全 文 ：植物生理学报 , A c t a 尸人yt o仲y s沁王。 自比a is 。 介a 199 4 , 20 ( 4 ) : 3 25一 33 1
真菌诱导物在滇紫草细胞培养中对紫草色素形成的影响
宁 文 赵群华 夏仲豪 曹 日强
(南京大学生物系 , 南京 21 0 0 0 8)
提要 在淇紫草细胞 悬浮培养中 ,真 菌诱 导
物 可抑制细胞生 长 , 促进萦草色素的 合成 。
将 培养 6 d 的 曲 雾 菌丝体 的粗提物 以 6 0 陀
破水化合 物 / 50 ml 培养液 的浓度 加 入到处
于指数生 长初期 的 淇紫草细 胞急 浮培养物
中 ,诱导物促进萦草色素 合成 的 作用最 大 ,
紫草色素含 1 为对照 的两倍 。 经 高压 锅处理
20 m in 到 Z h 不 影响诱导物 的 活性 。 真 菌诱
导物还影响 了紫草 色素各衍 生物 的相 对含
黄 。
关锐词 : 淇萦草 , 真菌诱导物 , 紫草色素 , 细
胞急浮培养
一 种特定的化学信号 , 在植物细胞与真菌
的相互作用中 , 能快速 、 高度专一和选择
性 地诱导植物特定基因的表达 ,进而活化
特定的次生代谢途径 , 积累特定的 目的次
生 产物 (宁文和曹 日强 19 9 3) 。真菌诱导
物也是研究植物次生代谢调控的很好的实
验手 段 。
我们实验室筛选 出一种曲霉属 (海
娜娜故绍 印 . )真菌 , 其菌丝体的粗提物具 有
诱导物活性 , 可提高滇紫草悬浮培养细胞
的紫草色素产量 ( ca 。 和 hZ ao 1 9 9 1 ) 。本 工
作是研究该真菌诱导物促进紫草色素形成
的活性及影响这种活性因素的初步 结果 。
滇 紫 草 ( 〔万刃 , 湘 产抓初侧翔姗爪 B u r . e t
rF a n c h )为传统中药 , 紫草色素为其重 要
的有效成分 ,是具有药用价值的天然色素 。
借助细 胞培养技术生产紫草色 素 , 是 开
发滇紫草资源的新途径 。 在细胞培养中人
们不断应用新方法 , 优化培养条件 , 以 提
高紫草色素产量 。 其中之一就是利用真菌
诱导物 ( f u n g a l e il ic ot r )快速地提高 紫草色
素的产量 。 K j l n 和 C h a n g ( 1 9 9 0) 从一种青霉
属真菌仍哪必边如执 sP . )的菌丝 体中提取诱
导物之粗提物 , 加入 M。培养基中 , 大大提
高了悬浮培养的硬紫草细胞中紫 草宁及
其衍生物的产量 。
近十几年来 , 国外在植物组织和细胞
培养中利用真菌诱导物提高目的次生产物
产量的研 究一直是个热点 ( ca 。 和 z h a o
1 9 9 1
,
ilE
e r t 1 9 8 7
,
F u r z e 等 1 9 9 1 , H am e r s k i
等 19 9 0 , K im 和 c ha n s 1 9 9 0 , o 恤 和 u r i -
饭川 19 79 ) 。 真菌诱导物是来 源于真菌 的
材 料 与 方 法
滇紫草细胞的培养 供试材料为云南产滇
紫草愈伤组织 。 采用两阶段培养方法 , 详
见所发表的文献 (宁文和曹 日强 19 9七朱
汝幸等 1 9 9 0 ) .
