全 文 ：　收稿日期:2009-10-11
基金项目:国家自然科学基金项目(30960194)
作者简介:王白羽(1984-), 女 ,硕士生 ,专业方向为作物高产 、优质 、抗性性状的育种。
通讯作者:孔广超(1970-), 男 ,副教授 ,从事作物遗传育种研究;e-mail:kgch ag r@shzu.edu.cn。
第 28卷　第 4期
2010年 8月
石河子大学学报(自然科学版)
Journal of Shihezi University(Natural Science) Vol.28 　No.4Aug.2010
文章编号:1007-7383(2010)04-0404-05
六倍体小黑麦耐盐相关基因 cDNA-AFLP
技术体系的建立
王白羽 ,任丽彤 ,曹连莆 ,孔广超
(石河子大学麦类作物研究所 , 石河子 832003)
摘要:为建立和优化六倍体小黑麦耐盐相关基因克隆 cDNA-AFLP 技术反应体系 , 并探索其应用效果 , 以对盐胁迫
反应不同的 4 个六倍体小黑麦品种(系)为材料 ,对其在 0.15 mo l/ L 氯化钠胁迫 72 h 的 cDNA-AFLP技术中 DNA
聚合酶浓度 、模版浓度和引物筛选等过程进行了摸索和优化。结果显示 ,建立了以 1.0 U Taq DNA 聚合酶为扩增
酶 、预扩产物稀释 20 倍 、EcoR I 和 Mse I 为内切酶及其相应接头为引物的六倍体小黑麦耐盐相关基因 cDNA-
AFLP技术体系 , 并从 64 对引物组合中筛选出稳定 、高效的引物组合以及 236 个差异片段。结果表明 , 该 cDNA-
AFLP技术体系更易分离出差异性片段 , 为六倍体小黑麦在盐胁迫及其它逆境环境下的基因克隆提供一种有效手
段。
关键词:小黑麦;耐盐基因;cDNA-AFLP;差异性片段
中图分类号:S512.4　　　　文献标识码:A　　　　
Contruction of cDNA-AFLP Technique for Genes Related to Salt Stress
in Hexopliod Tirticale
WANG Baiy u ,REN Litong , CAO Lianpu , KONG Guang chao
(Institute of T riticeae Crops , Shihezi Unive rsity , Shihezi 832003 , China)
Abstract:To const ruct a more eff icient cDNA-AFLP sy stem and explo re it s usage fo r gene clone related
wi th salt st ress in t ri ticale.Four t riticale varie ties o r lines wi th sensit ive or to le rant to sal t w ere used to be
st ressed by 0 .15 mol/ L NaCl fo r 72 hours as ma terials , the courses o f DNA Polymerase concentrat ion , tem-
plate concentration , primer screening in the cDNA-AFLP technolyg e w ere optimized .The result showed
that we const ructed the cDN A-AFLP sy stem that 1.0 U Taq DNA polymerase fo r pre-amplica tion enzyme ,
the 20 times of di luted pre-amplication product , EcoR I and M se I and their realted adapters fo r primers ,
and seve ral stable , edible primer combinations we re screened out of 64 pai rs of primers and 236 different ial-
ly expressed cDNA s w ere obtained w ith the new ly established cDNA-A FLP sy stem.The resul t indicated
that cDNA-AFLP could easily isolate more dif ferential cDNAfragments than usual AFLP techniques and it
wil l provide a powerful method fo r molecular cloning of g enes in t ri ticale rela ted wi th salt stress.
