全 文 ：中国农业大学学报　2008 , 13(5):29-34
Journal o f China Ag ricultur al Unive rsity
香水月季类原球茎(PLBs)途径再生植株的研究
郭艳超1　张 倩1 　田传卫1 　陈 菊2 　赵梁军1
(1.中国农业大学 农学与生物技术学院 ,北京 100193;2.北京花木公司 ,北京 100044)
摘　要　以香水月季(Rosa odorata)的嫩叶为外植体 , 采用 MS 基本培养基 ,添加不同质量浓度的 2 , 4-D、TDZ 和
IBA ,研究了类原球茎再生植株的效果。主要步骤如下:1)嫩叶在 M S+2 , 4-D1.0 mg/ L +蔗糖 30 g/ L + Gelrite
3 g/ L 培养基上暗培养 4 周 , 愈伤组织诱导率达 100%, 愈伤组织上的类根体(rhizoid)发生率最高 , 生成率可达
71%。2)类根体在含 TDZ 的培养基(1/ 2 MS+TDZ 13 mg/ L +蔗糖 30 g/ L +Gelrite 3 g/ L)上 , 分化成类原球茎
束 ,诱导率达 71.0%, 平均类球茎束为 2.1。 3)类原球茎在含 IBA 的培养基(MS+BA 2.0 mg/ L +IBA 0.01 mg/ L
+GA 3 0.1 mg/ L +蔗糖 30 g/ L + Gelrite 3 g/ L)上 ,发育出小植株 , 萌发率为 29.3%;不能萌发的类原球茎上有
白色假珠芽产生。白色珠芽可进行增殖 、脱分化 、再分化出芽 ,其植株再生率为 46.7%。4)再生苗的生根培养基为
1/2MS+NAA 0.2 mg/ L +蔗糖 30 g/ L+琼脂 6 g/ L ,生根率为 100%。 5)小苗经驯化后移栽到灭菌草炭土∶蛭
石(体积比为 1∶1)基质上 ,成活率为 95%。
关键词　香水月季;叶片;类根体;类原球茎;假珠芽;植株再生
中图分类号　S 685.12 　　　文章编号　1007-4333(2008)05-0029-06　　　文献标志码　A
收稿日期:2008-02-25
基金项目:国家“ 863”计划项目资助(2006AA100109 );“十五”国家科技攻关计划课题资助(2004BA521B02)
作者简介:郭艳超 ,硕士研究生;赵梁军 ,教授 , 通讯作者 ,主要从事园林植物基因工程和细胞工程育种研究 ,
E-mail:Zhaolj5073@sina.com
Regenerat ion of Rosa odorata via
protocorm-like-bodies
GUO Yan-chao1 , ZHANG Qian1 , TIAN Chuan-wei1 , CHEN Ju2 , ZHAO Liang-jun1
(1.College of Agronomy andBiotechnology, China Agricultural University, Beijing 100193 , China;
2.Beijing Huamu Company;Beijing 100044 , China)
Abstract　This study determined the probability of shoot regeneration via Protocorm-like-bodies(PLBs)inR.odorata.
