全 文 ：植物组培的中间繁殖体(愈伤组织等)随着继代
培养时间延长， 其增殖、 分化能力逐渐降低已有许
多报道[1]。 类原球茎（PLB）是兰科植物组培的主要中
间繁殖体， 其长期继代培养的研究已有少量报道，
如采用无激素培养基有利于蝴蝶兰 （Phalaenopsis
spp.）某些品种类原球茎长期继代， 其分化的植株表
观性状稳定[2-3]， 分别调节培养基激素及糖浓度有利
于长期继代的春石斛类原球茎增殖和生根 [4]， 长期
继代培养物的变异近年来主要采用分子标记检测，
如春兰克隆繁殖苗 [5]， 铁皮石斛丛芽扩繁的分生
苗[6]、 霍山石斛愈伤组织[7]、 霍山石斛类原球茎[8]等。
笔者以常规方法继代培养蝴蝶兰类原球茎 24
个月， 增殖和分化能力有所降低， 在培养基添加
100 mg/L 半胱氨酸与 8 g/L 甘露醇组合的抗氧化剂
处理， 虽然继代培养后增殖和分化能力也有所降
低， 但比对照(常规培养基)类原球茎增殖能力显著
热带作物学报 2016， 37（1）： 80-85
Chinese Journal of Tropical Crops
收稿日期 2015-02-24 修回日期 2015-07-05
基金项目 福建省自然科学基金资助项目（No. 2009J01079）。
作者简介 刘福平（1963年—）， 男， 研究员； 研究方向： 园艺植物生理学。
长期继代蝴蝶兰类原球茎对抗氧化剂的
生理响应及 DNA稳定性分析
刘福平， 陈 淳， 林志楷
福 建 省 亚 热 带 植 物 研 究 所
福建省亚热带植物生理生化重点实验室 福建厦门 361006
摘 要 为了解抗氧化剂减缓长期继代蝴蝶兰类原球茎衰老的机理， 本实验在培养基添加抗氧化剂 100 mg/L 半
胱氨酸和 8 g/L 甘露醇继代类原球茎 24 个月， 分析其相关氧化指标及 DNA 稳定性。 结果表明， 类原球茎培养期
间处理组总活性氧水平变化趋势与对照组不同， 处理组比对照组低， 对照组总活性氧水平消长趋势与超氧阴
离子（O2·-）生成速率较为一致， 处理组则与羟自由基（·OH）相对含量的消长趋势较一致。 继代期间丙二醛含量变
化趋势与总活性氧水平变化趋势相似， 处理组比对照组低。 类原球茎 DNA 的 SRAP 分析结果表明， 继代培养期
间处理组与对照组间均未发生明显的 DNA 差异。 类原球茎 DNA 甲基化程度变化趋势与总活性氧水平变化大体
相同， 中后期处理组比对照组低。
关键词 蝴蝶兰； 类原球茎； 长期继代； 抗氧化剂； 氧化指标； DNA 稳定性
中图分类号 S682.31 文献标识码 A
Physiological Responses and DNA Stability of Phalaenopsis PLB
of Long-term Subculture with Antioxidants
LIU Fuping, CHEN Chun, LIN Zhikai
Fujian Key Laboratory of Subtropical Plant Physiology and Biochemistry,
Fujian Institute of Subtropical Botany， Xiamen, Fujian 361006， China
Abstract To understand the mechanism that antioxidants slowed down the aging of Phalaenopsis PLB through
long-term subculture, PLB were subcultured for 24 months in the culture supplemented with antioxidants (100 mg/L
cysteine and 8 g/L mannitol), and the related oxidant indexes and DNA stability of PLB were analyzed in the
experiment. The results showed that during subculturing of PLB the variation tendency of levels of total reactive
oxygen species ( T -ROS) was not consistent between the control and the treatment. The T -ROS levels of the
treatment were lower than that of the control. During PLB subculturing, the variation tendency of the levels of T-
ROS in the control was consistent with that of the growth rate of superoxide anion (O2·- ), but it accorded with the
relative quantity of hydroxyl radical (·OH) in the treatment. The changes of malondialdehyde content were
generally consistent with the levels of T-ROS during subculturing, the contents were lower in the treatment than
that in the control. The result of SRAP analysis on genome DNA indicated the polymorphic difference did not
show clearly in the PLB throughout subculturing, as well as between the control and the treatment. The variation
tendencies of levels of DNA methylation of PLB and the levels of T-ROS were about the same. However, the
levels in the treatment were lower than that in the control at middle-late stage.