Key words:t ri ticale;salt stress;cDNA-AFLP;differential ly expressed cDNA s
DOI :10.13880/j.cnki .65-1174/n.2010.04.010
　　盐碱是影响全球大田作物持续生产的主要非生
物逆境之一 ,它影响了作物的正常生长 ,限制了作物
产量潜力的正常发挥。据统计 ,在影响作物产量的各
种环境因素中 ,干旱和盐碱所造成的减产损失高达
40%以上[ 1] 。全球约有 9亿 hm2 的土地存在不同程
度的盐碱化 ,占世界总耕地面积的 20%,其中中国盐
碱土面积约 2000万 hm2 [ 2] 。因此 ,如何开发和利用
盐碱化土壤 ,提高作物产量和品质已成为盐碱地农
业 、海水灌溉农业中亟待解决的重要问题[ 3] 。
小黑麦是由小麦和黑麦经属间人工杂交 、应用
染色体加倍技术育成的第一个新物种[ 4] 。其不仅具
有小麦籽粒高产 、优质的特性 ,也继承了黑麦生物学
产量高 ,对病 、虫害以及干旱 、瘠薄 、盐碱等不良环境
条件耐性较强的优点 。小黑麦的耐盐碱性及其生物
改良盐碱地的作用日益受到关注[ 5] 。但长期以来人
们对小黑麦耐盐机理知之甚少 。从基因表达的差异
入手 ,寻找与小黑麦耐盐性相关的基因 ,并对其功能
进行分析 ,对于深入了解小黑麦耐盐碱机理具有重
要的意义 。
cDNA-AFLP(cDNA amplified fragment length pol-
ymorphism)是 Bachem等[ 6] 在基因组 DNA 的选择性
扩增限制性片段即 AFLP(amplified f ragment length
polymorphism)的基础上创造出来的一种用于 RNA
指纹分析的方法 , 该法将 RT-PCR (reverse t ran-
scripted PCR)和 AFLP 技术结合起来 ,采用 PCR
中较高的退火温度和特定引物对包含信息较多的内
部特异片段进行选择性扩增 ,从而增加了反应的严
谨度 ,使其比 DDRT-PCR(differential display reverse
transcriptase PCR)的可靠性和可重复性大大提高[ 7] 。
本研究以六倍体小黑麦为材料 ,通过对限制性
酶切及连接 、PCR预扩增 、选择性 PCR扩增过程的
摸索 ,旨在优化小黑麦耐盐相关基因 cDNA-AFLP
技术反应体系 ,并从中筛选稳定 、高效的引物组合 。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　实验材料
供试的 4个六倍体小黑麦品种(系)为新小黑麦
3号 、新小黑麦 5号 、98-5981 、28ITSN-51 ,均为石河
子大学农学院麦类育种课题组提供 。其中新小黑麦
3号 、新小黑麦 5号在前期研究中表现为耐盐碱品
种 ,而 98-5981和 28ITSN-51对盐碱反应表现较为
敏感 。
本研究使用的胁迫前后的 RNA 模板为 4个品
种等比例混合的 RNA 。
1.1.2　主要试剂
Trizol试剂购自 TIANGEN 生物技术公司(北
京), cDNA合成试剂盒购自 Takara 生物技术公司
(大连)。所用 DNA 限制性内切酶 EcoRI 、M seI 以
及 T 4 DNA 连接酶 、Taq DNA 聚合酶 、接头及引物
都来自购于北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司的
AFLP试剂盒 。
1.2　方法
1.2.1　盐胁迫处理
将 4个小黑麦品种(系)的种子在发芽盒中进行
发芽 ,待长到一叶期时 ,转至培养盒中用 Hoag land
营养液水培 7 d左右[ 8] ,长至二叶一心后分为 2组 ,
一组采用0.15 mol/ L氯化钠胁迫处理 72 h ,另一组
(未胁迫)为对照。
1.2.2　RNA的提取
分别采集经氯化钠胁迫和对照组的新鲜 、幼嫩
叶片 ,利用 T rizol法提取 RNA [ 9] 。
1.2.3　cDNA的获得　
采用反转录 cDNA 合成试剂盒将获得的 RNA
合成双链 cDNA [ 10] ,做为 AFLP 分析模板 。
1.2.4　cDNA模板检测　
以管家基因 Actin为内参 ,检测所合成 cDNA模
板的质量 ,正义引物为:GGAAAAGTGCAGAGAGA-
CACG , 反义引物为:TACAG TG TCTGGATCG-
GTGGT
[ 11] ,扩增出目的片段后用 0.8%琼脂糖凝
胶电泳检测 。
1.2.5　酶切连接与预扩增模板的制备　
采用 EcoRⅠ和 M se Ⅰ酶对 cDNA 样品进行双
酶切 ,后用 EcoRⅠ和 M se Ⅰ接头连接 ,制备预扩增
反应模板 ,并对酶浓度和预扩增模板浓度进行梯度
设计。
1.2.6　选择性扩增　
各选用 8 个 EcoR Ⅰ和 M se Ⅰ引物 ,组合成 64
