全 文 ：中国农业科学 2016,49(19):3683-3693
Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2016.19.002

收稿日期：2016-04-15；接受日期：2016-06-01
基金项目：国家自然科学基金（31371622）、国家高技术研究发展计划（2011AA1001）、国家小麦产业技术体系（CARS-3-1-2）
联系方式：姚涵，Tel：010-82105833；E-mail：nxzzyh0913@163.com。通信作者张学勇，Tel：010-82106695；E-mail：zhangxueyong@caas.cn


偃麦草基因组特异重复序列的分离与应用
姚 涵 1,2，汤才国 1,2，赵 静 1,2，郑 琪 3，李 滨 3，郝晨阳 2，李振声 3，张学勇 2
（1 南京农业大学农学院，南京 210095；2 中国农业科学院作物科学研究所，北京 100081；3 中国科学院遗传与发育生物学研究所/植物细胞与
染色体工程国家重点实验室, 北京 100101）

摘要：【目的】偃麦草（Thinopyrum）是小麦（Triticum aestivum L.）的多年生野生近缘植物，具有许多
可用于小麦品种改良的优异基因。利用基因组特异重复序列可以研究物种的进化关系、绘制染色体指纹图谱及检
测外源染色质。克隆十倍体长穗偃麦草（Th. ponticum (Host) Liu and Wang）基因组特异重复序列，可用于鉴
定和追踪导入到小麦背景中的偃麦草遗传物质。【方法】通过构建十倍体长穗偃麦草小片段质粒文库，并对文库进
行高密度点杂交（Dot-blot hybridization）筛选，结合荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，
FISH）技术，获得偃麦草基因组特异的重复序列，分析其在不同基因组及染色体上的分布特点。利用 Repeat Masker
在小麦族重复序列数据库（Triticeae repeat sequence database，TREP）及 NCBI GenBank 对特异重复序列进行
比对分析，并设计偃麦草基因组特异重复序列的 PCR 引物。通过 FISH 分析和特异 PCR 引物扩增，对小麦-偃麦草
衍生后代进行鉴定和选择。【结果】获得 7 条偃麦草基因组特异的重复序列。FISH 分析表明，其在十倍体长穗偃
麦草和六倍体中间偃麦草所有染色体两臂上均呈弥散型分布，且在不加小麦封阻 DNA 的情况下，能明确区分八倍
体小偃麦中的偃麦草和小麦染色体。将其应用到小麦-偃麦草代换系和易位系的分子细胞学检测中，特异重复序列
同样可以在不加封阻的情况下分辨出偃麦草染色体及染色体片段，而且信号相比基因组原位杂交（genomic in situ
hybridization，GISH）更加特异和清晰。基于偃麦草基因组特异重复序列开发了 90 对引物，通过在中国春、十
倍体长穗偃麦草和八倍体小偃麦中的扩增产物比较分析，筛选出 36 对（40%）偃麦草基因组特异 PCR 标记；利用
这些特异引物对 109 份小麦-偃麦草衍生材料进行扫描，发现 10 对扩增效果较好的特异引物，其检测效率为 73.3%
—95%。【结论】获得偃麦草基因组特异的重复序列，开发了特异 PCR 扩增引物，可应用于小麦背景下偃麦草遗传
物质的高效检测和跟踪。
关键词：小麦；偃麦草；特异重复序列；荧光原位杂交；PCR

Isolation of Thinopyrum ponticum Genome Specific Repetitive
Sequences and Their Application for Effective Detection of
Alien Segments in Wheat
YAO Han1, 2, TANG Cai-guo1, 2, ZHAO Jing1, 2, ZHENG Qi3, LI Bin3, HAO Chen-yang2,
LI Zhen-sheng3, ZHANG Xue-yong2
(1College of Agriculture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095; 2Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of
Agricultural Sciences, Beijing 100081; 3Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences/State
Key Laboratory of Plant Cell and Chromosome Engineering, Beijing 100101）

Abstract: 【Objective】As a tertiary gene pool of wheat, Thinopyrum genus has many useful traits, such as tolerance to both
abiotic and biotic stresses. DNA repetitive sequence is one major component for genomes of most eukaryotes. Isolation of genome
3684 中 国 农 业 科 学 49 卷

specific repeats is very helpful for understanding of sub-genome component of polyploid species, their evolution and utilization in
crop improvement. To identify Th. ponticum chromatin in wheat genetic background more accurately and efficiently, genome
specific repetitive sequences were cloned from Th. ponticum.【Method】Screening the plasmid library of Th. ponticum via dot-blot
hybridization, combining with fluorescence in situ hybridization (FISH) analysis of the wheat-Th. ponticum partial amphiploids, Th.
ponticum genome specific repetitive sequences were isolated and their distribution patterns on chromosomes were characterized by
FISH. The Th. ponticum genome specific repeats were analyzed by Repeat Masker, Triticeae Repeat Sequence Database and NCBI.
A set of PCR primers was designed for detecting Th. ponticum chromosomal fragments. Wheat-Th. ponticum hybrid derivatives were
employed to testify the genome specificity and effectiveness of these repeats in identifying Th. alien fragments in wheat genetic
background. 【Result】Seven Th. ponticum genome specific repetitive sequences were obtained. Their FISH signals dispersively
covered all chromosomes in Th. ponticum and Th. intermedium. Furthermore, they could discriminate chromosomes of Th. ponticum
and Th. intermedium from wheat chromosomes without wheat DNA block by FISH. This was further proved in wheat-Th. ponticum
substitution lines and translocation lines. Ten PCR primers were developed for efficient amplification of Th. ponticum segments in
wheat. Their detection efficiency ranged from 73.3% to 95% in 109 wheat-Th. ponticum derivatives. 【Conclusion】Th. ponticum
genome specific repetitive sequences were isolated, which can be used for detection of wheatgrass fragments in wheat by FISH or
PCR amplification.
Key words: T. aestivum; Th. ponticum; genome specific repetitive sequences; FISH; PCR