Using Murashige and Skoog(MS)supplemented wi th different concentrations 2 , 4-dichlorophenoxyacetic acid(2 , 4-D
0.1-5 mg/ L), N-phenyl-N′-1, 2 , 3-thiadiazol-5-ylurea(TDZ 7-20 mg/ L)and Indole-3-butyric acid(IBA 0.01-0.3
mg/ L), adventitious shoots induced from invitro cultured leaflets of R.odorata were studied.The leaflets of R.odo-
rata were induced for 4 weeks in the dark on the mediumMS+2 , 4-D1.0 mg/ L +sucrose 30 g/L + Gelrite3 g/ L ;the
rate of callus formation was 100%and the highest induction rate of rhizoid was 71%.The number of rhizoid per explant
was 3.0 , and the average length of rhizoid was 0.47 cm.Using N-phenyl-N′-1, 2 , 3-thiadiazol-5-ylurea(TDZ), rhi-
zoids were differentiated into protocorm-like-bodies , and the highest differentiation was 71% on the medium 1/ 2MS+
TDZ 13 mg/ L + sucrose 30 g/L + Gelrite 3 g/ L.The number of PLB clusters per explant was 2.1.The optimumme-
dium that induced protocorm-like-bodies into shoot was MS+BA 2 mg/ L+IBA 0.01 mg/L +GA 3 0.1mg/ L +sucrose
30 g/ L + Gel rite 3 g/ L, and the frequency of regenerated plants was 29.3%.Clusters of e protocorm-like-bodies that
failed to germinate into shoots developed into pseudobulbils.The secondary pseudobulbils can develop from theoriginal
pseudobulbils.The pseudobulbils may be proliferated and dedifferentiated on the different induction media , and then
used to induce regenerated plants.The rate of regeneration was 46.7%.During induction, new pseudobulbils also oc-
cured.The appropriate medium for rooting was MS+NAA 0.2 mg/ L + sucrose 30 g/ L + agar 6 g/L , and the rate of
中 国 农 业 大 学 学 报 2008 年 第 13 卷　
rooting was 100%.After acclimationand transplantation, the survival rate was up to 95%.The suitable transplantation
matrix for shoots was soddy soil∶vermiculite(1∶1).The regeneration of shoots of R.odorata may be induced by a
