全 文 ：麦类作物学报　2010 , 30(1):23-28
Journa l of T riticeae Crops
华山新麦草特异重复序列的筛选 、克隆及 Southern杂交分析
①
陈林刚 ,武 军 ,赵继新 ,刘淑会 ,杨群慧 ,杜万里 ,庞玉辉 ,陈新宏
(西北农林科技大学农学院 ,陕西杨凌 712100)
摘　要:为了寻找华山新麦草特异重复序列 ,以华山新麦草 、栽培一粒小麦 、栽培二粒小麦 、野生一粒小麦 、野
生二粒小麦 、圆锥小麦 、阿拉拉特小麦 、茹科夫斯基小麦 、斯卑尔脱小麦 、普通小麦“中国春”(CS)为材料 ,利用 200
条 RAPD 引物筛选出 11 条华山新麦草特异条带(命名为 RHS1 ～ RHS11), 并对这些条带进行回收 、克隆 、测序。
将序列在 NCBI数据库中进行比对 , 其中 RHS1、RH S2 、RHS3 、RHS4、RH S6 、RHS8 、RHS9 在 NCBI 数据库中未发
现与其同源的序列。 RHS5 、RHS7 、RH S10 、 RHS11 在 NCBI 数据库中有相似序列 ,其最高覆盖度和最高相似性分
别为:83%和 100%、99%和 85%、49%和 100%、19%和 83%。 通过 Southe rn blot ting 进行序列特异性检测 ,
RHS1 、RHS2、RH S4、RHS6 和 RH S9 等 5 个克隆在10 种材料中都没有杂交信号;RHS7 、RHS10 和 RH S11 在华山
新麦草及其他 9 种材料中都有弥散分布的杂交信号;RHS3、RHS5 和 RHS8 只在华山新麦草中有杂交信号的序
列。这些结果说明 RH S3、RHS5 、RHS8 为华山新麦草基因组特异重复序列。
关键词:华山新麦草;特异重复序列;克隆;Southe rn 杂交
中图分类号:S512;S330　　　　文献标识码:A　　　　文章编号:1009-1041(2010)01-0023-06
Screening , Cloning and Southern Blotting Analysis of Specific Repetitive
DNA Sequences of Psathyrostachys Huashanica
CHEN Lin-gang , WU Jun , ZHAO Ji-xin , LIU Shu-hui , YANG Qun-hui ,
DU Wan-li , PANG Yu-hui , CHEN Xin-hong
(College of Agronomy , Northw est A &F Universi ty , Yangling , Shaan xi 712100 , China)
Abstract:In o rder to screen specific repetit ive sequences of Psathyrostachys huashanica , 11 specific repet i-
tive DNA fragments of Psathy rostachy s huashanica were screened by using 200 RAPD random primers and
Tri ticum d icoccum , Tri t icum amy leum , Trit icum dicoccoides , Tri ticum turgidum , Tri ticum araratic-
um , Tri ticum zhukovsky i , Trit icum spel ta , Chinese Spring and P sathy rostachy s huashanica as mate rials.
Those f ragments w ere cloned , sequenced , and designed as RHS1 ～ RHS11.Blast analysis o f tho se se-
quences wi th those in nucleic acid database of NCBI w ebsi te revealed that the re w ere no homolo gical se-
quences of RHS1 , RHS2 , RHS3 , RHS4 , RHS6 , RHS8 , RHS9 , and the re w ere homolo gical sequenes fo r
RHS5 , RHS7 , RHS10 and RHS11 wi th the coverage and maximum identi ty of 83% and 100%, 99% and
85%, 49% and 100%, 19% and 83%, respect ively .The 11 sequences w as fur ther analy zed by Southern
Blo t ting , and the results show ed that there w ere no signals fo r RHS1 , RHS2 , RHS4 , RHS6 and RHS9 in
all 10 ma terials;And dispe rsive signals for RHS7 , RHS10 and RHS11 w ere observed in P sathy rostachy s
huashanica , as w ell as o ther 9 materials , only RHS3 , RHS5 and RHS8 had specific signals in Psathy-
rostachy s huashanica.The refore , RHS3 , RHS5 and RHS8 w ere the specif ic repeti tive sequences o f g e-
nome of P sathy rostachy s huashanica .