0 引言
【研究意义】在小麦种质资源中，野生种的遗传
多样性最丰富[1]，蕴藏着大量的优异基因[2-7]，因此，
远缘杂交是小麦品种改良的重要方法之一。基因组原
位杂交具有直观、有效的特点，已被广泛用于检测和
鉴定小麦或其他栽培作物背景下的外源遗传物质。在
育种工作中，物种间亲缘关系越近，越容易杂交成功，
但在外源片段检测时，基因组之间的非特异交叉杂交
就难以避免，即使探针﹕封阻 DNA 达到 1﹕50—1﹕
70，基因组原位杂交（genomic in situ hybridization，
GISH）也能够在小麦染色体上产生较强的信号[8]。小
麦族植物基因组中重复序列含量高达 70%以上[9]，利
用基因组特异重复序列可以深入研究异源多倍体的构
成，进行核型分析和染色体识别，揭示基因组间相互
渗透的机理[10-12]。因此，分离筛选更多异源染色质特
异性序列，用于外源遗传物质的追踪和鉴定[13-17]，对
于提高小麦远缘杂交后代的选择效率和准确性具有重
要意义。【前人研究进展】迄今，偃麦草是小麦遗传
改良中利用最为成功的多年生野生近缘种。孙善澄先
生从 20 世纪 50 年代就开始尝试将中间偃麦草的优良
性状导入小麦中，在国内首先创造和培育出中 1—中 5
等 5 个具有特殊抗性、品质优良的八倍体小偃麦，其
中，中 4 和中 5 高抗黄矮病已成为全球小麦抗病育种
的重要抗源材料，先后被利用培育成龙麦 10 号、晋春
9 号、高优 503 等抗耐黄矮病新品种[18-23]。李振声等[24]
将普通小麦与十倍体长穗偃麦草杂交选育出了丰产、
抗病的冬小麦新品种小偃 6 号，并已成为中国优质小
麦的育种骨干亲本。随后，他们又以小偃 6 号为基础
材料，选育出了面粉品质优良、抗逆与抗病性强、适
应性广、产量稳定的小偃 54、小偃 81 等小麦新品种。
夏光敏等[25]利用不对称体细胞杂交技术，将长穗偃麦
草的染色体小片段导入济南 177，最终获得了耐盐、
高产的小麦新品种山融 3 号。总体来说，偃麦草属作
为普通小麦的三级基因源[1]，随着表型、基因型鉴定
技术的发展，必将在小麦品种改良中发挥更重要的作
用。目前，在荧光原位杂交（ fluorescence in situ
hybridization，FISH）检测中，最常用的探针有 5S 和
45S rDNA 基因、pSc119.2 和 pAs1、端粒区的串联重
复序列以及着丝粒特异重复序列等，还有一些从各个
基因组中克隆的序列[26]。例如，KATO 等[27]利用重复
序列在染色体上的分布特征，建立了玉米染色体分子
核型模式图，通过 FISH 的方法就能将玉米 10 对染色
体区分开。ZHANG 等[28]通过回收 RAPD 扩增产物分
离出簇毛麦基因组特异的 Gypsy 类反转录转座子
C1-10，可以将小麦-簇毛麦双二倍体和易位系中的簇
毛麦染色体及染色体片段鉴定出来；同时，将特异序
列转化为 SCAR 分子标记，可用于追踪小麦-簇毛麦杂
交后代中的外源遗传物质。DENG 等[29]通过微分离和
微克隆技术，得到了黑麦 1RS 和 1R 染色体的
DOP-PCR 产物，利用其对六倍体小黑麦进行 FISH 分
析（未加小麦封阻），发现杂交信号只分布在 14 条黑
麦染色体上；而 GISH（加封阻）在小麦中产生非特
异杂交。说明得到的序列为 R 基因组特异，可用于检
19 期 姚涵等：偃麦草基因组特异重复序列的分离与应用 3685