new(leaflets-callus-rhizoid-PLB-regenerated shoots)method , that is PLBs .
Key words　R.odorata;leaflets;rhizoid;protcom-like-bodies;pseudobulbils;shoot regeneration
　　在蔷薇属植物中 ,再生显著受基因型影响[ 1-5] ,
仅有个别材料可以得到较高的再生率 ,再生困难制
约着其基因工程育种[ 6-8] 。因此 ,建立一个非基因型
依赖的 、高效的再生体系是蔷薇属植物基因工程育
种迫切需要的。
　　本实验室一直在对蔷薇属植物进行种质资
源的收集 、新品种的选育和研究 。在对狗蔷薇
(Rosa canina)、粉 团蔷薇(R.mult i f lora var.
cathayensis)和白玉堂(R.multi f lora var.albo-
p lena)3 种蔷薇属植物的再生研究过程中 ,发现
了一种高效再生途径 , 首次在蔷薇属植物上提出
了类原球茎的概念 , 简称该途径为类原球茎再
生[ 9] 。这种途径在一定程度上减轻了蔷薇属植
物再生对基因型的依赖 。
　　其主要过程如下:以叶片为外植体 ,用 2 ,4-D诱
导出愈伤和类根体 ,然后再用 TDZ 诱导其分化出类
原球茎 ,最后让类原球茎束萌发成苗。因为每个叶
片外植体可以诱导出 3 ～ 10根左右的类根体 ,每个
类根体分化出的类原球茎束可以发育成 3-5个或者
更多的再生芽 ,从而大大提高植株的再生效率 。
　　国外研究发现 ,以蔷薇属植物的花丝 、花托 、花
瓣 、花粉囊等为外植体 ,在 BA 和 2 ,4-D的作用下也
可以诱导出带类根体的愈伤组织[ 10] 。用 2 , 4-D 处
理 R.hybrida `Caref ree Beauty 和 R.chinesis
minima`Red Sunblaze 的叶片和茎段同样可高频诱
导出类根体[ 11] 。在对月季品种`Livin Easy 的研究
中 ,用叶柄为外植体 ,在含 2 , 4 ,5-T(2 ,4 ,5-Trichlo-
rophenoxyacetic)MS 培养基中暗培养 4 周后 ,愈伤
上产生类根体[ 12] 。
　　由此可见 ,在蔷薇属植物中 ,类根体的发生具
有一定的普遍性 ,所用的外植体类型也较多 。但
是 ,通过类根体诱导出类原球茎 ,进而得到再生植
株的报道没有。 Tian Chuanwei[ 9] 首次提出了蔷薇
属植物的类原球茎再生途径 , 该途径具有潜在的
高再生率 。
　　香水月季(R.odorata)是月季(R.chinensis)与
巨花蔷薇(R .g igantea )天然杂交种 ,是现代月季
形成的重要种质 ,香水月季花芳香浓郁 ,具有极高的
应用价值[ 13-14] 。
　　本实验以香水月季为试材 ,按照 Tian Chuan-
wei
[ 9]的研究方法对其通过类原球茎再生进行研究。
一方面验证香水月季通过 PLBs 途径再生的可能 ,
另一方面为香水月季利用外源基因进行遗传改良建
立了一个良好的再生技术平台。
1　材料与方法
1.1　试验材料
　　中国农业大学观赏植物试验圃保存的香水月季
(R .odorata)植株。
1.2　方法
1.2.1　香水月季无菌快繁体系的建立　外植体灭
菌方法参考文献[ 15] 。2007年 5 月上旬 ,剪取香水
月季当年生枝条的中上部 ,去除叶和刺 ,用低浓度
的洗衣粉水洗去枝条表面的附着物 ,然后剪成 6
cm 左右的茎段 , 用流水冲洗 10 min ,再剪成单芽
茎段 ,放入灭菌的塑料瓶里。在超净工作台里 ,用
70 mg/mL 的酒精处理 30 s ,无菌水冲洗 2 ～ 3 次 ,
接着用 0.1 mg/mL 的升汞处理 7 min ,无菌水冲洗
2 ～ 3 次 ,接种到 MS+6-BA0.5 mg/ L +NAA0.1
mg/L 培养基上光照培养。1 周后 ,腋芽开始萌发 ,
芽体开始膨大 、伸长 、展叶 。将萌发的新芽切下置
于增殖培养基 MS+6-BA0.8 mg/ L + NAA0.05
mg/L 上 ,每 4 周继代 1 次。增值系数可以达到 2
～ 4倍 。
1.2.2　愈伤及类根体诱导　取无菌苗的顶生幼叶 ,
将叶背朝下分别接种于含 0.1 、0.5 、1.0 、1.5 、2.0 、
2.5 、3.0 和 5.0 mg/L 的生长素类物质 2 , 4-D 的
