全 文 ：中国农业大学学报 2002, 7( 5): 1～ 6
Journal of China Ag ricultural Univ ersity
①
偃麦草 E染色体组特异 RAPD和 SCAR标记的建立
尤明山* 李保云 唐朝晖 刘守斌 宋健民 毛善锋 刘广田
(中国农业大学 作物学院 , 北京 100094)
摘 要 用 100条 10碱基随机引物 ,以普通小麦中国春、中间偃麦草为材料进行 RAPD分析 ,筛选到一个偃
麦草染色体组特异引物 OPF03,并从中间偃麦草中克隆了该引物的特异 DN A片段 OPF031291。将该片断与比
萨偃麦草中的 OPF031296 ( GenBank序号 U43516)比较 ,同源性为 88% 。 根据 OPF031291的序列 ,设计了 2对
SC AR引物 ,利用 O PF03和引物 P3、 P4对普通小麦、普通小麦 -中间偃麦草的部分双二倍体、长穗偃麦草、中
间偃麦草、小麦 -二倍体长穗偃麦草代换系、附加系共 6类材料进行了 RAPD和 SCAR分析 ,发现 RAPD标记
OPF031291没有出现在含 Ee染色体组的材料中 ,而标记 SCAR982则出现于所有含 E染色体组的材料中。 说明 ,
根据 Eb染色体组特异 RAPD标记转化的 SCAR标记 ,可以同时检测小麦背景下的 Ee染色体。
关键词 偃麦草 ; 染色体组 ; RAPD; SCAR
中图分类号 S512
Establishment of E-Genome-Specif ic RAPD and SCAR Markers
forThinopyrum spp.
You Mingshan Li Baoyun Tang Zhaohui Liu Shoubin Song Jianmin
Mao Shanfeng Liu Guang tian
( Col leg e of Crop Science, China Ag ricul tu ral Univ ersi ty, Bei jing 100094, China)
Abstract A to tal of 100 decamer olig onucleo tides were used as primers to perfo rm random
amplified polymorphic DN A ( RAPD) analy sis on Tri ticum aestivum var. Chinese Spring and
Thinopyrum intermedium . Out of th ese primers, one could ampli fy a specific DN A fragment
in the accession SZ of Th . intermedium . This f ragment, OPF031291 , was cloned and se-
quenced. Sequence da ta searching in GenBank showed that this fragment had a homo logous
deg ree of 88% to a RAPD marker O PF031296 ( GenBank accession U43516) in Th . bessara-
bicum . Based on the sequence of O PF031291 , two pai rs SCAR primers w ere designed. With
O PF03 and primers P3 and P4, RAPD and SCAR analyses w ere performed on T . aest ivum ,
T .aestivum-Th. intermedium partial amphidiploid, Th. elongatum , Th . intermedium , wheat-
Th. elongatum substi tution and addi tion lines. The results o f PCR amplification show ed that
the RAPD marker w as no t appeared in ma terials wi th genome E
e , w hereas SCAR marker
w as appeared in all E-genome po ssessed ma terials. The SCAR marker derived f rom the E
b -
genome-specific RAPD fragment could be used in the meantime to detect the chromosome of
E
e
genome under common wheat backg round.