对选择性扩增引物 ,其序列如下:E+CA 、E+CT 、E
+CC 、E+CG 、E+AG 、E+GC 、E+AC 、E+GG 、M
+T T 、M +TA 、M +TC 、M +TG 、M +AA 、M +
A T 、M +AC 、M +AG 。
1.2.7　凝胶电泳　
选择性扩增产物经 0.8%琼脂糖凝胶电泳 ,验证
是否有产物以及产物分子量大小范围后 ,采用 6%变
性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行扩增产物分离[ 12] 。
1.2.8　银染显色　
在文献[ 13]中方法的基础上 ,对硝酸银的用量 、
405　第 4 期　　　　　　　　王白羽 ,等:六倍体小黑麦耐盐相关基因 cDNA-AFLP技术体系的建立　　　　　
银染时间以及显影的用量及操作作了改进 ,即银染
液为 1.6 g AgNO 3 +1 .5 mL 甲醛+1 L 去离子水 ,
染色时间为 25 min ,显影时间缩短为 5 min左右 。
2　结果与分析
2.1　cDNA的合成
利用 Trizol法所提取的六倍体小黑麦 RNA 经
电泳分析 ,结果(图 1)表明:所提取的 RNA完整 ,无
拖尾和降解现象 ,也无明显的 DNA 和蛋白质残留 ,
且其 OD 260/OD280值均为 1 .8 ～ 2.0。
用反转录 cDNA 试剂盒将 RNA 反转录为双链
cDNA ,以 Actin 引物扩增目的片段 ,电泳后在 150
bp出现较亮的条带(图 2),即 Actin 基因。这表明
所提取的 cDNA 完整 ,且其质量良好 ,同时由 RNA
反转录合成 cDNA 获得了成功 ,这些均表明由其反
转录合成的 cDNA 适于 AFLP 标记的分析 。
　
　　1:胁迫后样品 RNA;2:未胁迫样品的 RNA
　　　图 1　提取的小黑麦 RNA的电泳图谱
Fig.1 Electrophoresis pattern of RNA from tirticale
　　　　　　
1:胁迫样品 cDNA;2:未胁迫样品 cDNA;M:DNA marker
　　　　图 2　合成的 cDNA质量电泳图谱
　Fig.2 Electrophoresis pattern of cDNA from tirticale
2.2　Taq DNA聚合酶浓度对预扩增结果的
影响
设定 4 个 Taq DNA 聚合酶浓度梯度为 0.6 、
0.8 、1.0 、1.2 U 。由图 3可见 ,当 Taq DNA 聚合酶
为 0.8 U 和 1.0 U 时 ,均在 500 ～ 250 bp处出现了
弥散带 ,而在其他浓度时 ,均没有扩增到产物 。这表
明 0.8 U 和 1.0 U的 Taq DNA 聚合酶较为理想 。
在以上 Taq DNA 聚合酶浓度的基础上 , 最终
建立了 AFLP 预扩增反应体系:2.0 μL 模板 , 1.0
μL Pre-ampmix(10 μmo l/μL), 2 .5 μL 10 ×Buff-
er ,0 .5 μL dN TP (2.5 mmo l/L),0.5 μL Taq DNA
聚合酶(2 U/μL),18.5 μL 水 。
反应程序:94℃2 min;94 ℃30 s ,56 ℃30 s ,
72 ℃,80 s ,30个循环;72℃5 min。
2.3　模板浓度对选择性扩增的影响
AFLP技术对模板质量要求较高 ,而模板 DNA
的量在数十倍的范围内变动都不会对扩增的结果产
生明显影响 。如图 4所示 ,预扩产物在稀释 20倍和
50倍后分别作为模板进行选择性扩增时 ,扩增结果
基本上一致 。而稀释 50 倍的预扩产物在重复试验
时扩增效果不稳定 ,因此选择稀释 20倍预扩产物作
为模板为宜 。
　
M:DNA marker , 1～ 4 泳道相应的 Taq DNA
　聚合酶浓度依次 0.6、0.8 、1 和 1.2 U
图 3　不同 Taq DNA聚合酶浓度预扩电泳图谱
Fig.3 Electrophoresis pattern for the products of
　PCR amplification under different Taq DNA
　　　　polymerase concentration
　　　　　　　
M:DNA marker;1 、2 引物为 E+AG/M +AC;3、4 引物
为 E+AC/M+TA;5 、6 引物为 E+GC/M+TG;1 、3 、5
　为预扩产物稀 50 倍;2、4、6 为预扩产物稀 20 倍
　　　图 4　预扩产物稀释不同倍数的选扩图谱
Fig 4 Electrophoresis pattern for the products of PCR
　　amplification under different preampl ication
　　　　　　products concentration