MS培养基上行暗培养。每个处理接种 20个外植
体 ,5 次重复。设无菌水为对照 。接种 4 周后统计
叶片愈伤诱导率 、类根体发生率及平均类根体数 。
1.2.3　TDZ 对类原球茎发生的影响　将带有类根
体的愈伤转入 1/2M S(无机盐减半),并在分别添加
7 、11 、13 、15 、17和 20 mg/L 的细胞分裂素类物质
TDZ 的培养基上进行培养 。每处理接种 8个外植
体 ,3 次重复。4 周后统计类类原球茎束生成率及
平均类原球茎束数 。
1.2.4　IBA 浓度对类原球茎分化的影响　将带有
类原球茎愈伤转入添加 6-BA(2 mg/L)、IBA(0.01
30
　第 5 期 郭艳超等:香水月季类原球茎(PLBs)途径再生植株的研究
～ 0.30 mg/L)、GA 3(0.1 mg/ L)的 MS 培养基上进
行光照培养 。每个处理接种 8个外植体 ,3 次重复 。
4周后统计类原球茎束上发生不定芽的数量 。
1.2.5　假珠芽的增殖 、脱分化及再生　在诱导不定
芽过程中会产生假珠芽 ,而且假珠芽的上面还会发
生二次假珠芽。将假珠芽接种到增殖培养基上光照
培养 、脱分化培养基暗培养 ,然后把假珠芽脱分化形
成的愈伤组织接入小植株诱导培养基光照培养 ,诱
导不定芽。培养基中的激素种类及含量参照文
献[ 8-9] 。每个处理接种 10个外植体 ,3次重复 。4 周
后统计发生不定芽的数量 。
1.2.6　再生植株的增殖 、生根及移植　将再生苗移
至增殖培养基上培养 ,将生长健壮的小苗移至生根
培养基上 ,将长根的再生植株炼苗后移植于无菌基
质中 ,草炭土和蛭石的体积比为 1∶1 ,置于光照培
养箱中驯化培养 。
1.2.7　培养条件及数据处理　本实验均采用 MS
培养基 ,除特别说明外均以蔗糖为碳源 ,添加量为
30 g/ L;快繁及生根培养基所用凝胶为 6g/L 琼脂 ,
再生培养基用 3 g/L Gelrite;pH5.9 。培养条件为
(25±2)℃、光子量照度为 50 μmol/(m2 · s)、光周
期为 16 h 光/8 h 暗 。
　　实验采用随机区组设计 ,实验数据采用 SAS统
计软件进行分析。
2　结果与分析
2.1　不同质量浓度 2 ,4-D 对愈伤及类根体诱导的
影响
　　将叶片接种在不含 2 ,4-D的培养基上不能产生
愈伤 ,而在含不同质量浓度 2 , 4-D 的 MS 培养基上
均能产生愈伤 ,愈伤诱导率达到了 100% 。叶片在
接种 5 d后 ,小叶切口处开始膨大 ,继而产生愈伤 ,
愈伤的颜色为黄褐色 、湿润 、水浸状。10 d 左右愈
伤上开始出现白色类根体 ,随着培养时间的延长 ,类
根体数目增多并且长度增加 。类根体上附有大量纤
毛状物。暗培时间超过 35 d后 ,愈伤组织颜色褐色
加深 ,类根体的数量和长度不再增加 ,颜色也开始转
褐 。类根体的平均长度在 0.2 ～ 0.5 cm 之间。本试
验得到的类根体生长没有极性 ,类根体上附有大量
的纤毛状物 ,这与组培苗的根有一定区别 。
　　试验结果表明 ,在 2 ,4-D1.0 mg/L 培养基上类
根体生成率达到最高 ,为 71%,平均类根体数为 3
个 。从数据可以看出 ,类根体的发生受 2 , 4-D质量
浓度的影响较大 。试验范围内 ,低浓度促进类根体
的发生 、高浓度抑制类根体的发生 ,并且类根体的长
度明显变短(表 1)。
表 1　2 , 4-D 质量浓度对香水月季叶片愈伤分化及类根体生成的影响
Table 1　Effect of 2 , 4-D concentrations on stimulation o f rhizoid and callus induction
from leaf explants o f R.odorata
2 , 4-D 质量浓度/
(mg/ L) 外植体数
产生类根体
的外植体数 类根体总数
类根体
生成率/ %
平均类
根体数
类根体的
平均长度/ cm
0 0 0 0 0 0 0
0.1 100 44 71 44.0 c 1.6 dc 0.47 a
0.5 100 66 215 66.0 ba 3.2 ba 0.32 b
1.0 100 71 212 71.0 a 3.0 ba 0.25 cb
1.5 100 54 128 54.0 bc 2.3 bc 0.21 c
2.0 100 34 119 34.0 d 3.7 a 0.20 c
