  2.162E-003  1  2.162E-003  1.96  0.204 4
BC  1.640E-003  1  1.640E-003  1.49  0.262 3
A2  0.016  1  0.016  14.34  0.006 8 **
B2  1.978E-003  1  1.978E-003  1.79  0.222 5
C2  0.026  1  0.026  23.70  0.001 8 **
残差 7.728E-003  7  1.104E-003
失拟项 6.085E-004  3  2.028E-004  0.11  0.947 4 Not significant
净误差 7.119E-003  4  1.780E-003
总误差 0.24  16
R2=0.967 6 R2Adj=0.925 9
  注:***,P<0.001,差异极显著;**,P<0.01,差异高度显著;*,P<0.05,差异显著差异显著;P>0.1,差异不
显著.
  由表3可知,三个因素对提取率影响优先顺
序为:乙醇浓度>液料比>提取时间,回归模型P
值小于0.000 1达到极显著水平,方程相关系数
R2=0.925 9,说明该模型拟合度较好,失拟项P
=0.947 4(P>0.1)不显著,表明本实验所得二次
回归方程高度显著,实验设计可靠.两因素交互作
用对总黄酮提取率影响的响应面图如图5-7.
图5 乙醇浓度与液料比交互作用对总黄酮
提取率影响的响应面图
Fig.5 Response surface curve for extraction yield of
total flavonoids showing interaction between
concentration of ethanol and ratio
of liquid to solid
图6 乙醇浓度与提取时间交互作用对总黄酮
提取率影响的响应面图
Fig.6 Response surface curve for extraction yield
of total flavonoids showing interaction between
concentration of ethanol and extracting time
图7 液料比与提取时间交互作用对总黄酮
提取率影响的响应面图
Fig.7 Response surface curve for extraction yield
of total flavonoids showing interaction between
ratio of liquid to solid and extracting time
·77· 第5期         罗云演,等: 响应面法优化多刺绿绒蒿中总黄酮的提取工艺
3 验证实验
为了验证根据模型优化条件得到的最佳理论
工艺条件(乙醇浓度64.36%、液料比29.88∶1,
提取时间66.01min时,总黄酮提取率理论值为
1.530%)的可靠性,实际操作中将工艺修正为乙
醇浓度64%、液料比30∶1和提取时间66min进
行实验,总黄酮得率为1.521%(n=3,RSD=
0.399%)与预测值相差不大.
4 结 论
采用响应面法优化乙醇热回流提取多刺绿绒
蒿中总黄酮,得出最优工艺条件为乙醇浓度
64%,液料比30∶1,提取时间66min,经检验,在
此工艺条件下,总黄酮提取率为1.521%(n=3),
与预测值相差不大,表明该模型是合理可靠的,具
有一定的应用价值.
参 考 文 献:
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Optimization of Extraction Process of Total Flavonoids from Meconopsis
horridulaHook.f.& Thomson by Response Surface Methodology
LUO Yun-yan1,2,ZHANG Qiu-long3,4,DING Chen-xu3
(1.Colege of Life Science and Chemistry,Qinghai University for Nationalities,Xining 810007,China;
2.Key Laboratory of Plant Resources of Qinghai-Tibet Plateau in Chemical Research,Xining 810007,China;
3.Northwest Institute of Plateau Biology,Chinese Academy of Sciences,Xining 810001,China;
4.Graduate School,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049,China)
Abstract: Response surface method(RSM)is applied to optimize the extraction of total fla-
vonoids fromMeconopsis horridula Hook.f.& Thomson.On the basis of single factor experiment,
selecting ethanol concentration,solid-liquid ratio,extracting time as influencing factors,the total
flavonoids extraction yield as response value.Box-Benhnken central combination experimental is
used to set a mathematical model for response surface analysis.The results of RSM shows that
the optimal extraction conditions are:ethanol concentration 64%,liquid-solid ratio 30∶1and ex-
traction time 66min.In these conditions,the extraction yield of total flavonoids is as high as
1.521%.
Keywords: RSM;Meconopsis horridula Hook.f.& Thomson;Total flavonoids;Extraction
·87· 云南师范大学学报(自然科学版)               第34卷