406 　　　　　　　　　　　　　　石河子大学学报(自然科学版)　　　　　　　　　　　　　　　　第 28 卷　
　　在此基础上建立了适合的 AFLP 选择性扩增
反应体系:3 .0 μL 模板 , 0.8 μL EcoR Ⅰ选扩引物
(10 μmo l/L), 0.8 μL M se Ⅰ选扩引物 (10 μmol/
L),2.5 μL 10 ×Buf fer ,0 .45 μL dN TP (10 mmol/
L),0.31 μL Taq DNA 聚合酶(2 U/μL), 12.324
μL 水。
反应程序:94 ℃2 min;94 ℃30 s ,65 ℃30 s ,
72 ℃80 s ,退火温度每个循环降0.7 ℃、14个循环;
94 ℃30 s;55 ℃30 s ;72 ℃80 s ,23个循环;72 ℃
5 min。
2.4　引物筛选
由图 5可知 ,E+CC/M +AG 、E+CT/M +AG
等引物可以扩增出较稳定的条带。图 5还显示挑选
差异片段的 5种情况:
1)在盐胁迫处理和对照中的表达无明显的差
异 ,如图 5中的第 7和第 8泳道;
2)某一基因在对照中的表达比在盐胁迫处理的
样品强 ,例如图 5中的 A指示的谱带;
3)某一基因在样品中的表达比对照强 ,例如图
5中 B指示的谱带;
4)某一基因在对照中表达而在盐胁迫后不表
达 ,例如图 5中 C 所指示的谱带;
5)某一基因盐胁迫后才表达 ,而在对照样品中
无表达 ,例如图 5中的 D所指示的谱带 。
1 、3 、5 、7 、9 、11、13 均为盐胁迫混合样品;2 、4 、6 、8 、
10、12 、14为相应的对照组 ,每 1 对为 1 对引物扩
增的条带 , 如 1 和 2 的引物为 E+AG/M+AC
图 5　不同引物的聚丙烯凝胶电泳图谱
Fig.5 Polyacrylamide electrophoresis pattern for the
products of amplified by different primers
2.5　差异片段比对
经 64对引物的筛选共挑选出了 236个差异片
断(表 1),从中随机选取 100个进行二次扩增 ,已成
功扩增并克隆 、测序的差异性片段共 33 个 ,其它的
可能为假阳性。
表 1　筛选出的具差异性引物组合及差异片段数目
Tab.1 The screened different primer combinations
and differential ly expressed cDNAs
引物组合 差异片段总数 引物组合
差异片
段总数
E+AG/M+AC 14 E+CG/M+TG 5
E+AC/M+AG 4 E+GC/M+AG 10
E+AC/M+A T 5 E+GC/M+TA 7
E+AC/M+TA 4 E+GC/M+TC 6
E+AG/M+TC 5 E+GC/M+TG 6
E+CC/M+AC 7 E+CT/M+AC 10
E+CC/M+AG 11 E+C T/M+AG 15
E+CC/M+TG 13 E+CT/M +TC 8
　　将这 33个片段在 NCBI 中通过 Blast-X比对 ,
结果表明:有 30个与已知特定基因具有同源性 ,另
有 3个未找到具有同源性的已知基因或序列无任何
同源性 ,可能是尚未发现的新基因。在 30个已知基
因的同源片段中有 5个与耐盐性密切相关 ,如磷酸
酰丝氨酸脱羧酶 、谷氨酰胺依赖天冬酰胺合成酶 、碳
酸酐酶 、抗性蛋白;其余的 25个片段分别与高分子
量麦谷蛋白基因 ,光系统 II 32kDa蛋白 ,光系统 I疏
水蛋白(PSI)等基因具有同源性 。
3　讨论
在 cDNA-AFLP 技术中 ,当转录产物高度表达
时 ,扩增条带强度的高低能直接反应出基因表达量
的差别 ,所获得的转录衍生片段可最大限度的提供
基因编码区的信息 ,这使得 cDNA-AFLP 技术成为
一种分离差异表达基因的有效方法[ 14] 。
影响 cDNA-AFLP 结果的因素有很多 ,如 Taq
DNA 聚合酶的浓度 、预扩模板的浓度 、限制性内切
酶的组合等 。其中选择限制性内切酶的组合是最难
把握的 ,因为限制性内切酶要最大限度地覆盖 mR-
NA 池 ,这样才可以涵盖所有表达基因的信息[ 15] ,也
就要求对作物的遗传信息有更全面的了解 。
本研究建立了以 T rizol法提取 RNA 、1 .0U 北
京鼎国生物技术有限公司的 Taq DNA 聚合酶为与
扩增酶 、预扩产物稀释 20倍 、EcoR I 和 M se I为内
切酶及其相应接头引物为主要技术内容 ,同时结合
增加 AgNO 3 用量以及缩短显色时间的 cDNA-
AFLP技术体系。该技术体系比以往在作物上使用
407　第 4 期　　　　　　　　王白羽 ,等:六倍体小黑麦耐盐相关基因 cDNA-AFLP技术体系的建立　　　　　
的 AFLP 更易分离出差异性片段 ,其可靠性和可重
复性也有了较大提高[ 15] ,同时突破了常规的银染染