2.5 100 33 72 33.0 d 2.2 bc 0.20 c
3.0 100 8 14 8.0 e 1.3 dc 0.20 c
5.0 100 2 3 2.0 e 0.6 d 0.20 c
　　注:所有数据为暗培养 4周后的统计值 ,表中字母表示显著水平为 P <0.05。下同。
2.2　TDZ对类根体分化的影响
　　将带类根体的愈伤转到含不同质量浓度 TDZ
的培养基上进行光照培养 , TDZ 的浓度梯度根据本
实验室的前期研究结果设定。在不含 TDZ 的培养
基上类根体不能分化成类原球茎 ,并逐渐褐化死亡;
类根体在含 TDZ 的培养基上培养 10 d 后 ,其顶部
由白色变为黄绿色并开始膨大 ,逐渐分化成带有大
量突起结构的类原球茎束(图 1 a、b)。
31
中 国 农 业 大 学 学 报 2008 年 第 13 卷　
　　TDZ 对类根体分化成类原球茎束起重要作用
(表 2),随着 TDZ 浓度加大 ,类根体分化成类原球
茎束的数量增加 ,在 TDZ 质量浓度为 13 mg/L 时 ,
类原球茎束的发生率达到最高 ,为 71%,平均类原
球茎束数为 2.1个 。当 TDZ 的质量浓度进一步加
大时 ,类根体分化成类原球茎束的数量呈下降趋势。
a.类根体顶端膨大变绿发育成类原球茎;b.类原球茎;c.类原球茎萌发出芽;
d.再生植株;e.愈伤化的类原球茎;f.假珠芽的出现及发育;g.假珠芽的增殖;
h.假珠芽上的二次假珠芽(箭头所指);i.脱分化的假珠芽再生出芽(箭头所指)。
图 1　香水月季通过类原球茎途径再生过程
Fig.1　P lant reg ener ation of R.odorata via PLB
表 2　TDZ浓度对香水月季类根体分化成类原球茎束的影响
Table 2　Effect o f TDZ concentration on diffe rentiation o f rhizoid o f R.odorata
TDZ 质量浓度/
(mg/ L) 外植体数
产生类原球茎
的外植体数
类原球
茎束数
类原球茎束
生成率/ %
平均类原
球茎束数
0 0 0 0 0 0
7 24 6 8 25.3 b 0.8 a
11 24 9 18 37.7 ba 2.3 a
13 24 17 35 71.0 a 2.1 a
15 24 11 21 46.0 ba 1.8 a
17 24 11 18 46.0 ba 1.6 a
20 24 3 3 12.7 b 0.7 a
2.3　IBA浓度对类原球茎分化的影响
　　4周后将带类原球茎束的愈伤转接到萌发培养
基上进行芽的诱导 。 IBA的浓度影响类原球茎束的
萌发(表 3),在较低的浓度下 ,有的类原球茎束上的
32
　第 5 期 郭艳超等:香水月季类原球茎(PLBs)途径再生植株的研究
突起可以逐渐萌发形成正常的再生植株(图 1c 、 d);
随着 IBA 浓度的加大 ,类原球茎束会逐渐愈伤化 ,
形成胚性愈伤组织 ,愈伤组织上会有白色假珠芽出
现(图 1 e 、f)。结果表明 ,当 IBA 的浓度为 0.01
mg/L 时 ,类原球茎的萌发率达到最大 ,为 29.3%。
表 3　IBA的浓度对香水月季类原球茎分化的影响
Table 3　Effect of different concentr ations of IBA on
differentiation of PLB of R.odorata
IBA质量浓度/
(mg/ L) 外植体数 再生植株数
再生苗
发生率/ %
0.01 24 7 29.3 a
0.05 24 5 21.0 a
0.10 24 4 16.7 a
0.30 24 0 0
2.4　假珠芽的增殖 、脱分化及植株再生
　　将愈伤化的类原球茎束(带愈伤组织)转到含
0.1 mg/ L GA 3 、以麦芽糖为碳源的 1/2MS 培养基
上进行光照培养 ,可诱导出白色假珠芽(图 1 g),假
珠芽的发生率为 60%左右。随培养时间的延长 ,假
珠芽大量发生(图 1 g),并在假珠芽上产生二次假珠
芽(图 1 h);另外 ,在培养过程中有畸形芽的出现 ,
畸形芽上也会产生假珠芽。在该培养基上只有极少
假珠芽分化成正常植株 。
　　把假珠芽转到分别含2 ,4-D和 TDZ 的 MS或1/
2MS培养基上进行暗培养 ,1周左右后假珠芽表面即
开始膨大并愈伤化(表 4)。在暗培养过程中会有白