测小麦背景下的黑麦染色体。【本研究切入点】前人
通过基因组文库法、分离基因组特异 RAPD 片段和
PCR 增效减法杂交等技术，从长穗偃麦草、百萨偃麦
草和二倍体拟鹅观草中克隆出一些 E 组（包括 Ee 和
Eb）和 St 组特异的重复序列[30-34]，可以用来检测导入
到小麦背景中的偃麦草染色体。尚未见有分离十倍体
长穗偃麦草基因组特异重复序列的研究报道。【拟解
决的关键问题】本研究通过点杂交和荧光原位杂交等
方法，获得十倍体长穗偃麦草基因组特异的重复序列，
将其用于 FISH 分析，可以准确、高效地鉴定小麦-偃
麦草杂交后代的外源染色体及染色体片段。同时，利
用这些特异重复序列设计 PCR 引物，进一步丰富了偃
麦草特异的分子标记，为建立小麦-偃麦草系列导入系
提供工具，为导入性状的遗传解析提供方便。
1 材料与方法
1.1 材料
普通小麦中国春（T. aestivum L.，2n = 42，ABD，
Chinese Spring），十倍体长穗偃麦草（Th. ponticum
(Host) Liu and Wang，2n = 70，StStEeEbEx，PI578682），
六倍体中间偃麦草（Th. intermedium (Host) Barkworth
and D. R. Dewey，2n =42, StEeEb，Z1141），黑麦（Secale
cereal L.，2n =14，R），大麦（Hordeum vulgare L.，
2n = 14，H），八倍体小偃麦小偃 693（2n = 56，ABDE）
和小偃 784（2n = 56，ABDSt(E)），小麦-偃麦草杂交
衍生系材料。
1.2 高密度膜点杂交
十倍体长穗偃麦草小片段质粒文库（1—5 kb）高
密度膜的制备过程如下：利用 HindⅢ和 DpnⅡ分别对
十倍体长穗偃麦草基因组 DNA 进行完全酶切，同时
分别对 pUC19 载体进行完全酶切，采用 T4 DNA 连接
酶连接，电转至大肠杆菌感受态细胞中，将复苏好的
菌液涂布到 LB 固体培养基（Car./IPTG/X-gal）方板中
进行培养。用 Genetix QPix Robert （BioSurplus）中
的 Picking 挑取克隆；通过 Genetix QPix Robert 中的
Gridding 将克隆转到 Biodyne plus 型印迹膜（PALL）。
待膜上的菌斑生长至大小合适后裂解膜上细菌并洗脱
处理，干燥后保存备用。
用十倍体长穗偃麦草（PI578682）基因组 DNA
作探针，将其用非接触式超声波破碎仪（Diagenode
SA）打断至 500 bp—1 kb，主要富集于 750 bp；封
阻为中国春基因组 DNA，打断至 200—500 bp，-20
℃保存备用。使用 Random Primer DNA Labeling Kit
Ver. 2（TaKaRa）试剂盒进行探针的标记，采用[α-32P]
dCTP 来标记 DNA。分别按照 1﹕35 和 1﹕50 的探
针/封阻比例，进行 2 次点杂交筛选，具体方法同
Southern 杂交[35]。
用磷屏扫描仪（BIO-RAD）检测杂交膜信号，
根据信号的强弱，选择适当的压屏时间。用Quantity-
one软件分析图像，在Photoshop CS6中进行图像整理。
1.3 荧光原位杂交
挑选饱满的种子置于垫有双层湿滤纸的培养皿中
23℃萌发，露白后在 4℃条件下作同步化处理 24 h，
然后转入 23℃恒温培养 24 h，剪取长度适宜的根尖，
参考 HAN 等[36]描述的方法进行有丝分裂中期染色体
的制备。原位杂交参考 LI 等[37]的方法。以偃麦草特异
序列为探针，通过缺刻平移法用 Digoxigenin-11-dUTP
或 Biotin-16-dUTP（Roche）标记，二抗为 Anti-dig-
Rhodamine 或 Avidin-FITC（Roche）。用 Axio Imager.
Z2（Carl Zeiss）荧光显微镜观察，经 AxioCam HRc
高分辨彩色 CCD 进行图片的采集，并用 ZEN 2012 软
件分析处理图片。
1.4 测序及序列分析
使用通用引物 M13F（-47）和 M13R（-48）对特
异序列进行测序，在此基础上继续设计引物直至将序
列测通。利用 Lasergene 软件中的 SeqMan 程序进行拼
接组装，并去除低质量序列和载体序列。
利用 Repeat Masker 在线软件（ http://www.
repeatmasker.org/cgi-bin/WEBRepeatMasker）和 TREP
数据库[38]（http://wheat.pw.usda.gov/GG2/blast.shtml）
对特异序列进行分析，在 NCBI BLAST（http://blast.
ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中进行同源比对。
1.5 引物设计
利用 URGI（https://urgi.versailles.inra.fr/blast/blast.
php）中的小麦 21 条染色体数据库、乌拉尔图小麦基
因组数据库、拟斯卑尔脱山羊草基因组数据库以及粗
山羊草基因组数据库进行比对，选择相似性高的序列
保存为.fas 格式的文件。用 DNAStar 中的 MegAlign
软件找到差异位点或低相似区开发特异分子标记。利
用 primer 3.0（http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/）在线
软件设计引物，引物编号为序列名称和扩增片段大小
的组合。全部引物均由生工生物工程（上海）股份有
限公司合成。
1.6 DNA 提取及特异标记的 PCR 检测
按 CTAB 法提取材料基因组 DNA。PCR 扩增体
系为 15 µL，包括模板 DNA 50 ng 左右、Primers（10
3686 中 国 农 业 科 学 49 卷

µmol·L-1）0.5 µL、10×Taq buffer 1.5 µL、Mg2+（25
mmol·L-1）0.8 µL、dNTPs（25 mmol·L-1）0.1 µL、Taqase
（5 U·µL-1）0.1 µL，加 ddH2O 至 15 µL。PCR 反应程
序为 94℃ 5 min；94℃ 45 s，56—61℃（根据引物调
整退火温度）45 s，72℃ 1 min，33 个循环；72℃ 10
min；4℃保存。扩增产物用 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。
2 结果
2.1 十倍体长穗偃麦草基因组特异序列的分离
利用十倍体长穗偃麦草（PI578682）基因组 DNA
作探针，中国春基因组 DNA 作为封阻，对已构建的
十倍体长穗偃麦草质粒文库进行筛选。通过首次点
杂交（探针﹕封阻=1﹕35），从 8 张高密度膜（共
计 36 864 个克隆）中筛选获得 2 197 个阳性克隆，
有 439 个信号较强（图 1-A）。在文库中挑取对应
的克隆并提取质粒，将其集中在一张杂交膜上，进
行第二次点杂交（探针﹕封阻=1﹕50），筛选出 77
个信号较强的阳性克隆（图 1-B）。其中，19 个克
隆在 2 次点杂交中信号均较强，为分离所得的偃麦
草特异序列。


A 和 B 为 2 次点杂交，均以十倍体长穗偃麦草基因组 DNA 作探针，普通小麦中国春基因组 DNA 作封阻。A：探针﹕封阻=1﹕35；B：探针﹕封阻
=1﹕50
Dot hybridization to screen out the candidate clones. Probe: Th. ponticum genomic DNA, Block: CS genomic DNA. A: Probe:Block=1:35; B: Probe: Block=1:50

图 1 十倍体长穗偃麦草质粒文库高密度膜的点杂交结果
Fig. 1 Dot-blot hybridization of Th. ponticum plasmid library