Key words:P sathy rostachy s huashanica ;Specific repet itive sequence;Cloning;Southern blo tt ing
①收稿日期:2009-05-12　　　修回日期:2009-08-10
基金项目:陕西省“ 13115”重大科技专项(2007ZDKG-01);西北农林科技大学育种专项。
作者简介:陈林刚(1982-),男 ,硕士研究生 ,主要从事小麦远缘杂交育种研究。 E-mai l:clgalg@yah oo.cn
通讯作者:陈新宏(1966-),男 ,研究员 ,博士后 ,主要从事小麦远缘杂交育种研究 , E-mai l:cxh2089@126.com
　　基因组特异性重复序列是指一个种或一个基因
组单独具有的 DNA 重复序列[ 1] 。目前 ,小麦族的
许多基因组都已克隆出其特异的重复序列。在大麦
属中克隆出的重复序列家族有:MHV 11 、MHV16 、
MHV56 和 MHV147 , pHv7036 、 pHv7161 、
pHv7191 、pHv7223 、pHv7241和 pHv7293[ 2] 。在黑
麦中 ,Bedbrook等[ 3] 用回收 Relic法 ,从黑麦的 Rel-
ic DNA 中分离出了 120 、480 、610 bp和 630 bp 等
4个重复序列家族;刘 成等[ 4] 利用 RAPD方法获得
了一个黑麦特异重复序列 pScD15940 ,并通过原位
杂交(FISH)定位了 pS cD15940在黑麦染色体上的
位置;另外 ,在黑麦中克隆出的特异重复序列还有
RXX630 家族[ 5] 、pS c200[ 6] 、Eco190I 家族[ 7] 、R173
家族[ 8] 、5.3-H3 家族和 350-480 bp 家族[ 9] 等 。在
小麦族其他物种中 ,刘 成等[ 10] 利用 RAPD 方法获
得了一个簇毛麦的特异重复序列 OPH121182;Li
等[ 11]利用基因文库法克隆了簇毛麦的特异重复序
列 pHvN AU62;Daud 和 G ustafson[ 12] 从拟斯卑尔
脱山羊草中克隆出 S 基因组的特异重复序列
pS pe135和 pSp89XI;Rayburn 和 Gill[ 13] 从粗山羊
草(D基因组)中克隆出 pAS1;孔秀英等[ 14] 从尾状
山羊草中克隆出 pAeca212等 。
华山 新 麦 草 (P sathy rostachy s huashanica
Keng., 2n=14 , NN)是禾本科(Gram ineae)小麦族
(Tri ticeae)大麦亚族(Hordeinae)新麦草属(Psa-
thy rostachy s)中的一个特异种 ,分布在中国秦岭山
脉华山段 ,为中国所特有 ,是国家一级珍稀濒危植物
和急需保护的农作物野生亲缘物种 ,是重要的小麦
近缘植物和小麦改良的重要外源材料 。Dew ey
等[ 15] 确认新麦草属的染色体组为 N , 是赖草属
(Leymus)中四倍体物种 N 染色体组的二倍体供体
种。万永芳等[ 16] 、井金学等[ 17] 、王美南等[ 18] 、魏芳
勤等[ 19] 研究表明 ,华山新麦草中抗小麦赤霉病 ,高
抗小麦条锈病和全蚀病 。因此 ,华山新麦草可以作
为多种优异外源基因的供体 ,是进行小麦遗传改良
的重要种质资源 。
目前 ,虽然在新麦草(P sathgrostachys juncea)
中也克隆出一些重复序列[ 20] ,但它们不是 N 基因组
所特有的 。有关华山新麦草基因组重复序列方面的
研究国内外尚未见报道。本研究利用 RAPD 分子
标记筛选华山新麦草基因组特异性扩增 DNA 片
段 ,回收测序 ,并通过 NCBI核酸数据库序列比对和
S outhern杂交分析进行特异性验证 ,以期获得华山
新麦草基因组特异的重复序列 ,为相关研究提供
参考 。
1　材料与方法
1.1　试验材料
供试材料华山新麦草(Psathy rostachy s huas-
hanica Keng., 2n =14 , NN)、普通小麦“中国春”
(Cine se Spring , 2n=42 , AABBDD)由本课题组保