Key words Phalaenopsis spp.; PLB; Long-term subculture; Antioxidants； Oxidant index； DNA stability
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.01.015
第 1 期
提高， 萌发率极显著提高。 关于植物组培中长期继
代中间繁殖体的衰老或退化现象， 普遍认为是活性
氧自由基致酶失活， 影响生理代谢， 启动膜脂过氧
化连锁反应、 破坏核酸结构等所致 [9-10]， 即自由基
在植物生理衰老和遗传变异上均有重要的效应 。
笔者研究在培养基添加抗氧化剂长期继代蝴蝶兰
类原球茎的相关氧化指标和 DNA 稳定性变化， 以
初步了解抗氧化剂减轻类原球茎衰老的生理及分
子机理。
1 材料与方法
1.1 材料
蝴蝶兰瓶苗（YZ45）由福建省亚热带植物研究
所组培室提供。 以嫩叶切块为外植体， 诱导培养基
为 1/2MS+6-BA 8 mg/L+CW（椰子汁）20％（V/V）+
蔗糖2％（W/V）， 诱导出的 PLB转接到 1/2MS+6-BA
3 mg/L+CW 20％（V/V）+蔗糖2％（W/V）培养基扩
繁， 获得大量 PLB 作为实验材料。 培养条件均为
光照 1 500 lx， 12 h/d， 温度 24～26℃。
1.2 方法
1.2.1 类原球茎长期继代方法 将 PLB 接种于继
代培养基 1/2MS+CW 20％（V/V）+蔗糖2％（W/V），
每瓶鲜重 3.00 g， 培养 2 个月， 随机取 9 瓶称量每
瓶 PLB 鲜重， 作为增殖能力指标。 将 PLB 团剥离
出中等大小单粒 PLB， 接种到分化培养基 1/2MS+
6-BA 3 mg/L+CW 20％（V/V）+NAA 0.5 mg/L+蔗糖
2％（W/V）， 每瓶接种 10 粒， 培养 2 个月（以上培
养条件均同 1.1）， 随机取 9 瓶观测颜色变化， PLB
存活率为仍呈绿色的 PLB 数/总 PLB 数×100％， 分
化率为出芽长根 PLB数/总 PLB数×100％。
PLB长期继代培养方法， 对照组为上述继代培
养基配方， 处理组为对照组培养基添加抗氧化剂半
胱氨酸 100 mg/L 培养基和甘露醇 8 g/L 培养基。 每
瓶接种 PLB 起始鲜重 3.00 g， 每 2 个月继代分瓶
1次。 在培养的第 8、 16、 24个月， 检验 PLB 增殖
能力， 方法为每处理取 PLB 鲜重 3.00 g 接种于继
代基本培养基， 培养 2 个月（以上培养条件均同
1.1）每处理随机取 9 瓶观测每瓶 PLB 鲜重， PLB 成
活率和分化率观测计算方法同上。
取培养的第 0、 8、 16、 24 个月 PLB 进行生理
生化指标、 DNA稳定性分析。
1.2.2 生理指标分析
（1）总活性氧（T-ROS）水平。 ELISA 检测试剂
盒由上海博舜生物科技有限公司提供， 取 0.5 g 鲜
PLB于 500 μL生理盐水研磨， 其他按说明书操作，
450 nm 处测吸光值 。 标准曲线 y=771.3x-41.21
（R2=0.991）， 活性氧水平以 U/mL表示。
（2）羟自由基(·OH)相对含量。 按刘福平等 [11]介
绍的方法。 以单位时间每克鲜重在 420 nm 处的吸
光度变化为单位, 即 ΔA420/（min·g FW）。
（3）超氧阴离子（O2·-）生成速率。 参照汤章成 [12]
的方法， 同时做 NO2-标准曲线， 得 y= 48.539 1x+
1.170 3(R2=0.998 2)， 结果以 μmol/（min·g FW）表示。
（4）过氧化氢（H2O2）含量。 按宋松泉等 [13]及沈
文飚等 [14]介绍的方法 , 同时做 H2O2 标准曲线， 得
y=1 426.5x+0.357 2 (R2=0.996)， 结果以 μmol/g FW
表示。