2.2 通过 FISH 分析获得 7 条偃麦草基因组特异的重
复序列
由于八倍体小偃麦的细胞中同时含有偃麦草和小
麦的染色体，因此，首先将这 19 条序列对其进行荧光
原位杂交，分析它们在不同基因组中的分布情况。
FISH 试验结果显示，有 7 条序列能够在小麦背景下清
楚地区分小麦和偃麦草染色体，如 B11 在没有封阻
DNA 的情况下，在小偃 693 和小偃 784 中分别有 16
条和 14 条偃麦草染色体产生特异的杂交信号（图 2-A
和图 2-B），且在两臂上呈弥散型分布，而小麦染色
体几乎没有分布。另外 12 条序列由于在小麦染色体上
也能观察到很明显的杂交信号（图片未显示），故不
作进一步研究。
利用 B11 对十倍体长穗偃麦草（PI578682）和六
倍体中间偃麦草（Z1141）分别进行 FISH 分析，发现
该序列比较均一地分布在所有染色体上（图 2-C 和图
2-D），其余 6 条特异序列的荧光原位杂交结果与 B11
一致。鉴于十倍体长穗偃麦草和六倍体中间偃麦草，
均由 St、Ee和 Eb 3 个基因组构成，因此，说明分离到
的 7 条序列为偃麦草基因组特异序列，并在小麦-中间
偃麦草衍生的八倍体小偃麦中 5 及小偃 78829 中得到
验证（图片未显示）。
2.3 七条特异重复序列均属于 LTR 类反转录转座子
由测序结果可知，7 条偃麦草特异重复序列的片
段大小为 2—5 kb，GC 含量均高于 50%。在小麦族重
复序列数据库（TREP）中比对发现，它们均与 LTR
（long terminal repeat）类反转录转座子中的 Gypsy 类
型存在同源性。具体结果如下：A05 和 D05 都与来
19 期 姚涵等：偃麦草基因组特异重复序列的分离与应用 3687

A B
C D

A：小偃 693；B：小偃 784；C：PI578682；D：Z1141。探针均为特异序列 B11，没有加封阻。绿色信号显示偃麦草染色体，图示标尺=10 μm
A: Xiaoyan 693; B: Xiaoyan784; C: PI578682; D: Z1141. Th. ponticum chromosomes were stained by green signals using B11 as probe without block. Scale
bar = 10 μm

图 2 特异序列 B11 在八倍体小偃麦和偃麦草上的分布情况
Fig. 2 Distribution patterns of B11 on the chromosomes of wheat-Th. ponticum partial amphiploids, Th. ponticum and Th.
intermedium

表 1 基于 NCBI 数据库的比对结果
Table 1 Result of alignment in NCBI
同源序列 Homologous sequence 序列名称
Sequence
name
登录号
Accession
No.
长度
Sequence
length (bp)
GC 含量
GC
content (%)
登录号
Accession No.
相似度
Identity (%)
备注
Repeat characterization
来源
Resource
A05 KX241607 3905 51.5 EU331360.1 89 E-genome specific Th. elongatum
B08 KX241608 2195 52.1 CT009735.1 80 LTR retrotransposon, Gypsy T. aestivum
B11 KX241609 2176 51.7 EU331361.1 83 E-genome specific Th. elongatum
D05 KX241610 2797 51.2 HE774676.1 87 Retrotransposon T. aestivum
E04 KX241611 4936 51.7 AM932681.1 84 LTR retrotransposon, Gypsy T. aestivum
F05 KX241612 4663 50.1 EF567062.1 80 LTR retrotransposon, Gypsy T. aestivum
F08 KX241613 3077 53.7 FN564432.1 82 LTR retrotransposon, Gypsy T. aestivum

自小麦（T. aestivum）的 TREP3203 同源，B08、B11
和 F08 都与来自大麦（H. vulgare）的 TREP2357 同源，
E04 与来自栽培一粒小麦（ T. monococcum）的
TREP253 同源，F05 与来自圆锥小麦（T. turgidum）
的 TREP1417 同源。
在 NCBI 网站分别进行 BlAST，将比对结果中相
3688 中 国 农 业 科 学 49 卷

似性高的同源序列进行了整理（表 1）。以上结果表
明，这些特异重复序列很可能来自 Gypsy 类反转录转
座子家族。
2.4 小麦-偃麦草代换系和易位系的 FISH 分析
获得的特异性序列能够覆盖偃麦草所有染色体
（图 2-C 和图 2-D），使得利用其对小麦-偃麦草附加
系、代换系及易位系进行 FISH 鉴定成为可能。利用
特异性序列 B11 对小麦-中间偃麦草 4St(4D)代换系
（原代号为 4Ei(4D)）和小麦-长穗偃麦草 4E(4D)代换
系（原代号为 4Ee(4D)）[39]进行 FISH 分析，结果显示
特异探针可以区分偃麦草和小麦染色体（图 3-A 和图
3-B）。另外 6 条序列产生的杂交信号与 B11 一致。
将 7 条特异序列分别对创制的小麦-十倍体长穗偃麦
草广谱抗条锈易位系 GDR4[40] 进行 FISH 分析，发现

A B C
D E F
G H I
A05
D05B11B08
F08F05E04
A：小麦-中间偃麦草 4St(4D)代换系，B：小麦-长穗偃麦草 4E(4D)代换系，探针均为 B11，绿色信号为偃麦草染色体；C—I 均为小麦-十倍体长穗偃
麦草抗条锈易位系 GDR4，探针分别为 A05、B08、B11、D05、E04、F05 和 F08，红色信号为偃麦草易位片段。FISH 分析中均未加封阻 DNA，图
示标尺=10 μm
A: Wheat-Th. intermedium 4St(4D) substitution, B: Wheat-Th. ponticum 4E(4D) substitution, C-I: Wheat-Th. ponticum translocation line GDR4. A and B:
Probed by B11, C-I: Probed by A05, B08, B11, D05, E04, F05 and F08 respectively. No wheat blocking DNA was used in FISH hybridization. Scale bar = 10
μm

