全 文 ：　遗 传 学 报　Acta Genetica Sinica , January 2005 , 32 (1):86～ 93 ISSN 0379-4172
收稿日期:2003-12-24;修回日期:2004-05-14
基金项目:国家 863计划项目(编号:2003AA207100)、全国优秀博士学位论文作者专项基金资助项目(编号:200357)[ Supported by National 863 Program
(No.2003AA207100), the Fund for the Author of National Excellent Doctoral Dissertation of China(No.200357)]
作者简介:王志清(1976-)女 ,在读硕士 ,研究方向:分子遗传与作物育种。E-mail:wangzhiqing96@sohu.com
①　通讯作者。郑有良(1959-)男 ,博士 ,教授 ,博士导师 ,研究方向:分子生物学与小麦育种。 E-mail:grmb@sicau.edu.cn
Cloning and Analysis of LMW-GS Genes from
Triticum aestevum ssp.tibetanum Shao
WANG Zhi-Qing , LONG Hai , ZHENG You-Liang① , YAN Ze-Hong , WEI Yu-Ming , LAN Xiu-Jin
(Triticeae Research Institute , Sichuan Agricultural University , Dujiangyan　611830 , China)
Abstract:The full coding regions(open reading frame , ORF)of LMW-GS genes were amplified from Triticum aeste-
vum ssp.tibetanum Shao accession AS908 by using the primer pairs W1227 and W1228 ,which were designed according
to wheat LMW-GS conservative domains.The amplified DNA fragments were separated and recovered from agrose gel ,
subsequently ligated into pBluescript SK(+/-)-T vector, and then transformed into E.coli strain DH10B.Three positive
clones were screened out and sequenced.Among which, Tibet1(GenBank accession No:AY299457)and Tibet2(Gen-
Bank accession No:AY299458)are two expressed LMW glutenin genes.Their coding regions are 1 041 bp and 901 bp,
and encode two mature proteins with 326 and 281 amino acid residues , respectively.Tibet3 (GenBank accession No:
AY299459)is a pseudogene due to that two stop codons are in its coding region.Squence multipule alignment analysis
suggested that Tibet1 , Tibet2 and Tibet 3 have the higher similarity in their structure and quality functions with the known
LMW-GS genes with GenBank accession No:AY214450 , AJ293099 and AB062871 encoded by Glu-D3 , Glu-A 3 and
Glu-A3 , respectively.
Key words:T.aestivum ssp.tibet shao;LMW-GS gene;clone;sequence analysis
西藏半野生小麦 LMW-GS基因的克隆及序列分析