（5）丙二醛（MDA）含量。 按汤章成的方法[12]， 结
果以 μmol/g FW 表示。
1.2.3 DNA 变异分析
（1）SRAP(相关序列扩增多态性)检测。 取蝴蝶
兰瓶苗嫩叶及继代培养第 0、 8、 16、 24 个月的
PLB进行 SRAP检测。 DNA提取采用 CTAB法， 纯
度、 浓度检测以 A260和 A280检测吸光度法和琼脂糖
凝胶电泳法。 按照 Li 和 Quiros[15]的 SRAP 引物设计
原则设计引物。 SRAP-PCR 体系 (25 μL)包括模板
DNA 40 ng、 Mg2+ 2.0 mmol/L、 引物 0.8 μmol/L、 Taq
酶 1 U。 扩增程序： 94℃ 5 min； 94℃ 1 min， 35℃
1 min， 72 ℃ 1 min， 5 个循环； 94 ℃ 1 min， 50 ℃
1 min， 72 ℃ 1 min， 35 个循环； 72 ℃ 10 min。 琼
脂糖凝胶电泳及成像。
（2）DNA 胞嘧啶甲基化水平。 以培养第 0、 8、
16、 24 个月的 PLB 为材料。 DNA 提取、 水解、 高
效液相色谱参照刘福平等 [16]介绍的方法。 样品在
25 ℃下注入 HPLC(Waters2695)的 Hypersil BDS C18
柱(200 mm×4.0 mm， 5μm)(大连伊利特分析仪器有
限公司提供)分离, 柱温 25 ℃。 流动相由甲醇、 戊
烷磺酸钠 (10 mmol/L)、 三乙胺按体积比 3 ∶ 90 ∶ 0.2
配成， pH4.0， 流速 1.0 mL/min。 胞嘧啶（C）及 5-甲
基胞嘧啶(5mC)购自 SIGMA公司， 检测波长 273 nm，
分别取胞嘧啶和甲基胞嘧啶系列标准溶液进行测
定， 以峰面积（S）对标准进样量（摩尔数， M）作回
归方程 ， 胞嘧啶回归方程为 MC=3.054×10-10×SC－
1.598×10-5， R2=0.999 6， 甲基胞嘧啶回归方程 M5mC=
5.684×10-10×S5mC+2.973×10-5， R2=0.999 7。 根据 PLB
样品 DNA 水解产物中 C 和 5 mC 的洗脱峰面积，
计算样品中 C 和 5 mC 的摩尔数， DNA 甲基化水
平=5 mC/(C+5 mC)×100％。
1.3 数据分析
对照组、 处理组分别在不同培养时间观测数据
刘福平等： 长期继代蝴蝶兰类原球茎对抗氧化剂的生理响应及 DNA稳定性分析 81- -
第 37 卷热 带 作 物 学 报
表 1 类原球茎在添加抗氧化剂培养基继代不同时间的某些氧化指标
Table 1 Some oxidant indexes of PLB cultured with antioxidants at different subculture times
项 目
继代培养时间
0 个月 8 个月 16 个月 24 个月
总活性氧/（U/mL）
对照 67.62±4.02 71.88±9.67* 94.65±4.02** 96.78±1.01**
·OH/[ΔA420/（min·g FW）]
对照 0.503±0.025 0.520±0.056 0.523±0.072* 0.613±0.057**
O2·- /[μmol/（min·g FW）]
对照 1.593±0.070 1.763±0.093* 2.470±0.396** 3.493±0.365**
H2O2/(μmol/g FW)
对照 134.7±16.3 137.4±16.2 166.0±21.2** 163.2±13.1**
丙二醛/（μmol/g FW）
对照 1.203±0.100 1.291±0.096 1.532±0.112** 1.802±0.080**
处理 1.203±0.100 1.175±0.127▲ 1.343±0.137*▲ 1.531±0.135**▲▲
处理 67.62±4.02 60.86±3.52**▲▲ 71.89±6.04**▲▲ 83.98±8.05**▲▲