图 3 特异重复序列对偃麦草片段 FISH 检测能力的分析
Fig. 3 FISH detection ability of Th. ponticum genome specific repetitive sequences
19 期 姚涵等：偃麦草基因组特异重复序列的分离与应用 3689

所有探针均可以将偃麦草染色体片段检测出来（图
3-C—图 3-I）。以上结果表明，利用偃麦草基因组特
异重复序列进行 FISH 分析，能够产生类似 GISH 的杂
交信号，即使在不加小麦封阻 DNA 的情况下，依然
可以获得清晰的信号。
2.5 PCR 特异扩增标记对小麦-偃麦草衍生后代的
鉴定
基于 7 条偃麦草特异序列开发了 90 对引物，其中
36 对（40%）在十倍体长穗偃麦草和八倍体小偃麦中
具有特异性扩增，而在中国春、黑麦和大麦中均没有
扩增出目的条带（图 4）。通过对 109 份小麦-偃麦草
衍生材料（8 份材料经 GISH 分析没有检测到偃麦草
染色体或染色体片段，其余 101 份材料均检测到易位
片段）进行扫描，发现有 10 个特异 PCR 标记（表 2）
检测效率较高，能鉴定出 73.3%—95%有偃麦草染色
体信号的材料（图 5）。

表 2 十对可在小麦背景下扩增偃麦草特异重复序列的引
物信息
Table 2 Primer sequences to amplify Th. ponticum genome
specific repeats in wheat background
引物名称
Primer name
序列
Sequence (5′-3′)
退火温度
Tm (℃)
A05-332-F GGATCTCTGGGTGAGGTTGAAACT
A05-332-R CATCGGGGTAGTAGCAGCGA
60
A05-372-F GCATTGTGTTGCTCATGTTAGTTG
A05-372-R CTTCAGATAATCCAGCGAGGTAGT
58
A05-710-F GTGACCCCACTTATCCCGACT
A05-710-R CGTGCTGCGATGCTGAACT
61
A05-958-F GGCACTGCGTTAGATCACCT
A05-958-R AAATCATAGTGGACTAGGGGCTT
58
B08-742-F AATCGTAGTGGACTAGGGGCTT
B08-742-R CATACCGATATCGCCTACTCTTC
59
B08-817-F CGGACTAATCCTATGCGCAAG
B08-817-R GTGACCCCACTTATCCCGAC
61
B11-491-F CAGACGATACAGCAGACGACCTT
B11-491-R CTCGAAGCCCACACTTGAGAA
57
B11-547-F CAGAACGACGAGCCGAGTCTA
B11-547-R GGGACAAGTGGGTCTCTGACAT
58
D05-280-F CGTAGCTCAGATTGAAAAGGTTAAA
D05-280-R GAAACAGGTAAACATAATGCAAACAA
56
D05-813-F CAGAACGACAAGACGAGTCTGATC
D05-813-R CTCGAGGTCCACACTTGAGAA
59

A05-332
A05-710
B08-817
B05-813
B11-547
PI578682 CS Rye Barley XY693 XY784 H2O


图 4 PCR 标记扩增特异性检测
Fig. 4 PCR-amplification profiles of Th. ponticum genome
specific repeats

3 讨论
3.1 特异序列可应用于小麦-偃麦草杂交后代的规模
化筛选
利用外源基因组特异重复序列进行 FISH 分析效
果优于 GISH[28-29]。本研究利用特异序列探针对八倍体
小偃麦、小麦-偃麦草代换系和易位系进行 FISH 分析，
信号比 GISH 更加清晰，而且减少了非特异交叉杂交。
GISH 很大程度上是依赖基因组特异重复序列来区分
不同基因组的，因此，以弥散重复序列作探针的 FISH
具有 GISH 检测的功能[41-42]，由于免去了提取基因组
总 DNA 以及对封阻和探针最佳比例的摸索，重复性
高，提高了检测效率，降低了试验成本。
相比原位杂交对于技术的较高要求，开发并利用
基于特异序列的 PCR 标记不失为一种有效、快捷的鉴
定外源遗传物质的方法[17]。本研究筛选出的特异序列
经过与小麦基因组序列比对，提高了特异标记的开发
效率，10 对引物的检测效率能达到 73.3%—95%。然
而对于有些材料，虽然 GISH 分析有外源染色体片段，
但是所有的引物都不能扩增出目的条带（图 5），说
明开发的标记未能覆盖偃麦草染色体所有区域，必要
情况下需将分子标记与 GISH、FISH 及多色荧光原位
杂交（multicolor fluorescent in situ hybridization，
mc-FISH）等技术充分结合起来，以确定外源染色体
的具体身份。另外，比较有趣的是，有 4 份材料 GISH
没有检测到信号，而 10 对引物全部扩增出特异条带，
考虑到这 4 份材料有明显的耐盐性状，推测可能是
因为偃麦草小片段遗传物质已渗入小麦基因组所
致，这与王玉海等[43]对高抗白粉病小麦-山羊草新种质
的检测结果类似。小麦-偃麦草渐渗系由于携带的不利
3690 中 国 农 业 科 学 49 卷

引物
Primers
GISH分析未检
测到易位片段
No alien segments
were detected
by GISH
GISH分析检测到易位片段 Alien segments were detected by GISH


红色代表有特异扩增，灰色表示无特异扩增。左侧括号里为各引物的检测效率
Red indicated specific amplification, and gray indicated no specific amplification. Detection efficiency of each pair of primers was given in the bracket

图 5 PCR 特异扩增标记对 109 份小麦-偃麦草衍生材料的检测结果
Fig. 5 Summary of PCR-amplification results in 109 wheat-Th. ponticum derivatives by 10 pairs of primers designed based on Th.
ponticum genome specific repeats