王志清 , 龙 　海 , 郑有良① , 颜泽洪 , 魏育明 , 兰秀锦
(四川农业大学小麦研究所 , 都江堰　611830)
摘　要:根据小麦低分子量谷蛋白基因序列保守区设计的引物W1227/ 1228 对特异种质资源-西藏半野生小麦
(Triticum aestivum ssp.tibetanum Shao)AS908 总 DNA进行 PCR扩增 ,得到约 950 bp 的 DNA片段 ,分离纯化后连接到
pBluescript SK(+/-)T载体上 , 转化 、筛选后选取 3 种不同类型的阳性克隆进行测序 , 获得 3 个不同的基因序列 , Ti-
bet1、Tibet2 和 Tibet3。其中 , Tibet1(GenBank 登录号:AY299457)、Tibet2(GenBank 登录号:AY299458)的编码区长度分
别为 1 041 bp 和 906 bp , 可编码 326 和 281个氨基酸残基的成熟蛋白。 Tibet3(GenBank 登录号:AY299459)由于编码
区内有2 个提前终止密码子而为不可编码成熟蛋白的假基因。序列比较显示 AY299457、AY299458 和 AY299459 分
别与GenBank中 Glu-D3、Glu-A3 和 Glu-A3位点编码的 LMW-GS 基因 AY214450 、AJ293099 和 AB062871 有较高的一致
性 ,且序列结构非常相似 , 因而推测它们与之有类似的品质功能 , 并对如何验证其品质功能作了探讨。
关键词:西藏半野生小麦;LMW-GS 基因;克隆;序列分析
中图分类号:Q785　　　文献标识码:A　　　文章编号:0379-4172(2005)01-0086-08
　　小麦谷蛋白是种子贮藏蛋白之一 。根据 SDS-
PAGE电泳时的迁移率可分为高分子量谷蛋白(High
molecular weight glutenin , HMW glutenin)和低分子量
谷蛋白(Low molecular weight glutenin , LMW glutenin
)[ 1 , 2] 。普通小麦(Triticum aestivum L.,AABBDD , 2n
=6x=42)的低分子量谷蛋白主要由 B和 C 亚基组
成[ 3] ,由位于第一同源群染色体短臂上的 Glu-A3 、
Glu-B 3和 Glu-D3(统称 Glu-3)位点[ 4～ 6]和第六同源
群染色体上的相应位点基因所编码[ 6～ 8] 。经双向电
泳分离 ,每一材料一般可分离出20多种不同的低分
子量谷蛋白带型[ 9] 。在硬粒小麦(T .durum L.,
AABB ,2n =4x=28)、栽培一粒小麦(T .monococcum
L.,AA ,2n=2x=14)和节节麦(Aegilops tauschii L.,
DD ,2n=2x=14)以及其他染色体组成为 AABB 、AA
和DD的物种中 ,则分别由第一同源群染色体上的
Glu-A3 和 Glu-B3 以及 Glu-A3 和 Glu-D3 位点编
码[ 5 ,10 , 11] ,也可由第六同源群染色体上的相应位点
基因编码[ 6～ 8] 。由于低分子量谷蛋白与面粉的加工
品质密切相关 。目前 ,已有普通小麦 、硬粒小麦 、栽
培一粒小麦和节节麦的低分子量谷蛋白基因分离克
隆的报道[ 5 ,10～ 12] 。这些基因在编码区(coding re-
gion)结构上非常相似 ,由信号肽 、N-端区 、可重复短
肽组成的重复区以及 C-端保守区构成[ 13] 。根据 N
端区某些部位氨基酸残基的组成和差异以及半胱氨
酸的数目可将 LMW-GS 分为 m 型 、s 型 、α型和 γ
型[ 7] 。这些基因序列在核苷酸组成上的相似性和某
些部位氨基酸残基的差异为 PCR方法分离单个低
分子量谷蛋白亚基新基因和从中鉴定出品质优良的
低分子量谷蛋白亚基基因提供了方便和可能 。D
Ovidio等于 1992年首次通过 PCR的方法分离了低
分子量谷蛋白亚基基因[ 14] 。Masci等发现来自普通
小麦栽培种Yecora Rojo 的 42 kD低分子量谷蛋白亚
基基因(GenBank登录号:Y17845)与优良面粉品质
高度相关[ 15] 。D Ovidio 等认为硬粒小麦栽培种
Glu-B3位点上的等位基因 LMW-2也与面粉优良的
品质功能有关[ 16] 。
西藏半野生小麦(T.aestivum ssp.tibetanum
Shao)是中国特有的普通小麦亚种[ 17 ,18] ,具有成熟时
自然断穗和包壳性状 ,非常原始而接近野生种[ 18] ,
在普通小麦的起源与分类上具有重要研究价值 。陈