Key words Thinopyrum spp. ; g enome; RAPD; SCAR
根据染色体组分类体系 ,原来属于冰草属 ( Agropyron )、偃麦草属 ( Elytrigia )和类麦属
(Lophopyrum )中含 E染色体组的大约 25个种组成薄冰草属 ( Thinopyrum ) [1 ]。由于分类体系
① 收稿日期: 2002-02-25
国家自然科学基金重点资助项目 ( 39930110)和北京市自然科学基金重大资助项目 ( 6990001)
* 尤明山 ,博士 ,研究方向为小麦品质育种。 北京圆明园西路 2号
的差别 ,偃麦草属物种常常应用不同的学名。我国小麦族植物的分类体系中 ,该属物种的中文
名仍然使用“偃麦草” ,而学名在不同文献中仍有 Elytingia和 Thinopyrum之别 [2, 3 ]。该属植物
中 ,十倍体长穗偃麦草 ( Th. ponticum )和六倍体中间偃麦草 ( Th. intermedium )是应用于小麦
遗传改良最成功的 2个种 ,人们从中获得了多个抗秆锈、叶锈及黄矮病基因 ,并选育了一批附
加系、代换系、易位系材料及一些优质、抗病、丰产小麦新品种 [4～ 7 ]。
建立在 PCR扩增基础上的 RAPD技术具有操作简单、模板 DNA用量少、要求纯度低、扩
增产物多态性高、经济快捷等优点 ,因而被广泛应用于遗传多样性分析、分子标记辅助育种、品
种鉴定、基因定位及遗传图谱构建等多个研究领域 [8, 9 ]。而将 RAPD标记转化为 SCAR标记
后 ,其特异性和稳定性均大幅度提高 ,可以更方便快捷地应用于异源染色体的检测 [10 ]。
本试验筛选、获得了 E染色体组特异 RAPD标记 ,将其转换为 SCAR标记后 ,对不同来源
的长穗偃麦草 ( Th. elongatum )和中间偃麦草 ( Th. intermedium )进行了标记鉴定。
1 材料和方法
1. 1 植物材料
普通小麦 ( Triticum aest ivum )品种中国春和京 411来源于本研究室。普通小麦 -中间偃麦
草部分双二倍体中 2和中间偃麦草 ( SZ )由山西农科院孙善澄先生提供。 长穗偃麦草
( RM 1119、 RM1123、 RM1935 )和 中间 偃 麦草 ( RM 1130、 RM1937、 RM1938、 RM1940、
RM1941、 RM1942、 RM1943、 RM1944、 RM1948)引自中国农科院品种资源研究所。
长穗偃麦草 ( Elytrigia elongata ) ( P I179162、 PI251443、 PI276709、 PI308591、 PI308592、
PI380626、 PI469212、 PI547326)引自美国国家植物种质库。
长穗偃麦草 901由中科院遗传所贾旭先生惠赠。
中国春 -二倍体长穗偃麦草代换系 DS1E( 1A、 1B、 1D) , DS2E( 2A、 2B、 2D) , DS3E( 3A、 3B、
3D) , DS4E( 4A、 4D) , DS6E( 6A、 6B、 6D) , DS7E( 7A、 7B、 7D)由中科院遗传所李振声院士提
供 ;附加系 DA1E-DA7E由西北农林科技大学吉万全先生提供。
1. 2 实验方法
1. 2. 1 DN A提取 用幼苗叶片提取 ,参照 Saghai-M aroo f CT AB方法略加改动。
1. 2. 2 RAPD分析 RAPD扩增引物为上海生工公司合成的 10碱基核苷酸 , 100条引物分
别对应 Operon D、 E、 F、 G、 J引物组。反应体系为 1× PCR Buf fer, MgCl2 2. 5 mmol L- 1 , dN TP
200 mo l L- 1 , 1. 0 U Taq酶 (上海 Promega ) , 40 ng引物 , 40 ng模板 DNA,反应体积 25μL。
扩增反应在 GeneAmp PCR System2400上进行 ,反应条件为 94℃预变性 2 min,每个循环 94
℃变性 15 s, 36℃复性 30 s, 72℃延伸 45 s, 46个循环后在 72℃延伸 5 min。 扩增产物在
1. 2%的琼脂糖凝胶上电泳检测。