存;栽培一粒小麦(Trit icum monococcum , 2n=14 ,
AA)、栽培二粒小麦(Trit icum d icoccum , 2n=28 ,
AABB)、野生一粒小麦(Tri ticum amy leum , 2n=
14 , AA)、野生二粒小麦(Tri ticum dicoccoides , 2n
=28 , AABB)、圆锥小麦(Tri ticum turgidum , 2n
=28 , AABB)、阿拉拉特小麦(Tri ticum araratic-
um , 2n=28 , AAGG)、茹科夫斯基小麦(Tri ticum
z hukovskyi , 2n =42 , AAAAGG)、斯卑尔脱小麦
(Trit icum spelta , 2n=42 , AABBDD)由中国农科
院作物科学研究所提供 。
1.2　基因组 DNA提取
参照 Dellapo rt 的 CTAB法[ 21] 提取。
1.3　RAPD分子标记筛选华山新麦草特异条带
RA PD引物由北京奥科公司合成 , RAPD 反应
体系 20 μL , 包括:10 ×PCR Buffer 2 μL , dN TPs
(2.5μmol·mL-1)2μL ,引物(2.5μmol·mL-1)1
μL ,Mg2+(2.5 mmo l·mL-1)1 μL , TaqE(5 U ·
μL-1)0.2 μL , 模板 DNA(40 ～ 60 μg ·μL-1)2
μL , ddH2O 11.8 μL;PTC-200上扩增 ,反应程序:
94℃预变性 4 min ,94℃1 min 、(34或 32℃)退火温
度 50 s 、72℃ 1 min , 35个循环 ,72℃延伸 10 min;
1%琼脂糖凝胶电泳 ,紫外光下观察;琼脂糖凝胶回
收试剂盒(博日)回收条带。
1.4　回收条带 TA克隆 、酶切鉴定和测序
将回收产物与 PMD19-T 载体连接(购自
TaKaRa),按说明书操作 。将 100μL 感受态细胞从
-70℃冰箱取出置冰上解冻后加入 10 μL 连接产
物 ,混匀 ,冰浴 30 min;置 42℃水浴中热击90 s后迅
速置冰上3 ～ 5 min ,向管内加入 890μL 的 LB培养
基(不含抗生素)混匀后 37℃200 r/min振荡培养 1
h ,3 000 r/min离心 1 min转移至超净工作台;弃去
600μL 上清液 ,悬浮沉淀 ,使之完全悬浮;吸取 50
μL悬液涂于固体 LB平板(含 AMP 、X-gal 、IPTG),
封口膜封口 ,正面向上放置 30 min ,待菌液完全吸
收后倒置培养皿 , 37℃培养 14 ～ 16 h;选取白色菌
落进行 PCR检测 ,挑取检测到目的片段的菌落于
10 mL LB培养基的三角瓶中 37℃振荡培养 16 h ,
待长到对数生长期用质粒提取试剂盒(博日)提取质
粒 。利用 EcoR Ⅰ 、P st Ⅰ两种内切酶进行单双酶切
·24· 麦　类　作　物　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　第 30 卷
鉴定阳性克隆含有的目的片段(反应体系见表 1),
1%琼脂糖凝胶电泳检测。经酶切鉴定含有目的片
段的克隆每个条带送样 5 个 ,交由上海生工生物公
司测序。
表 1　酶切反应体系
Table 1　Enzymatic reaction system μL
酶切组分
React ion
com ponen t
PstⅠ单酶切
Pst Ⅰ single
enzym e
digestion
EcoRⅠ单酶切
EcoR Ⅰ single
enzyme
diges tion
双酶切
Double
en zyme
digest ion
质粒 DNA
Plasmid DNA
4 4 4
10×H bu ffer 2 2 2
EcoR Ⅰ 0 1 1
p stⅠ 1 0 1
ddH 2O 13 13 12
total 20 20 20
1.5　NCBI Blast DNA序列比对
将测序得到的 DNA 序列在 NCBI 核酸数据库
中进行比对 ,筛选出不存在相似序列或相似度低的
序列 ,并在序列之间进行相互比对。