处理 0.503±0.025 0.487±0.038*▲ 0.523±0.035* 0.550±0.082**▲▲
处理 1.593±0.070 1.680±0.209▲ 2.210±0.322**▲▲ 3.323±0.208**
处理 134.7±16.3 127.8±19.3*▲▲ 174.1±7.2**▲ 151.2±11.2*▲
说明： 同一行内数字差异表示培养起始与继代培养期间的组间差异， ** 和 * 分别表示 α=0.01 和 α=0.05 水平下的差异显著性； 某一指
标的列内数字差异表示对照组与处理组在同一培养时间的组间差异， ▲▲和▲分别表示 α=0.01 和 α=0.05 水平下的差异显著性。 下同。
Note: The differences of the same lines of digital indicate the differences between at the beginning of culture and subsequent subcultures. **
and * indicate different significance at α= 0.01 and at α= 0.05 levels，respectively; The differences of the same column of figures ( a certain index)
indicate the differences between control group and treatment group at the same culture time, ▲▲and ▲indicate different significance at α= 0.01 and
at α= 0.05 levels, respectively. The same as below.
的组间差异显著性比较按 Dunnett 最小显著差数
（DLSD）测验法。 同一培养时间的对照组与处理组
间差异显著性比较采用 t检验法。
2 结果与分析
2.1 抗氧化剂对长期继代类原球茎氧化指标的效应
培养基添加抗氧化剂继代培养蝴蝶兰 PLB 24
个月， 总活性氧、 羟自由基(·OH)相对含量、 超氧
阴离子(O2·- )生成速率、 过氧化氢（H2O2）含量和丙二
醛（MDA）含量变化见表 1。
2.1.1 总活性氧（T-ROS）水平变化 培养起始（0个
月）PLB的总活性氧水平 67.62 U/mL， 培养第 8 个月，
对照组显著提高， 处理组极显著降低， 随后两组都
随继代培养时间延长升高， 都达极显著水平。 培养
期间 3个时间点， 处理组总活性氧水平均较对照组
极显著降低。
2.1.2 羟自由基(·OH)相对含量变化 培养起始（0
个月）PLB的·OH相对含量 0.503 ΔA420/（min·g FW），
培养第 8个月， 对照组变化不明显， 处理组显著降
低， 随后两组都随培养时间延长而升高， 第 16 个
月， 都显著升高， 第 24 个月都极显著升高。 处理
组和对照组比较， 培养第 8个月， 处理组较对照显
著降低， 第 16个月差异不显著， 第 24个月较对照
组极显著降低。
2.1.3 超氧阴离子（O2·-）生成速率变化 培养起始（0
个月）PLB 的 O2·-生成速率 1.593 μmol/（min·g FW），
培养第 8个月， 对照组显著提高、 处理组没显著变
化， 随后都随培养时间延长升高， 第 16、 24个月，
两组都较初代极显著升高。 培养第 8个月处理组较
对照显著降低， 第 16个月极显著降低， 第 24 个月
差异不显著。
2.1.4 过氧化氢（H2O2）含量变化 培养起始（0个
月）PLB 的 H2O2含量为 134.7 μmol/g FW， 培养第 8
个月， 对照组 H2O2 含量没显著差异， 处理组显著
降低， 第 16个月两组都极显著升高， 第 24个月对