1. 2. 3 RAPD产物的克隆 利用 DNA快速回收试剂盒 ,从 0. 8%的琼脂糖凝胶中回收
RAPD特异片断 ,纯化后 ,用 PGEM-T easy载体连接 ,转化于大肠杆菌 (E .coli ) DH5α菌株。测
序由上海生工公司完成。
1. 2. 4 SCAR分析 除将 RAPD扩增条件调整为 MgCl2 1. 5 mmol L- 1、 68℃复性、 35个循
环外 ,其他同 RAPD分析。
2 结果与分析
2. 1 RAPD引物的筛选与偃麦草特异 RAPD标记分析
利用普通小麦中国春和中间偃麦草 ( SZ)为材料 ,对 100条 RAPD引物进行筛选 ,结果 98
2 中 国 农 业 大 学 学 报 2002年
个引物有扩增产物 ,其中在 2材料间表现多态性的引物有 68个。选用 12个在中间偃麦草能扩
增出特异片断而中国春无此片段的引物 ,利用长穗偃麦草 RM1119、 RM1123、 RM1935,中间
偃麦草 RM1130、 RM1941对其进行进一步扩增鉴定 ,发现引物 O PF03能在所有 5份偃麦草
材料中稳定扩增出一条 1 300 bp左右的特异片段 ,然后用此引物对所有供试材料进行了
RAPD分析 (图 1)。
图 1 引物 OPF03在普通小麦、中 2、长穗偃麦草及中间偃麦草中的扩增结果
M: Marker; 1:中国春 ; 2:京 411; 3:中 2 4: RM 1119; 5: RM1123;
6: RM1935 7: P1179162; 8: PI251443; 9: PI276709; 10: PI308591; 11: PI308592;
12: PI380626; 13: PI469212; 14: PI547326; 15: 901; 16: RM 1130; 17: RM1937;
18: RM1938; 19: RM 1940; 20: RM1941; 21: RM1942; 22: RM 1943; 23: RM1944;
24: RM1948; 25: SZ 箭头所指为偃麦草特异片段 OPF031291
由图 1可以发现 ,除 2份小麦和长穗偃麦草 901外 ,在其他长穗偃麦草和所有中间偃麦草
以及中 2中都有一条 1 300 bp左右的特异片断。中 2是普通小麦与中间偃麦草之间的部分双
二倍体 ,附加了 1套 E染色体组 [ 11] ,特异标记在中 2出现 ,表明该标记可以作为 E染色体组的
特异标记。有研究证明 , OPF03是比萨偃麦草 ( Th.bessarabicum 2n= 14, Eb Eb )的特异引物 ,利
用该引物可以将其与亲缘关系很近的二倍体长穗偃麦草 ( Th. elongatum 2n= 14, Ee Ee )区别开
来 [12 ]。在供试的偃麦草材料中 , 901为确定的二倍体长穗偃麦草 ,根据前人及本研究结果 ,我们
推断 901可能只含有 Ee染色体组。 而长穗偃麦草和 Elytrigia elongata这一种名以前一直共
用于二倍体、十倍体和其他倍性的偃麦草种 ,而多倍体偃麦草的 E染色体组常由 Ee、 Eb组
成 [13 ] ,本试验的结果显示其他长穗偃麦草中可能含有 Eb染色体组。中间偃麦草是六倍体种 ,
染色体组组成为 Ee Eb St,因此所有中间偃麦草出现此片断是必然的。
2. 2 偃麦草染色体组特异 RAPD片断的序列分析
我们从中间偃麦草 ( SZ)中回收、克隆了上述片断 ,在上海生工测序后得到了该片断的全
长序列 (图 2)。 图中 5′端和 3′端有下划线的 10个碱基分别为引物 O PF03的碱基序列及其反
向互补序列。 该片断长 1 291 bp,故命名为 O PF0312 91。
用 GenBank查询的结果显示 , OPF031291 586～ 1291之间的 706个碱基与一比萨偃麦草的
RAPD标记 1～ 706碱基序列同源性达 88% 。 该标记为比萨偃麦草的特异 RAPD片断
O PF031296 ( GenBanke序号 U43516) [3 ]。 这一结果表明 ,该引物在 2种偃麦草中的扩增片断存
在差异。同一引物对存在于不同物种中的同一染色体组扩增片断存在长度和序列上的差异 ,这
说明在物种进化过程中 ,该染色体组结构已经发生了变化。
