全 文 ：［收稿日期］ 20120214(012)
［基金项目］ 河 南 省 教 育 厅 自 然 科 学 研 究 项 目
(2010A360010) ;郑 州 市 普 通 科 技 攻 关 计 划
(10PTGS485-1)
［通讯作者］ * 张红梅，博士，副教授，Tel:0371-65575823，E-
mail:qtb2006@ 126. com
蒲公英 ISSR-PCR反应体系及扩增程序的建立与优化
李喜凤1，邱天宝1，张红梅2* ，胡利欣1，胡春月1，郑楠楠1，唐露1
(1. 河南中医学院药学院，郑州 450008;2. 郑州大学医药科学研究院，郑州 450052)
［摘要］ 目的:优化蒲公英 ISSR-PCR 反应体系及扩增程序;筛选适合的引物，并确定最佳退火温度。方法:采用 CTAB
法提取蒲公英叶片的 DNA，利用正交试验设计，从 Taq 酶 MIX、模板 DNA、引物 3 种因素 2 个水平，对蒲公英 ISSR-PCR 反应体
系进行考察;采用单因素实验对其扩增程序进行优化。结果:确立了适合于蒲公英的最佳 ISSR-PCR 反应方法，即在 25 μL 反
应体系中，内含 Taq 酶 MIX 15 μL(1. 25 U Taq DNA 聚合酶，1. 8 mmol·L － 1 Mg2 +，dNTPs 各 0. 24 mmol·L － 1) ，0. 3 μmol·L － 1引
物，5 ng 模板。在此基础上，从 50 条引物中筛选出 16 条扩增稳定、多态性丰富的 ISSR 引物，并通过梯度 PCR 试验，确定引物
最佳退火温度。结论:采用单因子试验和正交设计方法可以快速建立 ISSR-PCR 反应体系，经过验证，证明该体系稳定可靠，
可用于蒲公英遗传分析。
［关键词］ 蒲公英;ISSR-PCR;正交实验设计
［中图分类号］ R282 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2012)16-0119-04
Optimization for Reaction System and PCR program
of Taraxacum mongolicum ISSR-PCR
LI Xi-feng1，QIU Tian-bao1，ZHANG Hong-mei2* ，HU Li-xin1，HU Chun-yue1，ZHENG Nan-nan1，TANG Lu1
(1. Henan University of Traditional Chinese Medicine (TCM) ，Zhengzhou 450008，China;
2. Academy of Medical and Pharmaceutical Sciences，Zhengzhou University，Zhengzhou 450052，China)
［Abstract］ Objective:To establish and optimize ISSR-PCR reaction system for Taraxacum mongolicum．
Method:Based on the analysis of orthogonal design test，an orthogonal design was used to optimize the ISSR-PCR
amplification system on T． mongolicum by three factors (Taq polymerase Mix，DNA template and primer)at two
concentration levels，respectively． PCR program was optimized by single factor experiments． Result:The suitable
PCR reaction system contained 15 μL Taq polymerase MIX (1. 25 U Taq DNA polymerase，1. 8 mmol·L － 1Mg2 +，
dNTPs 0. 24 mmol·L － 1) ，0. 3 μmol·L － 1 primer and 5 ng template DNA in total 25 μL reaction solution． On
this basis，16 primers were screened with stable amplification and rich polymorphism from 50 ISSR primers． The
optimal annealing temperature for ISSR-PCR reaction was proposed by gradient PCR． Conclusion:It is a way to
establisd the ISSR-PCR system for orthogonal design combining with single factor test． This optimized ISSR reaction
system would provide the basis for the genetic analysis of T． mongolicum．
［Key words］ Taraxacum mongolicum;ISSR-PCR;orthogonal design;single factor test
蒲公英来源于菊科植物蒲公英 Taraxacum
mongolicum Hand． Mazz．、碱地蒲公英 T． sinicum
Kitag．或同属数种植物的干燥全草［1］。目前对于蒲
公英的研究多集中在有效成分含量测定、临床药理
研究、营养成分分析等方面，对其运用 ISSR 分子生
物技术的研究尚未见报道。
ISSR(inter-simple sequence repeats，)即简单序
列重复间扩增多态性，是 Zietkiewicz 等［2］于 1994 年
建立的新型分子标记技术。该技术结合了 RAPD 标
记技术和 SSR 标记技术的优点，具有操作简单、成
本低廉、多态性高等优点。由于 ISSR 技术是基于
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第 18 卷第 16 期