基因较少，具有育种价值，利用特异 PCR 标记进行鉴
定能弥补原位杂交的不足，同时可以实现规模化高效
筛选。
3.2 特异序列在偃麦草染色体的两臂上呈弥散型
分布
本研究以十倍体长穗偃麦草基因组 DNA 为探
针，中国春 DNA 为封阻，试图筛选出能覆盖偃麦草
全基因组的特异重复序列。由于串联重复序列主要
分布在着丝粒、端粒及次缢痕处，而弥散重复序列
广泛分布在基因组中。偃麦草和小麦的着丝粒在
DNA 组成上有很高的相似性，很可能在点杂交过程
中被封阻屏蔽，因此得到的特异序列主要富集在染
色体两臂。LI 等[44]通过相似的方法克隆到一个簇毛
麦基因组区域化连续高度重复序列 pHvNAU62，它
分布于 1V—6V 染色体的端部或近端部，同时可以
作为鉴定携带抗白粉病基因的 6VS 的有效工具。刘
成等[45]利用RAPD法筛选到黑麦基因组特异的重复序
列 OPD15940，FISH 结果显示除端部区域外，pScD15940
弥散状分布在黑麦整套染色体上。GONZÁLEZ-
GARCÍA 等[46]从黑麦基因组特异重复序列家族 R173
中分离出一个长度为 592 bp 的片段“UCM600”，该
序列弥散分布于除近着丝粒区和近端粒区之外的所
有黑麦染色体上，结合已有的特异序列 Bilby（着丝
粒区）和 pSc200（近端粒区），绘制出了完整的黑
麦核型模式图。
3.3 偃麦草着丝粒区特异重复序列有待进一步发掘
LIU 等[47]利用水稻着丝粒特异重复序列 RCS1 和
禾本科着丝粒共有序列 CCS1 筛选野生一粒小麦的
BAC 文库，得到了小麦中 Cereba-like 的反转录转座
子 CRW（centromere retrotransposon of wheat）。李葆
春等[37]证明了 CRW 和 Quinta 是普通小麦及其二倍体
祖先种着丝粒的 2 个进化上最新的元件，并且和
CENH3 蛋白互作，是小麦着丝粒的主要功能序列。郝
薇薇利用禾本科着丝粒特异序列 CCS1 对二倍体拟鹅
观草 BAC 文库进行筛选，获得一个长度为 500 bp 的
串联重复序列“CentSt”，进一步研究发现，在偃麦
草多倍体化的过程中，着丝粒的序列组成也在发生着
急剧的变化（未发表）。结合之前的工作，推测偃麦
草基因组中还有尚未被发现的着丝粒功能序列。前期
利用小麦着丝粒反转录转座子 Unnamedfam6 中较为
19 期 姚涵等：偃麦草基因组特异重复序列的分离与应用 3691

保守的 gag（编码外壳蛋白的基因，group specific
antigen gene）序列作为探针，对十倍体长穗偃麦草质
粒文库进行筛选，获得了偃麦草部分染色体着丝粒特
异的重复序列（汤才国等，未发表）。进一步克隆偃
麦草着丝粒、近着丝粒特异重复序列，将有助于深入
理解着丝粒的结构、功能和进化过程；同时，将分离
得到的偃麦草基因组特异重复序列结合起来应用到育
种工作中可以对小麦-偃麦草易位系或者杂交后代发
生染色体重排的材料进行高效准确的鉴定。
4 结论
从十倍体长穗偃麦草质粒文库中筛选到 7 条偃
麦草基因组特异的重复序列，可用作荧光原位杂交
分析的特异探针，检测小麦背景下的偃麦草染色体
或染色体片段；基于这些重复序列设计的特异扩增
引物，为小麦-偃麦草衍生后代的规模化鉴定和选择
提供便利。