化苗出现 ,另外还会有新的假珠芽出现(图 1 i)。暗
培 4周后 ,假珠芽的脱分化率可以达到 75%左右。
表 4　不同激素对香水月季假珠芽愈伤化的影响
Table 4　Effect of different plant g row th regulato rs on differentiation o f pseudobulbils of R.odorata
培养基 2 , 4-D 质量浓度/(mg/ L) TDZ质量浓度/(mg/ L) 愈伤化程度 新珠芽
MS 2 0 高 有
1/ 2MS 2 0 中 无
1/ 2MS 0 2 低 有
　　把假珠芽在不同脱分化处理下形成的愈伤组织
分别接到 4种再生培养基上培养(表 5),进行小植
株的诱导。其中以 TDZ 暗培养后形成的假珠芽愈
伤组织在萌发培养基上萌发状态最好 ,愈伤组织颜
色翠绿 、上面有大量芽点 ,诱导出的小植株健壮 。在
再生培养基上 ,再生植株的诱导情况没有显著差异
(表 5),随着培养时间的延长 ,愈伤组织上还会出现
假珠芽 ,并且数量逐渐增多 。
表 5　激素组合对香水月季假珠芽愈伤化后小植株诱导的影响
Table 5　Effect of diffe rent combinations and concentra tions of plant g row th regulato rs on
the r egeneration of R.odorata mg/ L
激 素 种 类
BA IBA NAA GA
再生植株数 再生苗出现率/ %
2.0 0 0.01 0.1 13 43.3 a
2.0 0.01 0 0.1 14 46.7 a
3.0 0.01 0 0.1 7 23.3 a
0 0 0 0.1 16 53.3 a
2.5　再生苗的增值和生根移栽
　　将类原球茎束萌发的再生植株及假珠芽再生植
株转入增殖培养基上进行增殖培养 ,然后将生长健
壮的小苗转移到含 NAA(0.1 、0.2和 0.5 mg/ L)的
1/2M S培养基上进行生根培养 。在 NAA 0.2 mg/
L 时生根率达 100%,生根数多达 6 ～ 12 根 ,根粗
壮 、白褐色 ,未见须根 。再生植株炼苗 1周后移栽到
V(草炭土)∶V(蛭石)为 1∶1 混合后的灭菌基质
中 ,并置于 HPG-400H 光照培养箱中 ,光照强度为
10
4
lx 、光照时间 14 h 、昼夜温度 21℃/16℃、相对湿
度 60%,成活率达 95%,植株健壮。
3　讨　论
　　本试验以香水月季的无菌叶片为外植体 ,在 2 ,
4-D的作用下 ,高频诱导出类根体 ,本试验支持了前
人[ 1 0-12] 的研究结论 ,同时也证实了香水月季可以按
照 Tian Chuanw ei[ 9] 的方法通过类原球茎(PLBs)直
接萌发得到再生植株。另外 ,在实验过程中发现 ,香
33
中 国 农 业 大 学 学 报 2008 年 第 13 卷　
水月季也可以通过假珠芽得到间接再生植株 ,再生
率较高。
　　蔷薇属植物通过类原球茎再生植株的报道
极少 ,该途径的相关过程有待进一步研究 。通过
类原球茎再生植株具有潜在的高效性 ,在一定程
度上减轻了蔷薇属植物再生对基因型的依赖 。
这对蔷薇属植物的再生和以后的研究具有很重
要的意义 。
　　假珠芽在柑橘 、山茶属植物的研究中出现较
多[ 16-17] ,研究认为假珠芽是胚状体发育受阻后形成
的没有芽原基只有根原基以及只有不健全的维管组
织的特殊结构。假珠芽多为黄色 、黄白色 ,表面光
滑 ,多近球形 、拳头形以及云耳形 、瘤状等。假珠芽
的分化能力很强 ,经不同激素诱导可以生根 、分化胚
状体及丛生芽 ,增长迅速[ 18] 。
　　在蔷薇属植物上 ,正常发育的子叶数为 2。在
通过体细胞胚途径诱导体胚萌发时 ,子叶数目变异
很大[ 4 , 12 , 19] 。高丽萍等人以月季`萨蔓莎 的组培苗
叶片为外植体诱导出假珠芽[ 6] ,脱分化后得到生活
力强 、可长期继代的愈伤组织 ,再生出植株;田传卫
等人在多花蔷薇上以子叶为外植体诱导出假珠
芽[ 20] ,建立了再生体系 。
　　从有关文献报道可以看出 ,蔷薇属植物离体培
养过程中出现的这种非正常子叶应为假珠芽 ,其可
以做为材料进一步诱导出体细胞胚 。
参　考　文　献
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