庆富等已经对其典型原始性状-断穗和包壳进行基
因定位[ 19] ,魏育明等对 HMW-GS的遗传多样性进行
了研究[ 20] 。然而 ,对其低分子量谷蛋白亚基的研
究 ,采用常规的 SDS-PAGE以及双向电泳分离的方
法很难将单个低分子量谷蛋白亚基分开。因此 ,本
研究试图根据普通小麦 Glu-D3编码的低分子量谷
蛋白基因的保守序列设计 PCR引物 ,分离西藏半野
生小麦的低分子量谷蛋白基因。
1　材料和方法
1.1　材　料
西藏半野生小麦AS908由四川农业大学小麦研
究所收集并保存 , 大肠杆菌菌株 E .coli.DH10B 、
pBluescriptSK(+/-)-T 载体分别由本所分子生物学
实验室保存和构建 。Taq 酶 、dNTPs 、MgCl2 等试剂购
自宝生物工程(大连)有限公司 , DNA 纯化 、回收试
剂盒购自上海华舜生物工程有限公司 。
1.2　基因组 DNA提取
取 1 ～ 2 g AS908 幼嫩叶片 ,液氮冷冻研磨成细
粉后采用 2×CTAB法提取 DNA ,具体提取方法参照
文献[ 21]的方法进行 。
1.3　PCR引物设计 、扩增基因组 DNA及电泳分析
根据 Colot等发表的 LMW-GS基因序列(GenBank
登录号:X13306)设计了一对扩增低分子量谷蛋白基
因完整编码区的引物 W1227(5′-ACCATGAAGAC-
CTTCCTCGTCTTTGC-3′)和 W1228(5′-TCAGTAGGCAC-
CACTCCGGTGC-3′)[ 22] 。引物由上海生工生物工程有
限公司合成。
PCR反应总体积为 50 μL , 其中含 10 ×PCR
Buffer 5 μL , 1.5 mmol/L MgCl2 , 4 种 dNTP 各 200
μmol/L ,引物各 150 ng ,1.5 U ExTaq酶 ,200 ～ 300 ng
基因组DNA。PCR反应条件为 95℃预变性4 min ,以
35个循环 94℃变性 30 s , 50℃退火 45 s , 68℃延伸 1
87WANG Zhi-Qing et al.:Cloning and Analysis of LMW-GS Genes from …
min ,最后以 68℃延伸 10 min。扩增产物在 1%琼脂
糖凝胶上分离 , 87 W恒定功率下电泳 。
1.4　PCR产物回收 、纯化 T-载体克隆与阳性克隆
筛选
　　扩增产物回收并纯化后连接到 pBluescript-
SK(+/ -)-T 载体 , 转化后获得阳性克隆。用扩增
LMW-GS 序列重复区的引物(W1229:5′-AGATG-
CATCCCTGGTTTGGAG-3′, W1230 ∶5′-GAGGAATAC-
CTTGCATGGGGT-3′)扩增阳性克隆 ,银染筛选 ,根据
扩增出的重复区长度的差异得到不同的阳性克隆 。
1.5　序列测定与比较分析
选取重复区长度不同的阳性克隆进行测序(由
大连宝生物工程有限公司完成),序列测定结果比较
分析采用 NCBI 网址中的 Blastp (http://www.ncbi.
nlm.nib.gov/BLAST/)进行。
2　结　果
2.1　PCR扩增 、目的片段回收与 T-载体克隆
用引物W1227/1228对西藏半野生小麦 AS908
基因组总 DNA进行PCR扩增 ,在 1%琼脂糖上电泳
分离 ,可见一大约 950 bp的片段(图 1)。
此片段与预期的小麦低分子量谷蛋白基因编码
区的长度接近 ,故对此目的片段进行回收并克隆到
pBluescriptSK
(+/-)-T 载体。经转化 ,获得了一批阳性
克隆 ,利用扩增低分子量谷蛋白基因重复区的引物
筛选到至少 3 种不同类型的阳性克隆 ,对这 3种类
型进行了测序。
2.2　序列同源性比较
根据通用三联体密码将测序结果翻译为氨基酸
序列后 ,在 NCBI数据库进行检索 ,结果发现这 3个
序列与已公布的来源于普通小麦 、硬粒小麦和一粒
小麦 Glu-3基因位点编码的 LMW-GS 基因一致性很
高(表 1)。将这 3 个基因序列分别定名为 Tibet1 、
Tibet2和 Tibet3 ,登录到GenBank ,获得登录号分别为
AY299457 、AY299458和AY299459。
序列同源性搜索结果(表 1)表明 ,这3个序列
图 1　PCR反应产物在 1%琼脂糖上电泳结果
M:marker;S:PCR扩增产物。
Fig.1　PCR amplification products
Separated on 1% Agrose
M:molecular marker;S:PCR amplification products.