1.6　Southern blotting检测克隆序列特异性
DNA 消化用 Hind Ⅲ内切酶 ,上样量为15μg ,
恒压 35 V 电泳 6 h 。转膜及固定参照文献[ 22]进
行 。探针标记及检测用 Dig High Prime DNA
Labeling&Detection Starte r Kit Ⅰ(Roche , com-
pany),方法参照说明书。
2　结果与分析
2.1　华山新麦草的特异扩增条带
首先进行引物筛选 。选用 200 条 RA PD引物 ,
以华山新麦草基因组总 DNA 为模板进行扩增 ,其
中有 50条引物在华山新麦草中可以扩增出明显主
带 。利用这 50条引物对 10个供试材料的基因组总
DNA 进行扩增 ,筛选出 11条华山新麦草特异条带 ,
记为 RHS1 ～ RHS11(表 2)。部分凝胶电泳照片见
图 1。
表 2　从华山新麦草筛选得到的特异扩增条带
Table 2　The specific amplificated bands screened from Psathyrostachys huashanica
特异条带名
Speci fic band
RAPD引物名称
RAPD p rimer
特异条带数
Number of
specif ic band
特异条带名
Specif ic band
RAPD引物名称
RAPD primer
特异条带数
Number of specifi c band
RHS1 OPB-05 1 RH S7 OPL-05 1
RHS2 OPC-05 1 RH S8 OPN-05 1
RHS3 OPD-15 1 RH S9 OPV-15 1
RHS4 OPE-15 1 RH S10 OPAC-05 1
RHS5 OPF-15 1 RH S11 OPAJ-15 1
RHS6 OPJ-15 1
M :DNA分子量 Maker(DL2000);1:栽培一粒小麦;2:栽培二粒小麦;3:野生一粒小麦;4:野生二粒小麦;5:圆锥小麦;6:阿拉拉特小
麦;7:茹科夫斯基小麦;8:斯卑尔脱小麦;9:中国春;10:华山新麦草。箭头所指为回收片段。
M :DNA Maker(DL2000);1:Tri ticum monococcum;2:Tr it icum dicoccum ;3:Tr it icum amyleum ;4:Tr it icum d icoccoides;5:Tr i tic-
um turg idum ;6:Tri ticum ararat icum J akubz ;7:Tri t icum zhukovskyi ;8:Tri t icum spelta;9:Chinese S pring;10:Psathyrostach ys huas-
hanica.Arrow indicate th e reclaim ed band.
图 1　RAPD引物 OPN-05 扩增琼脂糖凝胶电泳图谱
Fig.1　Agarose gel eletrophoresis of PCR product of materials using OPN-05 primer
2.2　华山新麦草特异条带的 DNA序列
将 11条特异条带进行回收克隆 、酶切鉴定(图
2为 OPN-05的酶切电泳结果),并测序。得到 11
条回收条带的 DNA 序列 ,序列长度最短的为 431
bp ,最长的为 3 086 bp(表 3)。
·25·第 1 期　　　　　　　　　陈林刚等:华山新麦草特异重复序列的筛选 、克隆及 Southern杂交分析
M :DNA 分子量 Maker(DL2000);1:质粒;2:EcoR I 单酶切;3:P stⅠ单酶切;4:EcoRⅠ + PstⅠ双酶切;5:目的条带。
M :DNA Maker(DL2000):1:Plasmid;2:Sin gle enzym at ic diges tion wi th EcoR Ⅰ ;3:S ingle enzymatic digest ion w ith Pst Ⅰ ;4:Double
enzym at ic digestion w ith EcoR Ⅰ and P st Ⅰ ;5:T arget f ragm en t.