2. 3 偃麦草染色体组 SCAR标记的建立
将 OPF031291序列输入 Primer Premier 5. 0软件 ,设计了 2对 PCR引物 ,其序列分别为:
P1: 5′-CCTGGCAAGGCTAATGT GATGG-3′; P2: 5′-T TGTTCTTCGGCGT GTTGGAT A-3′;
P3: 5′-GCT GAATCTGCGTATCGTCCC-3′; P4: 5′-GACT TGT TCT TCGGCGTGT TG-3′。这
3第 5期 尤明山等: 偃麦草 E染色体组特异 RAPD和 SCAR标记的建立
1 CCTGATCACC AAAGCT TGAA GTATT TATTC ACTCAGCCGG ATCT TAATCT
51 CCGTCAACAA CGATGGT TGG AAACAATT AC TGAATATGAC TGCGGTAT TT
101 CT TATACCCC TGGCAAGGCT AATGTGATGG CTGATGCC TT GAGTCGCAAG
151 TC ATATTGCA AT AATC TCAA GGT TAAGCGA GCTCAACCTC GTCT TTATGA
201 AGAGCTGAGC AAGC TGAATC TGCGT ATCGT CCCACAGGGT TCGCTT AATG
251 ACCTTGTGAT ACAGCCAGAT CTT GAGAAGG CTGTCAAGGA TGCGCAAGCC
301 AAAGATGCTA AAATTGATCT CATGAAGAAA GAAC TTCATC T TCCGAAGT A
351 CAGGGAT TTC TCGATAT TTG AAGATGAAAC CT TGTATT TC CGAGACCGCA
401 TC ATGGTAAC TCGT TTCGAG CTT ATGACTG ACAAGGTCAT GAAGGAGGCA
451 CATGATACAC CACTGTCT AT TCATCCTGGT AGCACCAAGA TGT ATCGTGA
501 TC TCCGACAA AGGT ACTGGT GGTCT AAGAT GAAGCAGGAT ATCGC TCGAT
551 ATGT TGCTGA GTGCGATGTC TGTCGTCGCG TGAAAGCAGA ACATCAGAAG
601 CATGCTGGAA TTCTGCAACC TCT TCCTATC CCGC TGT GGA AATGGGATAA
651 GGTTCAGATG GATT TCATTA CTGGTC TTCC CAAGTCGCAG AAGGGTC ACG
701 ATGCCATTCT TGTCGTCGTC GACCAAC TCT CT AAAGTTGC ACAC TTCCAG
751 CCAGTGAAGG AGAC TATCAC TGCTAGCCAG TTAGCAGAGT TGT ATATCTC
801 CAGAAT TGTT TCCC TCCACG GTATTCCGAA GGAGATCTGT TCGGACCGTG
851 GCGTCCT TT T CACTTCCAAG T TCTGGGAAA GCTTCCAAGA AGCCATGGGA
901 ACTCATAT TA CT TGGAGTTC AGCT TATCAC CCCCAGTCCC AAGGCCAAGT
951 CGAATGAGTC AATCAAGTGC T TGAAGAT AT GCTGCGAGCT TGTGT TATAT
1001 CCT TCGGTAA GAAATGGGAG GAATC TC TCC TGTATGCCGA GTTC TC TTAT
1051 AACAACAGCT GTCAAGCT AG CTT GAAGATG GCTCCATT TG AAGTGCT AT A
1101 TGGATT TAAG TGTCGAACCC CTCTGAAC TG GTCAGAAACT GGGGAACGGC
1151 CACTTGT TGG TCC TGAT ATT ATCCAACACG CCGAAGAACA AGTCCGT AT A
1201 GTGCGTGAAA ATC TCAAGGC GGCTCAAGAC CGCCAGAAGA GCAACTATGA