与已知低分子量谷蛋白亚基基因的一致性都在
50%以上 ,最高可达 91%。AY299457与来源于 Glu-
D3基因位点编码的低分子量谷蛋白基因的同源性
(70%～ 91%)均分别高于 Glu-A3(与普通小麦 、硬粒
小麦和一粒小麦 Glu-A3位点编码基因的一致性分
别为59%～ 72%,63%～ 72%和 65%～ 66%)和 Glu-
B3(与普通小麦和硬粒小麦 Glu-B3位点编码基因
的一致性分别为 58%～ 75%和65%～ 77%)基因位
点编码的基因 。因此推测 ,AY299457可能是由 Glu-
D3 位点控制的谷蛋白基因 。而 AY299458 和
AY299459则分别与同一来源的 Glu-A3 和 Glu-B 3
(普通小麦或硬粒小麦或一粒小麦)位点编码基因的
一致性相当(表 1), 故无法推测 AY299458 和
AY299459究竟由 Glu-A3 、Glu-B3和 Glu-D3中的哪
一个基因位点控制 。
2.3　序列分析与比较
AY299457 、AY299458 和 AY299459 的编码区长
度分别为1 041 bp 、906 bp和849 bp。其中AY299457
和 AY299458 可分别编码 326和 281个氨基酸残基
的成熟蛋白质 。AY299459 由于在编码区中存在 2
个提前终止密码子 ,不能编码有功能的成熟蛋白质。
这 3个基因在基本结构上非常相似(图 2),均含有
由 20个氨基酸残基组成的相同的信号肽;由13个
氨基酸残基组成的 N-端保守区 , 其中 AY299457不
含半胱氨酸 (C), 其余 2个序列均有 1 个半胱氨
酸 , 并且有少数位置的氨基酸发生替换;由可重复
短肽组成富含谷氨酰胺 (Q)和脯氨酸 (P)的重
复区以及 C-端保守区。重复区的变异最大 , 在氨
88 遗传学报　Acta Genetica Sinica　Vol.32　No.1　2005
　　　　　　表 1　西藏半野生小麦低分子量谷蛋白与小麦 A、B和 D 基因组 Glu-3位点编码的同源基因氨基酸序列的一致性比较
Table1　Identity of LMW glutenin from Triticum aestivum ssp.tibetum Shao with those of
homologous Glu-3 locus encoded proteins from A、B and D genome of wheat
来源
Source
基因位点
Locus
AY299457
一致性(%)
Identity
GenBank登录号
GenBank
accession number
AY299458
一致性(%)
Identity
GenBank登录号
GenBank
accession number
AY299459
一致性(%)
Identity
GenBank登录号
GenBank
accession number
普通小麦 Glu-A3 72 AB062868 84 AB062868 84 AB062871
T.aestivum 59 AB062877 52 AB062877 56 AB062876
Glu-B3 75 AB062852 76 AB062860 72 AB062860
58 AB062862 60 AB062854 57 AB062854
Glu-D 3 91 AY214450 82 AB062872 80 AB062867
70 AB062875 71 AB062865 72 AB062875
硬粒小麦 Glu-A3 72 AJ293099 85 AJ293099 83 AJ293099
T.durum 63 AJ293097 55 AJ293097 64 AJ293097
Glu-B3 77 Y14104 72 AJ007746 66 Y14104
65 AJ007746 58 Y18159 58 Y18159
栽培一粒小麦 Glu-A3 66 AA017160＊ 60 AA017160＊ 66 AA017159＊
T.monococcum 65 AA017159＊ 60 AA017159＊ 55 AA017160＊
　＊蛋白质序号;黑体行显示西藏半野生小麦低分子量谷蛋白基因与该来源基因的最高一致性 ,而未加黑的行为最低一致性。
　＊ protein sequence in GenBank Database;The characters in bold are the highest identity genes , whi le the normal characters are the lowest ident ity genes with
the genes from T.aestivum ssp.tibetanum Shao.