真 , 培养 曲霉菌种由南京大学生物系李
兆兰教授提供 。培养基为 B。基本培养 基 ,
不添加激素 , PH 5 . 0 。 菌球于旋转式摇床上
悬浮培养 ,转速 1 1 O r / m勿 , 振幅 2 . 5 c m 。 暗
培养 6 d 收获 。
真菌诱导物的粗提物制备和粗提物中总枪
含 t 测定 悬浮培养的菌球抽滤 , 加人 10
倍体积的重蒸馏水中 ,室温下匀浆 。 匀浆液
于高压灭菌锅 中处理 20 m i n 后抽滤 , 弃
去残渣 , 即得到真菌诱导物的粗提物 。粗提
物于无菌条件下加到滇紫草细胞的悬 浮
1 99 3一 0 7
一
05收到 , 1 99 3一 22 一 0 6修 回 。
植 物 生 理 学 报 2 0卷
ǎ亏ù弓 E丈兮OJ上1幸。`妞1 .0
Ot U l比D lJ`月…ō !万ō 11 丹e气 l一sE工 .ǐ” . EJ、 .à>ǐ --,一`.pc一o芯`.ó 0材cauo
培养物中 ,检测真菌诱导物对紫草色素形
成 的影 响 。 采 用 苯酚 一硫酸法 ( uD bo is 等
1 9 5 6) 测定粗提物的总糖含量 , 以葡萄糖为
标准样品 。
细胞生长测定 以细胞干重为生长量的指
标 。将悬浮培养的细胞抽滤 , 60 ℃烘至 恒
重作为细胞干重 。
紫草色素产 t 测定 悬浮培养 的细胞抽
滤 ,将细胞和滤液用石油醚分别冷浸 , 反
复提取至无色 。 合并提取液 , 定容 。 于 5 20
mn 处 比 色 测 得 紫草色素产量 ( m s/ L
m e d l u m )
。
紫草色素组成的高压液相色谱 ( H P L C )分
析 紫草色素溶于重蒸 甲醇后直接进行
H p L C 分 析 。 色 谱柱 为 O D S一 C 18 , 孔径 5
帅 ,柱长 4 . 6 x 25 0 m m 。流动相体积比为氛
仿 : 甲醇 : 水 : 冰醋酸 一 1 5 : 57 : 2 : .6 , 流速
为 0 . 6 而 / m i n 。 压力为 10 . 3 M p a , 温度 为
2 5℃ 。 检测波 长 U v 2 7 0 n m ,灵敏度 0 . 0 5 。
标准品由硅胶连续薄板层析制备 , 详见朱
汝幸等 ( 1 9 9 0 ) 。
涟
CO 。 亡e n t r 一 t一以 ,
p r即 a r 一 t 。 。 / 50 军 e r u d em de i u m )
图 1 真菌诱导物粗提物用量对滇紫草细胞生长
和 紫草色素形成的影响
F ig
.
1 E f f ce st o f t he am
o u n t o f e r u d e P r e Pa r a t i o n o f
f u n助 1 e l e i ot r o n ce l l gr o w ht a n d s址k o n in d e r iv a t i v es
f o r m
a t io n in o
· 卿如叭血” eC l l c u l t u r e
乃`幸认.à
, .月八甘
护`李`。目一:5ó
结 果
八 8 7 0
n甘ùnUnU八ù、甘1曰ó 10口,厅.以`UOO几,.,厅了互ù弓E之.以.-^脚-`^ū`ap资`。占蛋加脚e`ùvoU真菌诱导物的浓度对促进紫草色素形成的
影响
真菌诱导物可促进目的次生产物 的合
成 , 其促进作用与浓度有关 ( E il e r t 19 8 7 ) 。
图 1显示在 50 ml 培养液 中加入真菌诱导
物粗提物 的最适浓度 为 l ml 诱导物粗提
物 / 50 iln 培养液 ,相当于 12 陪 碳水化合物
/ iln 培养液 。 此时诱导物促进紫草色素形
成 的作 用最大 , 滇紫草 细胞色 素含量为
5 9 5 ms / L
, 比对照 ( 2 9 7 m g / L )增加约 1倍 。
低于或 高于此浓度均不能最大程度地促