1251 TCGCAAACGA TGGGGTT TGA CATATCAACC CGGTGATCAG G
图 2 OPF031291的核苷酸序列
二对引物分别包含序列长度 1 083 bp和 982 bp(含引物 )。 其中 P1、 P2在小麦和偃麦草中都
能扩增出一条与目标片断长度相符的片断 ,因而无法作为偃麦草染色体组的 SCAR标记。而引物
P3、 P4(图 2箭头下划线部分 )获得了很好的预期结果 ,其在供试材料中的扩增结果见图 3。
图 3 小麦、中 2、长穗和中间偃麦草 SCAR扩增结果 (材料编号同图 1)
在普通小麦中国春和京 411中无任何扩增产物 ,而在中 2和所有长穗偃麦草、中间偃麦草
中都有 1条很强的扩增片断。虽然在长穗偃麦草 901中无特异 RAPD片断 O PF031291 ,但有与
其他偃麦草同样的 SCAR产物。 关于这一结果的原因 ,有研究证明 ,大多数染色体组特异的
RAPD标记 ,其染色体组特异性主要决定于引物结合位点 ,而非引物之间的 DNA序列 [14 ]。 引
4 中 国 农 业 大 学 学 报 2002年
物 P1、 P2在小麦中能扩增出与偃麦草相同的 SCAR产物 ,也验证了这一结论。 而 Ee和 Eb是
亲缘关系非常近的 2个染色体组 ,虽然这 2物种中 RAPD引物配对位点不同 ,但根据这一结
论 , 2染色体组完全可能具有相同的 SCAR引物匹配位点。
2. 4 RAPD和 SCAR标记的验证
为了进一步验证上述结果 ,用 RAPD引物 O PF03和 SCAR引物 P3、 P4对小麦 -二倍体长
穗偃麦草异代换系、异附加系进行了扩增。 结果发现 ,代换系、附加系材料同小麦一样 ,并没出
现 RAPD引物的特异扩增片断 O PF031291 ,进一步证明了该引物在二倍体长穗偃麦草 Ee染色
体组中没有特异匹配位点。而标记 SCAR982则出现在所有代换系和附加系材料中 ,表明该标记
位于偃麦草 Ee染色体组的所有染色体上 ,为偃麦草 Ee染色体组的特异 SCAR标记。这一结果
也进一步验证了对偃麦草材料的 SCAR扩增结果。
3 讨 论
高等真核生物基因组的重要组成部分是中度和高度重复序列。研究表明 ,高等植物中 ,相
对于单拷贝和低拷贝数 DNA在不同物种中的高度保守性 ,重复 DNA序列在进化过程中会发
生更快的变化 ,从而产生更多的遗传变异 [15, 16 ]。因此 ,很多重复 DNA序列是物种或染色体组
特异的。这些重复 DNA序列在远缘杂交过程中异源遗传物质的检测、物种系统发育关系研究
等许多领域都是很有用的工具 [ 14, 17 ]。
小麦族植物 70%以上的基因组 DNA是重复序列 ,其中大约 16% ～ 45%基因组 DNA具
有物种或基因组特异性 ,而扩增很强的 RAPD片断常常来自重复 DNA序列 ,并且 RAPD标
记克隆较为容易 ,又可作为 Southern和原位杂交的适宜探针 ,因此寻找并克隆一些基因组特
异的 RAPD片断 ,对研究物种的起源、进化及远缘杂交育种中外缘遗传物质导入后的检测是
很有意义的 [3, 12 ]。
RAPD在小麦中检测到的多态性较低 ,限制了其在小麦中的广泛应用。虽然如此 ,通过
RAPD还是获得了一些重要性状的分子标记 ,其中一些标记已转化为 SCAR[18 ]。 此外 , RAPD
标记在外源种属中能够检测到较为广泛的多态性 ,在研究这些异源植物的遗传多样性方面 ,
RAPD标记是一个很有效的手段 [19 ]。而通过 RAPD标记检测小麦中的外源遗传物质并将其转
化为 SCAR标记的研究 ,在最近的文献中也有许多报道 [ 20～ 23 ]。 RAPD在许多研究领域应用的
优越性 ,决定了它仍是一个非常有应用前景的分子标记形式。
4 结 论
小麦族植物染色体组间都存在着部分同源关系 ,但不同染色体组间亲缘关系远近不同 , Ee
和 Eb是亲缘关系非常近的 2个染色体组。本研究将一个偃麦草 Eb染色体组特异 RAPD标记
转换为 SCAR标记后 ,可以同时作为 Ee染色体组的标记 ,为小麦与偃麦草种质间杂交后代中
偃麦草遗传物质的快速检测提供了一条新途径。
参 考 文 献
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