图 2　基于通用三联体密码推导的西藏半野生小麦 LMW-GS基因氨基酸序列
“ ＊”表示终止密码子;“ -”为半胱氨酸(C);“ …”与另外一个或两个序列比较相应部位的氨基酸残基缺失表示;黑斜体为
AY299457重复区中的疏水氨基酸。
Fig.2　The deduced amino acid sequences of LMW-GS from T .aestivum ssp .tibetanum
Shao based on common triplet code
“ ＊” indicates stop codon;“ -”indicates the position of cysteines;“ …” indicates the deletion of corresponding amino acid
residues;Bold and italic characters indicate hydrophobic amino acids repetitive domain.
89WANG Zhi-Qing et al.:Cloning and Analysis of LMW-GS Genes from …
基酸残基数目和组成上均有变化。3个基因序列的
重复区分别由 131 、86和 70个(AY299459在此分析
时忽略了提前终止密码子)氨基酸残基组成 ,
AY299457重复区前端有1个半胱氨酸(C)、2个疏水
区PIIIL、PVIIL 和 18 个不同类型的可重复短肽
(QQPPFSQQ , QQPPCSQQ 、 QQSPFSQQ 、 QQPPFPQQ
等)。AY299458的一致重复单元为 4肽-QQQP-和 5
肽-PQQPP-间隔出现;而 AY299459的一致重复单元
为5肽 PFSQQ ,也有部分氨基酸的替换和缺失发生 。
C-端区在长度上也有变化 ,分别由 182 、182和186个
氨基酸残基组成 ,均含有数目相对保守的 7个半胱
氨酸(C)。C-端区相对保守 ,仅有少数部位的氨基酸
发生替换和缺失 。
依据表 1的比较结果 ,分别选取与它们一致性
最高的那一个基因序列进行比较 ,以显示 3个基因
序列的特异性 ,其中 AY299457 与 AY214450 的一致
性高达 91%(表 1 ,图 3 ,A),AY299458 与 AJ293099
的一致性达 85%(表 1 , 图 3 , B), AY299459 与
AB062871 的一 致性 达 84%(表 1 , 图 3 , C)。
AY299457与 AY214450 在信号肽 、N-端保守区及重
复区 ,均没有差异 ,二者间的差异主要发生在 C-端
保守区 , AY299457与 AY214450存在25个氨基酸残
基的替换和 4个氨基酸的缺失(图 3 ,A);AY299458
与AJ293099在整个编码区均有差异 ,在 N-端存在 1
个氨基酸残基的替换 、重复区有14个氨基酸残基的
替换 、7个氨基酸残基的增加和 8个氨基酸残基缺
失 ,C-端保守区有 15 个氨基酸残基的替换(图 3 ,
B);AY299459与 AB062871间的差异也在整个编码
区存在 ,N-端区有 1个氨基酸残基的替换 ,重复区有
8个氨基酸残基的替换 、11个氨基酸残基的增加和
2个缺失 ,C-端保守区有 20个氨基酸残基的替换 、4
个氨基酸残基的增加(图 3 ,C)。
3　讨　论
Ikeda等报道的第 5 组低分子量谷蛋白基因
AB062865 、AB062866和 AB062867[ 10] 与来自中国春
的AY214450低分子量谷蛋白基因的序列结构相同 ,
第一个半胱氨酸残基(C)出现在成熟蛋白序列N-端
第 26位 ,重复区内有 2个疏水区 PIIIL 、PVIIL ,既不
同于第一个半胱氨酸出现在 N-端第 43 位的 42K
LMW-GS[ 15] ,也不同于第一个半胱氨酸残基(C)出现
在N-端第 26位且整个序列含有 9个半胱氨酸残基
(C)的 LMW-γ型[ 23] 。这4个序列都是由 Glu-D3基
因位点编码的低分子量谷蛋白 ,AY299457的典型结
构与它们极为相似 。另外 ,从序列同源性比较结果
也可看出 ,AY299457 与 Glu-D3 编码的序列一致性
最高达 91%,而本研究所用的 PCR引物是依据 Glu-
D3编码的基因设计 ,因此 , AY299457 很可能是由