References
[1] 董玉琛. 小麦的基因源. 麦类作物学报, 2000, 20(3): 78-81.
DONG Y C. Gene pools of common wheat. Journal of Triticeae Crops,
2000, 20(3): 78-81. (in Chinese)
[2] CHAI J F, LIU X, JIA J Z. Homoeologous cloning of ω-secalin gene
family in a wheat 1BL/1RS translocation. Cell Research, 2005, 15(8):
658-664.
[3] LUAN Y, WANG X G, LIU W H, LI C Y, ZHANG J P, GAO A N,
WANG Y D, YANG X M, LI L H. Production and identification of
wheat-Agropyron cristatum 6P translocation lines. Planta, 2010,
232(2): 501-510.
[4] CAO A Z, XING L P, WANG X Y, YANG X M, WANG W, SUN Y L,
QIAN C, NI J L, CHEN Y P, LIU D J, WANG X E, CHEN P D.
Serine/threonine kinase gene Stpk-V, a key member of powdery
mildew resistance gene Pm21, confers powdery mildew resistance in
wheat. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United
States of America, 2011, 108(19): 7727-7732.
[5] KANG H Y, WANG Y, FEDAK G, CAO W G, ZHANG H Q, FAN X,
SHA L N, XU L L, ZHENG Y L, ZHOU Y H. Introgression of
chromosome 3Ns from Psathyrostachys huashanica into wheat
specifying resistance to stripe rust. PLoS ONE, 2011, 6(7): e21802.
[6] LI H J, WANG X M. Thinopyrum ponticum and Th. intermedium: The
promising source of resistance to fungal and viral diseases of wheat.
Journal of Genetics and Genomics, 2009, 36(9): 557-565.
[7] NIU Z, KLINDWORTH D L, YU G, LFRIESEN T, CHAO S, JIN Y,
CAI X, OHM J B, RASMUSSEN J B, XUSTEVEN S. Development
and characterization of wheat lines carrying stem rust resistance gene
Sr43 derived from Thinopyrum ponticum. Theoretical and Applied
Genetics, 2014, 127(4): 969-980.
[8] 张学勇, 李大勇. 小麦及其近亲基因组中的 DNA 重复序列研究进
展. 中国农业科学, 2000, 33(5): 1-7.
ZHANG X Y, LI D Y. Repetitive DNA sequences in wheat and its
relatives. Scientia Agricultura Sinica, 2000, 33(5): 1-7. (in Chinese)
[9] FLAVELL R B, SMITH D B. Nucleotide sequence organization in the
wheat genome. Heredity, 1976, 37(2): 231-252.
[10] DVOŘÁK J, ZHANG H B. Variation in repeated nucleotide
sequences sheds light on the phylogeny of the wheat B and G
genomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the
United States of America, 1990, 87(24): 9640-9644.
[11] HESLOP-HARRISON J S. Comparative genome organization in
plants: From sequence and markers to chromatin and chromosomes.
The Plant Cell, 2000, 12(5): 617-635.
[12] BISCOTTI M A, OLMO E, HESLOP-HARRISON J S. Repetitive
DNA in eukaryotic genomes. Chromosome Research, 2015, 23(3):
415-420.
[13] KATO A, VEGA J M, HAN F P, LAMB J C, BIRCHLER J A.
Advances in plant chromosome identification and cytogenetic
techniques. Current Opinion in Plant Biology, 2005, 8(2): 148-154.
[14] FU S L, TANG Z X, REN Z L, ZHANG H Q, YAN B J. Isolation of
rye-specific DNA fragment and genetic diversity analysis of rye genus
Secale L. using wheat SSR markers. Journal of Genetics, 2010, 89(4):
489-492.
[15] KOMURO S, ENDO R, SHIKATA K, KATO A. Genomic and
chromosomal distribution patterns of various repeated DNA sequences
in wheat revealed by a fluorescence in situ hybridization procedure.
Genome, 2013, 56(3): 131-137.
[16] CAI Z X, LIU H J, HE Q Y, PU M W, CHEN J, LAI J S, LI X X, JIN
W W. Differential genome evolution and speciation of Coix
lacryma-jobi L. and Coix aquatica Roxb. hybrid guangxi revealed by
repetitive sequence analysis and fine karyotyping. BMC Genomics,
2014, 15(1): 1025-1040.
[17] MEHROTRA S, GOYAL V. Repetitive sequences in plant nuclear
DNA: Types, distribution, evolution and function. Genomics
Proteomics Bioinformatics, 2014, 12: 164-171.
[18] 孙善澄. 小偃麦类型与物种形成的探讨. 作物学报, 1980, 6(1):
1-14.
SUN S C. Research on Triticum Agropyron form and species
formation. Acta Agronomica Sinica, 1980, 6(1): 1-14. (in Chinese)
3692 中 国 农 业 科 学 49 卷