图 2　OPN-05 质粒酶切鉴定
Fig.2　Enzymatic reaction identify of plasmid OPN-05
表 3　回收条带的 DNA序列长度
Table 3　The length of reclaimed DNA Sequences bp
名称
Name
长度
Length
名称
Name
长度
Length
名称
Name
长度
Length
RHS1 624 RHS5 1 724 RHS9 906
RHS2 1 014 RHS6 3 086 RH S10 906
RHS3 1 109 RHS7 900 RH S11 431
RHS4 486 RHS8 1 289
2.3　华山新麦草 DNA序列的比对
将测序得 到的 DNA 序列输 入 NCBI 的
BLAST 框中查询 , 其中 RHS1 、RHS2 、RHS3 、
RHS4 、RHS6 、RHS8 和 RHS9 在 NCBI 数据库中
未发现与其同源的序列;RHS5 、RHS7 、RHS10 和
RHS11在 NCBI 数据库中有相似序列 ,其最高同源
区和最高相似性分别为:83%和 100%、99%和
85%、49%和 100%、19%和 83%(表 4)。11 条
DNA 序列之间比对不存在相似性 。
2.4　Southern blotting杂交检测
将 NCBI检索结果中不存在同源性或同源部分
小的序列做 Southe rn blot ting 分析 ,检测序列的特
异性。结果 , RHS1 、RHS2 、RHS4 、RHS6和 RHS9
在 10种材料中都没有杂交信号;RHS10和 RHS11
除在华山新麦草中有弥散的杂交信号外 ,在其他 9
种材料中也有弥散分布的杂交信号;RHS3 、RHS5
和 RHS8只在华山新麦草中有杂交信号 , RHS3和
RHS5的杂交信号呈弥散分布 ,而 RHS8有两条明
显主带(图 3)。
表 4　回收条带 DNA序列的 NCBI比对结果
Table 4　NCBI Blasting analysis of reclaimed DNA Sequences
名称
Name
NCBI 描述
NCBI Descrip tion
登陆号
Genbank accession
覆盖度
Coverage/ %
最大相似性
Maximum ident ity/ %
RH S1 - - - -
RH S2 - - - -
RH S3 - - - -
RH S4 - - - -
RH S5 Aegi lop s tausch ii AF446141.1 82 80
Hordeum vulgare EU812563.1 13 100
Tr it icum monococcum AY485644.1 7 84
Tr it icum aest ivum 3B chromosome AM 932684.1 4 100
RH S6 - - - -
RH S7 Tr it icum tu rg id um AY663391.1 99 84
Tr it icum monococcum 7A ch romosome AF488415.1 99 84
Tr it icum aest ivum 3B chromosome AM 932682.1 98 81
Aegi lop s tausch ii transposons AY534123.1 99 81
Tr it icum tu rg id um EF081027.1 56 85
RH S8 - - - -
RH S9 - - - -
RH S10 Hordeum vulgare AF474982.1 49 82
Tr it icum aest ivum 3B chromosome AM 932683.1 34 86
Aegi lop s tausch ii AF532104.1 6 100
RH S11 Tr it icum aest ivum genomic sequence DQ521892.1 19 81
Tr it icum monococcum AY951944.1 15 83
·26· 麦　类　作　物　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　第 30 卷
1:栽培一粒小麦;2:栽培二粒小麦;3:野生一粒小麦;4:野生二粒小麦;5:圆锥小麦;6:阿拉拉特小麦;7:茹科夫斯基小麦;8:斯卑尔脱
小麦;9:中国春;10:华山新麦草。
1:Tri ticum monococcum;2:Tri t icum dicoccum Schub l;3:Tr it icum am yleum;4:Tr it icum dicoccoid es;5:Tri t icum turgid um;6:
Tr it icum araraticum Ja kubz ;7:T ri ticum zhukovskyi Men.et E r;8:Tr i ticum spel ta;9:Chinese spring;10:P sath yrostachys huashanica.