Glu-D3位点编码。
AY299458和 AY299459 序列结构类型比较普
遍 ,Glu-A3 、Glu-B 3和 Glu-D3位点的基因均可编码。
同源性比较也无法体现它们具体来源于 Glu-A3 、
Glu-B3和 Glu-D3中的哪个位点 。虽然 PCR引物是
依照 Glu-D3编码的基因设计 ,但由于低分子量谷蛋
白基因核苷酸序列的高度一致性 ,导致氨基酸序列
高度保守。因此并不能保证这种引物只选择性的扩
增由 Glu-D3位点编码的基因。
在小麦低分子量谷蛋白基因中 ,半胱氨酸的数
目和相对位置非常保守 ,这对于形成稳定的分子间
和分子内二硫键非常重要[ 24] ,而稳定的分子间和分
子内二硫键的形成 ,有助于将多个蛋白质亚基联在
一起 ,形成网络结构 ,从而影响小麦面粉的粘弹性和
延展性[ 25] 。本研究所得到的 3 个基因序列分别与
AY214450 、AJ293099 、AB062871的半胱氨酸数目和相
对位置均一致(图 4),据此推测 ,它们与这几种类型
的低分子量谷蛋白的品质功能相似。
虽然从分子序列上预测本研究所获得的低分子
量谷蛋白基因与已知低分子量谷蛋白基因有类似的
品质功能 ,但研究其品质效应 ,还有待于在小麦背景
中过量表达特定的低分子量谷蛋白亚基基因。在小
麦中 ,过量表达小麦高分子量谷蛋白亚基基因的转
基因技术体系已经建立[ 26 ,27] ,这种技术同样适合于
过量表达小麦低分子量谷蛋白基因 ,我们正在利用
转基因技术过量表达所获得的低分子量谷蛋白基因
以研究其品质效应 。
90 遗传学报　Acta Genetica Sinica　Vol.32　No.1　2005
图 3　西藏半野生小麦低分子量谷蛋白基因的特异性
A:AY299457与AY214450间的比较;B:AY299458与AJ293099间的比较;C:AY299459与AB062871间的比较。“ -”表示序列间一
致的氨基酸残基;“ ＊”表示序列间发生替换的氨基酸残基;“ +”表示在对比中AY299457 、AY299458 、AY299459增
加的氨基酸残基;“/”表示在对比中 AY299457 、AY299458 、AY299459缺失的氨基酸残基。
Fig.3　Characteristics of LMW-GS coding sequence from T .aestivum ssp.tibetanum.Shao
A:Comparison between AY299457 and AY214450;B:Comparison between AY299458 and AJ214450;C:Comparision between AY299458 and
AB062871.“ -” indicates indentical amino acids residues between two sequences;“ ＊” indicates substitution of amino acids residues;“ +” in-
dicates addition of amino acids residues in sequences of AY299457、AY299458 、
AY299459;“/” indicates deletion of amino acids residues in sequences of AY299457、AY299458 、AY299459.
91WANG Zhi-Qing et al.:Cloning and Analysis of LMW-GS Genes from …
图 4　6个序列半胱氨酸(C)排列的相对位置比较
双向箭头内的数据为每两个 C之间的氨基酸残基的数目;C上方的数据为它在成熟蛋白序列中的位置。
Fig.4　The comparison of corresponding positions of cysteines among sequences
The data between the double direction arrows are the numbers of AA between cysteines;The data above cysteines are its
posi tions in sequence.
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