[19] ZHANG Z Y, XIN Z Y, LARKIN P J. Molecular characterization of a
Thinopyrum intermedium group 2 chromosome (2Ai-2) conferring
resistance to barley yellow dwarf virus. Genome, 2001, 44(6):
1129-1135.
[20] CHEN Q, CONNER R L, LI H J, SUN S C, AHMAD F, LAROCHE
A, GRAF R J. Molecular cytogenetic discrimination and reaction to
wheat streak mosaic virus and the wheat curl mite in Zhong series of
wheat-Thinopyrum intermedium partial amphiploids. Genome, 2003,
46(1): 135-145.
[21] WANG M J, ZHANG Y, LIN Z S, YE X G, YUAN Y P, MA W, XIN Z
Y. Development of EST-PCR markers for Thinopyrum intermedium
chromosome 2Ai#2 and their application in characterization of novel
wheat-grass recombinants. Theoretical and Applied Genetics, 2010,
121(7): 1369-1380.
[22] AYALA-NAVARRETE L I, MECHANICOS A A, GIBSON J M,
SINGH D, BARIANA H S, FLETCHER J, SHORTER S, LARKIN P
J. The Pontin series of recombinant alien translocations in bread
wheat: single translocations integrating combinations of Bdv2, Lr19
and Sr25 disease-resistance genes from Thinopyrum intermedium and
Th. ponticum. Theoretical and Applied Genetics, 2013, 126(10):
2467-2475.
[23] WANG Y H, WANG H G. Characterization of three novel
wheat-Thinopyrum intermedium addition lines with novel storage
protein subunits and resistance to both powdery mildew and stripe rust.
Journal of Genetics and Genomics, 2016, 43(1): 45-48.
[24] 李振声, 容珊, 陈漱阳, 穆素梅, 钟冠昌. 小麦远缘杂交. 北京: 中
国农业科学技术出版社, 1985.
LI Z S, RONG S, CHEN S Y, MU S M, ZHONG G C. Wheat Wide
Hybridization. Beijing: Agricultural Science and Technology Press of
China, 1985. (in Chinese)
[25] XIA G M, XIANG F N, ZHOU A F, WANG H, CHEN H M.
Asymmetric somatic hybridization between wheat (Triticum aestivum
L.) and Agropyron elongatum (Host) Nevishi. Theoretical and Applied
Genetics, 2003, 107(2): 299-305.
[26] JIANG J M, GILL B S. Current status and the future of fluorescence
in situ hybridization (FISH) in plant genome research. Genome, 2006,
49(9): 1057-1068.
[27] KATO A, LAMB J C, BIRCHLER J A. Chromosome painting using
repetitive DNA sequences as probes for somatic chromosome
identification in maize. Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America, 2004, 101(37): 13554-13559.
[28] ZHANG J, LONG H, PAN Z F, LIANG J J, YU S Y, DENG G B, YU
M Q. Characterization of a genome-specific Gypsy-like
retrotransposon sequence and development of a molecular marker
specific for Dasypyrum villosum (L.). Journal of Genetics, 2013,
92(1): 103-108.
[29] DENG C L, BAI L L, LI S F, ZHANG Y X, LI X, CHEN Y H, WANG
R R C, HAN F P, HU Z M. DOP–PCR based painting of rye
chromosomes in a wheat background. Genome, 2014, 57(9): 473-479.
[30] MCINTYRE C L, CLARKE B C, APPELS R. Amplification and
dispersion of repeated DNA sequences in the Triticeae. Plant
Systematics and Evolution, 1988, 160(1/2): 39-59.
[31] ZHANG H B, DVOŘÁK J. Characterization and distribution of an
interspersed repeated nucleotide sequence from Lophopyrum
elongatum and mapping of a segregation-distortion factor with it.
Genome, 1990, 33(6): 927-936.
[32] Bournival B, Obanni M, Abad A, Ohm H, Mackenzie S. Isolation of a
new species-specific repetitive sequence from Thinopyrum elongatum
and its use in the studies of alien translocations. Genome, 1994, 37(1):
97-104.
[33] WANG R R C, WEI J Z. Variations of two repetitive DNA sequences
in several Triticeaegenomes revealed by polymerase chain reaction
and sequencing. Genome, 1995, 38(6): 1221-1229.
[34] 张学勇, 董玉琛, 李培. E 和 St 基因组特异 RAPD 片段在部分小麦
族植物中的分布. 遗传学报, 1998, 25(2): 131-141.
ZHANG X Y, DONG Y C, LI P. Distribution of E- and St- specific
RAPD fragments in few genomes of Triticeae. Acta Genetica Sinica,
1998, 25(2): 131-141. (in Chinese)
[35] SHARP P J, KREIS M, SHEWRY P R, GALE M D. Location of
β-amylase sequences in wheat and its relatives. Theoretical and
Applied Genetics, 1988, 75(2): 286-290.
[36] HAN F P, GAO Z, YU W C, BIRCHLER J A. Minichromosome
analysis of chromosome pairing, disjunction, and sister chromatid
cohesion in maize. The Plant Cell, 2007, 19(12): 3853-3863.
[37] LI B C, CHOULET F, HENG Y F, HAO W W, PAUX E, LIU Z, YUE
W, JIN W W, FEUILLET C, ZHANG X Y. Wheat centromeric
retrotransposons: The new ones take a major role in centromeric
structure. The Plant Journal, 2013, 73(6): 952-965.
[38] WICKER T, MATTHEWS D E, KELLER B. TREP: A database for
Triticeae repetitive elements. Trends in Plant Science, 2002, 7(12):
561-562.
[39] ZHANG X Y, LI Z S, CHEN S Y. Production and identification of
three 4Ag (4D) substitution lines of Triticum aestivum-Agropyron:
relative transmission rate of alien chromosomes. Theoretical and
Applied Genetics, 1992, 83(6/7): 707-714.
[40] 郝薇薇, 汤才国, 李葆春, 郝晨阳, 张学勇. 小麦-十倍体长穗偃麦
19 期 姚涵等：偃麦草基因组特异重复序列的分离与应用 3693

草广谱抗锈易位系的鉴定及分析. 中国农业科学, 2012, 45(16):
3240-3248.
HAO W W, TANG C G, LI B C, HAO C Y, ZHANG X Y. Analysis of
wheat-Thinopyrum ponticum translocation lines with broad spectrum
resistance to stripe rusts. Scientia Agricultura Sinica, 2012, 45(16):
3240-3248. (in Chinese)
[41] FUCHS J, HOUBEN A, BRANDES A, SCHUBERT I. Chromosome
‘painting’ in plants-A feasible technique?. Chromosoma, 1996, 104(5):
315-320.
[42] HESLOP-HARRISON J S. RNA, genes, genomes and chromosomes:
Repetitive DNA sequences in plants. Chromosomes Today, 2000, 13:
45-56.
[43] 王玉海, 何方, 鲍印广, 明东风, 董磊, 韩庆典, 李莹莹, 王洪刚.
高抗白粉病小麦-山羊草新种质 TA002 的创制和遗传研究. 中国农
业科学, 2016, 49(3): 418-428.
WANG Y H, HE F, BAO Y G, MING D F, DONG L, HAN Q D, LI Y
Y, WANG H G. Development and genetic analysis of a novel
wheat-Aegilops germplasm TA002 resistant to powdery mildew.
Scientia Agricultura Sinica, 2016, 49(3): 418-428. (in Chinese)
[44] LI W L, CHEN P D, QI L L, LIU D J. Isolation, characterization and
application of a species-specific repeated sequence from Haynaldia
villosa. Theoretical and Applied Genetics, 1995, 90(3/4): 526-533.
[45] 刘成, 杨足君, 冯娟, 迟世华, 周建平, 任正隆. 黑麦染色体组中
一个新重复序列的发现、定位与应用. 中国农业科学, 2007, 40(8):
1587-1593.
LIU C, YANG Z J, FENG J, CHI S H, ZHOU J P, REN Z L. Detection,
mapping and application of a new repetitive DNA sequence in Rye
(Secale cereale L.) genome. Scientia Agricultura Sinica, 2007, 40(8):
1587-1593. (in Chinese)
[46] GONZÁLEZ-GARCÍA M, CUACOS M, GONZÁLEZ-SÁNCHEZ M,
PUERTAS M J, VEGA J M. Painting the rye genome with
genome-specific sequences. Genome, 2011, 54(7): 555-564.
[47] LIU Z, YUE W, LI D Y, WANG R R C, KONG X Y, LU K, WANG G
X, DONG Y S, JIN W W, ZHANG X Y. Structure and dynamics of
retrotransposons at wheat centromeres and pericentromeres. Chromosoma,
2008, 117(5): 445-456.

（责任编辑 李莉）