图 3　OPD-15、OPF-15、OPN-05的 Southern杂交分析
Fig.3　Southern blotting of OPD-15 , OPF-15 andOPN-05
3　讨论
分子标记技术的发展为小麦遗传改良 、优良基
因的鉴定 、外源遗传物质的鉴定和遗传作图提供了
快速 、简单的手段 ,极大地缩短了育种年限。通过基
因连锁可将优良性状的基因定位到染色体的特定部
位上 ,同时不同基因组中都存在一些物种特异的
DNA 保守重复序列 ,利用这些保守的 DNA 重复序
列可以追踪到含有这些保守重复序列的染色体片
段。刘成等[ 4] 用 RAPD 引物筛选到黑麦基因特异
序列 OPH11679 ,利用 RAPD方法获得了一个簇毛
麦的特异重复序列 OPH121182[ 10] 。Daud 等[ 12] 从
拟斯卑尔脱山羊草中克隆出S 基因组的特异重复序
列 pSpe135 和 pSp89XI。 Rayburn 等[ 13] 从粗山羊
草(D基因组)中克隆出 pAS1 。孔秀英等[ 14] 从尾状
山羊草中克隆出 pAeca212。人们从小麦族很多种
属的基因组都筛选得到了一些基因组特异的重复序
列 ,并将这些特异重复序列成功转化成基因组特异
的分子标记(SCAR),用于追踪染色体片段 。而关
于华山新麦草基因组重复序列方面的研究国内外尚
属首次报道。
本研究利用 200条 10碱基 RA PD引物从华山
新麦草基因组中筛选特异重复序列 ,其中主带明显
且在华山新麦草与其他 9种材料之间显示多态性的
引物有 11条 。这 11条特异扩增 DNA条带中 ,有 6
条拷贝量较高 , 且重复性好 。测序后得到 11 条
DNA 序列 ,其长度为 431 ～ 3 086 bp。通过 NCBI
数据库检索 , 其中 7条未检索到与其同源的序列 ,
而其余 4 条检索到部分同源序列。通过多序列比
较 ,11条 DNA 序列之间不存在相似性。Southern
分析显示 ,仅有 3条序列只在华山新麦草中有杂交
信号。
11条 DNA 重复序列中 , RHS7在 NCBI 序列
比对中与小麦族很多物种都存在相似区域 ,且最高
达到 99%,说明 RHS7 不是华山新麦草所特有的 ,
可能在小麦族物种中普遍存在 。 RHS1 、RHS2 、
RHS4 、RHS6和 RHS9在 NCBI比对中不存在相似
序列 ,Southe rn杂交中没有杂交信号 , 说明目前在
NCBI中可能还不存在小麦族其他基因组与这 5条
序列具有同源性的 DNA 序列 。且由于这 5 条
DNA 序列在华山新麦草及其他 9种材料中的拷贝
量太低 ,杂交结合位点少 ,导致 Southern杂交中没
·27·第 1 期　　　　　　　　　陈林刚等:华山新麦草特异重复序列的筛选 、克隆及 Southern杂交分析
有杂交信号。RHS10和 RHS11在 NCBI 比对中有
相似序列 ,Southern杂交除在华山新麦草中有信号
外 ,在其他 9种材料中也有杂交信号 ,说明 RHS10 、
RHS11 和 RHS5 在 NCBI 中有部分同源序列 ,
S outhern杂交显示不为华山新麦草特异。RHS5在
NCBI中比对显示 , 小麦族其他物种中也存在与
RHS5部分同源的序列 ,但 Southern 杂交显示为华
山新麦草特异 ,可能是因为 RHS5 在其他材料中拷
贝量低 , 而在华山新麦草中的高拷贝量所致 。
RHS3和 RHS8 从特异序列筛选到 NCBI 序列比
对 ,再到 Southern 杂交序列特异性分析 ,都表现为
华山新麦草特异 ,说明 RHS3 和 RHS8 为华山新麦
草特异重复序列 。但其在华山新麦草染色体中的分
布有待进一步的研究 。
随着小麦-华山新麦草异附加系[ 23] , 异代换
系[ 24]材料的创制成功 ,使小麦从华山新麦草获得了
抗赤霉病[ 16] 、条锈病[ 17] 和全蚀病[ 18-19] 等优良的性
状。但由于外源遗传物质导入后分离复杂 ,且后代
不易稳定 ,这就对后代鉴定带来了很大的困难 。目
前 ,外源遗传物质的鉴定除采用同工酶分析 、顺序原
位杂交-分带技术 、顺序 GISH-FISH 原位杂交等传
统方法[ 23 , 25] 外 , SCAR 标记[ 26-27] 以其快速 、简便受
到人们的重视。本试验所得到的特异重复序列有望
转化成为华山新麦草特异 SCA R标记 ,用于鉴定小
麦-华山新麦草异附加系 、异代换系中华山新麦草的
遗传物质以及确定小麦中来自华山新麦草的异源染
色体段属于华山新麦草哪条染色体以及具体的染色
体部位。
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·28· 麦　类　作　物　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　第 30 卷