色方法 ,所得的小黑麦图谱条带清晰 、背景色淡 ,其
染色结果更利于数据的分析。
本实验利用 cDNA-AFLP 技术从小黑麦中克
隆了一些与盐胁迫反应相关的 cDNA 片段 ,它们有
可能在小黑麦的耐盐中起重要或决定性作用 。获得
的这些基因根据已知的 EST 序列进行了部分基因
的全长 cDNA 的克隆 ,获取了抗盐碱相关基因碳酸
酐酶 ,其与在 GenBank公布的大麦碳酸酐酶基因的
同源性为 79 %,这为进一步研究小黑麦盐碱相关基
因奠定了一定基础。
该 cDNA-A FLP 技术是首次应用于小黑麦分
子标记方面 ,不仅适合小黑麦逆境环境下基因的差
异性片段分离 ,也可为研究其它麦类作物通过 RNA
反转录和差显途径进行基因分子克隆提供参考。
参考文献:
[ 1] 赵可夫.盐生植物及其对盐渍环境的适应生理[ M] .北
京:科学技术出版社 , 2005.
[ 2] 吕贻忠 , 李保国.土壤学[ M] .北京:中国农业出版社 ,
2006.
[ 3] 杜金友 ,孟宪强.植物耐盐相关基因克隆与基因工程的
研究进展[ J] .河北科技师范学院学报 , 2006 , 20(1):
261-266.
[ 4] 孙　娜 ,石培春 , 魏凌基 ,等.冬春性小黑麦花药愈伤组
织诱导的影响因素[ J] .石河子大学学报:自然科学版 ,
2009 , 27(1):1-5.
[ 5] 李　诚 ,艾尼瓦尔 ·哈德尔 ,孔广超 , 等.不同饲用小黑
麦品种在新疆的最佳收草期研究[ J] .石河子大学学报:
自然科学版 , 2006 , 24(4):406-409.
[ 6] Bachem C W B , Van der Hoeven R S.Visualization of differ-
ential gene expression using a novel method of RNA finger-
printing based on AFLP:analysis of gene expression during
po tato tuber development[ J] .The Plant Journal ,1996 , 9(5):
745-753.
[ 7] Dur rant W E , Rowland O.cDNA-AFLP reveals a striking
overlap in race specific resistance and wound response gene
expression profiles[ J] .The Plant Cell , 2000 , 12:963-977.
[ 8] 和红云 ,薛　琳 ,田丽萍 , 等.低温胁迫对甜瓜幼苗根系
活力及渗透调节物质的影响[ J] .石河子大学学报:自然
科学版 , 2008 , 26(5):583-586.
[ 9] Gong L G , Shen L Z.Rapidly isolating total RNA from wheat
[ J] .Jiguang Shengwu Xuebao (Acta Laser Bio logy Sinica),
2002 , 11(4):301-304.
[ 10] Hartings H.High resolution fingerprinting of transcribed
genes by means of a modified cDNA-AFLP method [ J] .
Maydica , 1999 , 44:179-181.
[ 11] 刘建新 , 喻春明.苎麻果胶合成关键酶 GaIAT 基因的
克隆及表达[ J] .中国农业科学 , 2009 , 42(2):425-433.
[ 12] 刘　耘 , 熊家军.2 种方法银染的 AFLP片段再扩增效
果比较及改进[ J] .华中农业大学学报 , 2008 , 27:182-
185.
[ 13] Vos P ,H oge rs R.AFLP:a new technique fo r DNA fin-
ger printing[ J] .Nucleic Acids Research , 1995 , 23(21):
4407-4414.
[ 14] Qin L , Prins P.GenEST , a power ful link between cDNA
sequence data and gene expression profiles generated by
cDNA-AFLP[ J] .Nucleic Acids Research , 2001 , 29:1616-
1622.
[ 15] 王　锋.cDNA-AFLP 技术原理及其在研究植物基因
差异表达中的应用[ J] .生物学通报 , 2005 , 40(7):59-
60.
408 　　　　　　　　　　　　　　石河子大学学报(自然科学版)　　　　　　　　　　　　　　　　第 28 卷