进紫草色素的形成 。 同时 , 加入真菌诱导物
也抑制 了滇紫草细胞的生长 。
C u t t u r . t曰 e ( d )
图 2 真菌生长阶段对诱导物促进滇紫草细胞紫
草色素形成作用的影响
F坛 . 2 eD ep n d e n ce o f t h e iel d ot r ’ s ace ler a itn g
s h i k o n i n d e r i v a t i v e fo r m a it o n in 0
. 产. 应涵劝翻 沈 U
e u l t u r e o n t h e s at g e o f gt o w t h o f the f un g us
4期 真菌诱导物在滇紫草细胞培养中对紫草色素形成的影响
提 物 ,结果表明在滇紫草细胞生长期初期
(第 8天 ) 加入粗提物时 ,诱导物作用最 明
显 。 而在其它时期加入 ,其作用按指数生
长期末期 、 稳定期 、 延滞期依次下降 ( 图
3b )
。 于延滞期 (第 4天 ) 加入诱导物后培养
液的 p H 值迅速上升到 7 . 0~ 7 . 5 , 呈弱碱
性 , 而不 利于滇紫草细胞的生长及紫草
色素的形成 。
内O
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乙/ 义 洲一 .一减
7目`b`曰月ō丈ú-J、多0.à`1,o`肠ù.。
ó.苦Ob人璐撇衅叶琳赫ǎEn一勺.-`J、苗à1之--,`召
uùo盆近,ó。妇.甲`O
X 菌生长状态对诱导物促进紫草色素形成
的影响
配制曲霉抱子悬液 ( 1 0 6个抱子 / inI ) ,
于装有 20 血 无激素 B S培养基的 1 0 irn 三
角 瓶中每瓶接种 0 . S iln ,悬浮培养 。 测定
曲霉生长 曲线如图 a2 所示 ,生长 曲线为 s
型 , 延 滞期为 1一 Z d , 指数生长期为 3一 4
d , s d 以后曲霉生长进入稳定期 。
分别将培养 2一 s d 的菌丝体加入 10 倍
于其鲜重的重蒸馏水 ,制备诱导物粗提物 。
按 1 而 粗提物 / 50 而 培养液的量分别 加
入到滇紫草细胞悬浮培养物中 。 如图 b2 所
示 , 真菌培养 6 d ,即生长处于稳定期的曲
霉 , 其菌丝体粗提物的诱导物活性最高 。 因
此 , 曲霉悬浮培养 6 d 后即可收获制备诱
导物 。
提取真菌诱导物时高压锅处理时间对诱导
物促进紫草色素形成的影响
文献中 ( o os
e sn 等 1 9 8 7 ; G r a h am 和
G r a h a m 1 9 9 1 ; T o P Pa n 和 凡 q u o r r亡一 T u 助 y色
1 9 8 4) 高压锅处理提取真菌诱导物的时间
从 20 m in 到 3 h 不等 。 我们将菌丝体匀浆
物 分别高压锅处理 20 ~ 一 Z h
,与未加诱
导物的对照相 比 , 检测不 同处理时间对诱
导物 活性的影响 。
由表 1可知 , 高压锅处理时间的长短不
影响菌丝体粗提物中诱导物的活性 ,粗提
物 中总糖含量基本相 同 。 说明该诱导物是
快速溶于热水 ,且热稳定性好 。 一般情况下
菌丝体匀浆物高压锅处理 20 m in 即可 。
滇紫草细胞生长状态对真菌诱导物诱导活
性的影响
如图 a3 所示 。滇紫草的细胞生长 曲线
是一个扁平的 S 形 , 延滞期为。~ d4 , 指数
生 长期为 4一 1 d2 , 稳定期为 12 ~ 2 d0 。 分别
于细胞生长延滞期 (第 4天 ) 、 指数生长期初
期 (第 8天 ) 、 指数生长期末期 (第 12 天 )和
稳定期 (第 16 夭 ) 向培养物 中加入诱导物粗
0 2
J一 _ 上 1 1 _ 一上 1 1 1
6 8 1 0 1 2 14 1 6 1 8 20
叼 t u r e t湘 e ( d )
图 3
毗 .