照组仍极显著升高， 处理组有所回落， 但仍较初
代显著升高。 培养第 8 个月， 处理组较对照极显
著降低， 第 16 个月显著升高， 第 24 个月显著降
低。
2.1.5 丙二醛含量变化 培养起始（0个月）PLB 的
丙二醛含量为 1.203 μmol/g FW， 培养第 8 个月 ，
对照组、 处理组均没明显变化， 第 16 个月对照组
极显著升高， 处理组显著升高， 第 24 个月都极显
著升高。 处理组和对照组比较， 培养第 8、 16 个
月， 处理组均较对照显著降低， 第 24 个月则极显
著降低。
从上所述可以看出， 在整个培养期间， 对照组
总活性氧水平消长趋势与 O2·-生成速率都随培养时
间延续而升高， 趋势相对较为一致， 处理组总活性
氧水平先抑后扬， 与·OH 相对含量消长趋势较为
一致。 对照组丙二醛含量随培养时间延续而升高，
与总活性氧水平变化趋势较一致， 处理组丙二醛含
82- -
第 1 期
项 目
继代培养时间
0 个月 8 个月 16 个月 24 个月
DNA 甲基化程度/％
对照 17.7±1.6 18.8±1.0 21.5±0.5** 24.4±1.1**
处理 17.7±1.6 18.6±1.1 19.0±0.4**▲▲ 23.2±1.9**▲
表 2 类原球茎在添加抗氧化剂培养基继代不同时间的 DNA 甲基化水平变化
Table 2 DNA methylation levels of PLB cultured with antioxidants at different subculture times
图 1 叶片和类原球茎的 SRAP-PCR 结果
Fig. 1 SRAP-PCR reaction results of leaf and PLB
1 2 3 4 5 6 7 8 M
量与总活性氧水平都是先抑后扬（但丙二醛含量在
第 8 个月的降低没有达到显著水平）， 大体上较为
协同。
2.2 抗氧化剂对长期继代类原球茎的 DNA变异的
效应
2.2.1 DNA 的 SRAP 分析 SRAP-PCR 扩增结果
见图 1。 1 号为用于诱导 PLB 的瓶苗叶片， 2 号为
培养初始的 PLB， 3～5 号为对照组分别在 8、 16、
24个月 PLB， 6～8号为处理组分别在 8、 16、 24 个
月 PLB。 所有样品扩增条带大小在 50～1 000 bp 之
间， 扩增条数在 2～6 条之间， 各样品间呈现一定
的多态性。 1 号叶子 PCR 结果明显与 2～8 号 PLB
不同， 其中有 4条带都与其他样品不同， 多态性差
异明显， 说明从叶子诱导出 PLB 就有 DNA 水平变
异。 2～8号条带相近， 说明继代培养期间 PLB 并未
发生明显的 DNA 差异， 培养基添加抗氧化剂与对
照 PLB也并未发生明显的 DNA 差异。
2.2.2 DNA 甲基化水平分析 培养基添加抗氧化
剂长期继代培养 PLB 期间 DNA 胞嘧啶甲基化程度
变化见表 2。 从表 2 可以看出， 培养起始 PLB 的
DNA 甲基化程度为 17.7％， 对照组和处理组在第
8 个月都没显著变化 ， 随着继代培养时间延长 ，
DNA 甲基化程度逐渐提高， 都达极显著水平。 处
理组、 对照组甲基化程度在第 8 个月差异不显著，
在第 16 个月处理组极显著降低， 第 24 个月显著
降低。
3 讨论与结论
自由基在生理衰老和遗传变异上均有重要的效
应[9-10]， 本实验继代培养蝴蝶兰 PLB， 添加抗氧化
剂处理组、 对照组总活性氧水平都有所提高， 处理
组与同时点的对照相比都较低， 即半胱氨酸与甘露
醇复合抗氧化剂能降低 PLB 总活性氧水平。 整个
培养期间总活性氧水平变化趋势与主要活性氧指标
之间的关系， 对照组总活性氧与 O2·-消长趋势相对
较为一致， 推测 O2·-是总活性氧水平变化的主要影
响因素， 处理组·OH 消长趋势与总活性氧相对较
为一致， ·OH 可能是主要影响因素， 主要影响因