滇紫草细胞生长阶段对真菌诱导作用的影响
3 T h e d e ep
n d e n ce o f f un 助 l e l e i at t i o n on the
s at g e o f gr o w th o f 0
. 产 . 幼侧翔址m ce l
诱导物对细胞 的生长也有影 响 。 于滇
紫草细胞生长的任何时期加入诱导物 , 均
可使 细 胞 生 长 受 到 永 久 性 抑制 ( E ile rt
19 8 7 )
。
真菌诱导物对紫草色案各衍生物相对含 t
的影响
真菌诱导物的作用不仅可以提高紫草
色素的总量 ,还可影响紫草色素各衍生物
的相对含量 。采用 H P L c 分析法比较经诱
植 物 生 理 学 报 2 0卷
表 i 提取真菌诱导物时高压锅处理时间对诱导物促进紫草色素形成的影响
T a b】 e 1 E f f e ct o f du ra t i o n o f a u t OC 1a v in g fO r th e ex t ra Cti o n o f f un 幼 l el l cl to r o n i ts a l l l bty t o Pt o 们门。 t e t be fo rm a -
ti o n Of
S hj k o n in d
et i v a t i v se
T lm e o f t r比 tm en t
( 刃n l n )
T o 仪习叫 g a ro cn t ne t in C o n t en t of S hi ko n in
e ru de el i dto
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4 2 5
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图 4 紫草色素各衍生物的 L H p c图谱
F I.
.
4 HP L C s , 戈 t r a o f s址k o n in d e r iv a it v es
a : S at n d a r d s a l n lP e ; b : C o n t r o l ; e : A f et r t h e a e t i o n o f th e e l i e i ot r s
.
I = A = s址 k o n in ; I = B一卜 h y d r o x y招 c卜
v a l e r y l s加 k on in ; I = C = A e e t y 1S苗 k o n in ; VI = D = 〔晓。 x y is 址 k o n in ; V = E = 日,卜 d加 e th y la cr y is hi k o n l n .
导物处理和对照的紫草细胞中的紫草色素
各衍生物组成情况 ,与标准样品相 比较 ,定
性 、 半定量地分析其紫草色素的组成 。 结
果如图 4所示 。
经诱导物处理后的滇紫草细胞的紫草
色素各主要衍生物的相对含量与对照相 比
发 生一定变化 。设各衍生物 的 PH cL 图谱
各峰高之和为 1 0 , 则各衍生物的峰高占
总 峰高的百分数表示其相对含量 。从表 2
可 以 看 出 : 诱导处理的细胞 中乙酞紫草
素 、 去氧紫草素两种衍生物的相对含量比
对照有所增加 , 而紫草素 、 压经基异戊酥紫
4期 真菌诱导物在滇紫草细施培养中对紫草色素形成的影响
草素和 日, 卜二甲基丙烯酞紫草素三种衍生
物的相对含量下降 。
表 2 真菌诱导物对紫草色素各衍生物相对含量
的影响 ( % 总峰高 )
aT b l e 2 E f f eC st
o f f un 劝 1 e l e i t o r on t he r e l a it v e co n -
t en t ( % ot
o l ep a k h e吵 t ) Of ea hC o f s hi k o n in d e r iv a -
it V e S
T r比 tm e n t C o n tr o l F l i村 tot
S h生 on in 0
.
4 9 0
.
3 5
卜 H y d r o x y i s o v a l e r y l s hi k o n in 1 3 . 1 3 1 2 . 6 6
A ce yt is hi k o n in 6 9
.
1 0 7 7
.
0 0
D , x y l s h lk on in 2
.
1 3 3
.
3 0
日, 卜曰山 e t h y la cr y is 苗 ko n in 1 5 . 0 7 6 . 6 8
讨 ’ 论
实验结果表明 : 一定生长时期的真菌 ,
菌丝体粗提物于适宜浓度下加入到一定
生长阶段的滇紫草细胞培养物中 , 促进紫
草色素合成的作用最大 ,这是因为 : ( l) 真
菌诱导物粗提物中不但含有可促进紫草色
素合成的诱导物 , 还含有抑制色素合成的
抑制物质 ( D议 on 19 8 6 ) 。 两者在粗提物中
的 比例与真菌所处的生长状态有关 。 因
此 ,随着真菌培养时间的加长 ,粗提物中诱
导物与抑制物的量和 比例也发生变化 ,两
者比例的改变影响了诱导物的作用 。 (2 )诱
导物活性与浓度有关 , 真菌诱导物活性与
浓 度的关系 曲线有 两种类型 ( sa utr at i on
e u r v e 和 s h ar p o p t诵 u m e u r v e ) ( E il e r t
19 87 )
。本实验中真菌诱导物的活性与其浓
度的关系曲线类型属于后者 , 于 50 时 滇
紫草悬浮培养物中加入真菌诱导物粗提物
的最适量为 I iln 。 ( 3) 在植物细 胞培养中 ,
大部分次生产物的合成在细胞生长稳定期
达到高峰 。 但细胞感受外界刺激 、 调节内
部代谢的能力 与细胞所处的生长 阶段有
关 , 如有些植物细胞只有处于生长指 数期
时 , 才能接受诱导物信号 ,进而调节细胞 内
目的次生产物的合成 ,此时诱导物表 现出
较高的活性 , 而处于其它生长状态的细胞
则不接收诱导物信号 , 此时诱导物表 现
出较低 活性或 不表现活 性 ( E iler t 1 9 87 ;
oba 和 u ir刚 1 9 7 9 ) 。本实验表明 , 处于指数生长期的滇紫草细胞接受诱导物信号的
能力最强 ,诱导物显示出最大的促进紫 草
色素合成的能力 。
真菌诱导物可影响滇紫草细胞中紫草
色素各衍生物 的相对含量 。 因为各色素
衍生物具有相同的母核 , 它们之间的区别
主要在侧链上 , 在一定条件下可以相互转
化 。 真菌诱导物可能会影响衍生物之间的
转化 , 或对各衍生物合成的促进程度不
同 , 因而造成各衍生物的相对含量发生改
变 。
真菌诱导物对植物次生代谢的调节有
两种方式 , 一是诱导新酶的合成 , 启动新
· 的代谢支路 ,从而合成新的次生产物 。 如曼
陀萝 (刀叻盯。 旋 . 双艰如扔 ) 的根可以合 成生
物碱 ,经诱导物处理后 , 生物碱的合成受到
/ 抑制 ,根中快速积累大量的倍半菇类 次生
产物 , 表明与生物碱合成有关的酶受到抑
制 , 而与倍半菇类次生产物合成有关 的
新酶出现 ( F u r z e 等 1 9 9 1 ) ;二是增 加原代
谢途径中关键酶的量 , 从而提高该次 生
产物的产量 ( L u e k n e r 和 侧 e t tr i e h 19 9 0 ) ,如
悬浮培养的大阿米 (油姗丽 ,加尹绍 ) 细胞 只能
形成微量的 u m bo n if e r on e , 经诱导物处理
后 , 细 胞可 以 合成大量 的 uln be u if e r on e
( H `m er sk i 等 1 9 90 ) 。 在我们的实验中 , 悬
浮培养 的滇紫草细胞的紫 草色素含量为
29 7 mg L/
, 经诱导物处理后使色素含量提
高约 1倍 ( 5 9 5 毗 / L ) 。
3 3 0 植 物 生 理 学 报 20卷
参 考 文 献 f e
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r留 P o n s e
f u n助1 ·
宁 文 , 曹 日强 。 真菌诱导物岁寸植物次生代谢
的调控 . 植物生理学通讯 1 9 93 , 2 . : 321
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1 9 9 4
,
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朱汝幸 , 曹日强 , 王曼丝等 。 澳紫草愈伤组织中
的紫草色素 。 植物学报 1 9 9 0 , 3。 : 749
C a o RQ
,
Z h a o Q H
.
S t im u la it on
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. Ud 切” . 扭 F u n 汹止1 5 以 以 ( e d s ) , BI OC h e而叨 1
助因比er in g F O r 2 00 1 . S P r in ge r一 V e r la g , 19 9 1 ,
P 2 8 6
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s翅刃 a U n g an d co n tr 0 1 of hOS t g e n e e x P r 已妇 io n .
丑汉 月映夕 19 8 6 , 6 1 : 2 3 9
D u b o妇 M , G U les K A , H a m il t o n J K 时 心 . C o 10 r 卜
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2 8 : 3 5 0
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s o f F u n g a l E il e i t o r o n S h i k o n i n D e r i v a t i v e s F o r m a t i o n i n
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s l i g h t l y t h e r e l a t i v e e o n t e n t o f e a e h o f
t h e s h ik o n i n d e t i v a t i v e s
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K e y w or ds : 凸双劝加 只. 七涵叻姗弓 , f un ga l e l d t o r ,
s址 k o n in d e r i v a t i v es , e e l l e u l t u r e