素不同， 可能因处理组在培养基添加抗氧化剂所
刘福平等： 长期继代蝴蝶兰类原球茎对抗氧化剂的生理响应及 DNA 稳定性分析 83- -
第 37 卷热 带 作 物 学 报
致。 膜脂过氧化产物丙二醛干扰细胞代谢活动， 破
坏生物膜结构， 李仲芳等 [17]在连续继代培养鹅掌楸
丛生芽中， O2·-和丙二醛含量呈现逐渐增加的趋势。
本实验 PLB 继代培养期间， 对照组、 处理组丙二
醛含量变化趋势都与总活性氧变化相似， 处理组丙
二醛含量较同时期的对照组低， 说明抗氧化剂对降
低 PLB丙二醛含量有一定的效果。
PLB 的 SRAP-PCR 扩增结果， 叶子 PCR 结果
与所有 PLB 多态性明显 , 说明从叶子诱导出 PLB
就有 DNA 水平变异。 所有 PLB 扩增条带相近， 说
明继代培养期间 PLB 并未发生明显的 DNA 差异，
培养基抗氧化剂也并未导致明显的 DNA 差异。 长
期继代的组培无性系在分子水平无明显变异已有一
些报道， 叶艺春兰克隆繁殖的第 9 代到第 20 代组
培苗 DNA分析未见明显差异[5]， 铁皮石斛的 7代无
性繁殖苗， 第 4 代之后代间仅有部分引物 RAPD
带型发生甚微变化 [6]， 从继代 18 次霍山石斛 PLB
分化的幼苗 RAPD 分析， 不同代 PLB 的幼苗之间、
长期继代与供体母株之间均没有显著遗传变异 [8]，
其他如长期继代再生能力丧失的纽荷尔脐橙愈伤组
织 [18]， 长期继代蛇麻草愈伤组织再生苗 [19]， 继代 5
次的滇黄芩组培苗[20]都没检出明显带型差异。
在植物离体培养过程中， 遗传和表观遗传变异
都可能是引起长时间培养材料丧失分化能力的一个
重要原因[1，21]， 有报道 DNA 甲基化水平随着继代代
数和时间的增加而增加 [18，22，23]， 本实验的 PLB 在培
养的第 16、 24个月， 处理组、 对照组的 DNA甲基
化水平都较初代提高， 但对照组或处理组的 SRAP
检测未发现明显变异， 上述的纽荷尔脐橙、 蛇麻
草事例中， 采用分子标记均未检测出多态性条带，
纽荷尔脐橙愈伤组织胚状体再生能力丧失， 作者
认为可能是相关基因发生甲基化修饰造成的[18]， 蛇
麻草也检测出了甲基化变化， 认为这种变化是逐
渐形成[19]。
氧化胁迫（活性氧）诱发 DNA 甲基化程度提高
或降低各有报道[24]， 本实验不管是对照组还是处理
组， 在继代培养中后期， PLB 的 DNA 甲基化程度
提高， 与总活性氧水平逐渐提高大体对应， 至于添
加抗氧化剂（含半胱氨酸和甘露醇）处理组 DNA 甲
基化程度较对照组低， 杜亚琼等 [25]报道 50 mmol/L
甘露醇对拟南芥种子萌发率、 幼苗生长几乎没影
响， 基因组 DNA 甲基化水平均低于对照， 有报道
葫芦巴碱、 甜菜碱和胆碱 [26]、 茶多酚类 [27]具有去甲
基化效应， 而它们都具较强抗氧化性， 所以， 本实
验中抗氧化剂可能与 PLB 的 DNA 甲基化程度降低
有关。
活性氧自由基在植物生理衰老和遗传变异上均
有重要的效应。 本实验的生理指标方面， 抗氧化剂
使继代培养类原球茎总活性氧水平降低， 从而丙二
醛含量也降低， 减轻了丙二醛对细胞生理毒害， 有
利于减轻继代蝴蝶兰类原球茎增殖、 分化能力下
降 。 类原球茎 DNA 稳定性分析未发现明显多态
性， 即核苷酸序列并没有检出变异， 处理组 DNA
甲基化程度较对照组低， 可能也是抗氧化剂减轻
长期继代蝴蝶兰类原球茎增殖、 分化能力下降的
原因之一。 本研究结果为克服长期继代蝴蝶兰类
原球茎应用上存在障碍的研究提供借鉴， 也为利
用化学调控解决或缓解植物培养物长期继代的衰
老研究提供基础。
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责任编辑：沈德发
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