2012 年 8 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 18，No． 16
Aug．，2012
DOI:10.13422/j.cnki.syfjx.2012.16.089
PCR 反应的一种标记，扩增结果易受到多种因素的
影响，虽然目前国际上一些大型生物试剂公司已经
开发了大量的 Taq 酶 MIX 试剂，以减少 PCR 反应过
程中的干扰，但为了获得重现性较好、可靠性较高的
图谱，还需对各影响因子的最佳反应条件进行探索，
建立稳定的反应体系。本研究以蒲公英基因总
DNA 为模板，利用正交试验法对其 ISSR 反应体系
进行优化，采用单因素实验对其扩增程序进行考察，
为下一步蒲公英种质资源遗传多样性研究提供可靠
的技术支持。
1 材料
蒲公英均为野生，采自河南省、吉林省，经河南
中医学院生药学科陈随清教授鉴定均为菊科植物蒲
公英 T． mongolicum Hand． Mazz．。选取植株中幼嫩
叶片，清洗，硅胶快速干燥，备用。
Taq DNA 聚合酶(含 Taq DNA 聚合酶、Mg2 +、
dNTPs、Buffer、染料等) ，DNA marker(DL2000)购自
TaKaRa 宝生物工程(大连)有限公司。ISSR 引物采
用加拿大哥伦比亚大学设计公布 的 引 物，由
invitrogenTM英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。所
使用的引物序列如下(5→3) :840-GAG AGA GAG
AGA GAG AYT，Y 代表 G 和 C。
2 方法
2. 1 蒲公英基因组总 DNA 的提取 参照文献［3］
采用 CTAB 法提取蒲公英基因组总 DNA。采用琼
脂糖凝胶电泳法检测 DNA 提取结果，见图 1。同时
用蛋白核酸测定仪(eppendorf 公司)测定其浓度和
纯度，并将样品稀释为 10 μg·L － 1，用于 ISSR 反应
条件的优化实验。
图 1 蒲公英总 DNA 电泳
2. 2 正交实验设计 在预实验的基础上采用 L4
(23)正交试验设计方案，对影响 ISSR-PCR 扩增的
主要因素:Taq DNA 聚合酶 MIX(含 Taq DNA 聚合
酶、Mg2 +、dNTPs、Buffer 等)、引物、模板设计 3 因素
2 水平的正交试验，共 4 个处理，设 3 次重复。ISSR-
PCR 各反应成分因素水平及正交试验，见表 1，2。
2. 3 ISSR-PCR 扩增 PCR 反应体系总体积为 25
μL，包括 Taq 酶 MIX，引物，模板 DNA，各成分按照
表 1 加入。最后用 ddH2O 补足。每个处理进行 3
次重复。反应程序为:94 ℃预变性 5 min，94 ℃变性
表 1 ISSR-PCR 反应体系正交试验因数水平
水平
Premix
/μL
引物浓度
/μmol·L － 1
DNA /ng
1 12. 5 0. 3 2. 5
2 15. 0 0. 4 5. 0
表 2 ISSR-PCR 扩增体系各成分因素水平正交设计
No．
Premix
/μL
引物浓度
/μmol·L － 1
DNA /ng
1 12. 5 0. 3 2. 5
2 12. 5 0. 4 5. 0
3 15. 0 0. 3 5. 0
4 15. 0 0. 4 2. 5
30 s，45 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 2 min，循环 30 次，72
℃延伸 7 min，4 ℃保存。反应结束后，PCR 产物用
1. 2%琼脂糖凝胶(含 0. 05% EB)于 5 V·cm － 1电泳。
电泳结果在 BIO-RAD GelDoc-XR 凝胶成像仪进行
观察并拍照分析。
2. 4 最佳退火温度的确定 在确定最佳反应体系
的基础上，优化最佳退火温度。以引物 840 为例，在
PCR 梯度扩增仪上设置退火温度为 40 ～ 50 ℃。
PCR 仪自动生成的 8 个梯度温度，即 40. 0，40. 9，
42. 5，44. 2，45. 8，47. 5，49. 0，50. 0 ℃。扩增程序与
PCR 正交试验设计的反应程序相同。
2. 5 ISSR-PCR 扩增程序优化 在确定最佳反应
体系基础上，对变性时间、退火时间和循环次数进行
优化筛选，每确定一个反应条件用于下一个试验中。
变性时间为 30，60，90 s;退火时间为 45，60，90 s;
循环次数为 25，30，35，40，45，50，55 次。
2. 6 引物筛选及最佳方法的验证 在确定最佳反
应体系及反应程序的基础上，筛选引物，并优化最佳
退火温度。随机选择已筛选的 ISSR 引物和不同居
群的样品，对优化确定的蒲公英 ISSR-PCR 体系及
扩增程序的稳定性进行检测。
3 结果与分析
3. 1 ISSR-PCR 反应体系的正交优化 对正交试验
扩增结果做直接分析［4］。图 2 显示，扩增效果存在明
显差异。编号 A 结果稳定性较差，普带较弱，非特异
性条带较多。编号 B，D 扩增谱带弱且数目少。编号
C 处理效果最好，谱带较强，多态性高。因此获得最
佳 ISSR 扩增反应条件为:总体积 25 μL，Taq 酶 MIX
15 μL(Taq DNA 聚合酶 1. 25 U，Mg2 + 1. 8 mmol·L － 1，
dNTPs 各 0. 24 mmol·L － 1) ，引物 0. 3 μmol·L － 1，DNA
模板 5 ng，其余用 ddH2O 补足。
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第 18 卷第 16 期
2012 年 8 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 18，No． 16
Aug．，2012
图 2 ISSR-PCR 反应体系的正交试验电泳
3. 2 最佳退火温度的选择 根据最佳反应体系，
对引物 UBC840 的退火温度进行梯度筛选，结果见
图 3。退火温度低于 42. 5 ℃时，扩增条带较少，亮
度较低;随着退火温度升高(42. 5 ℃以上) ，背景模
糊，特异性差，除了主带以外，杂带较多;当退火温
度为 42. 5 ℃时，谱带清晰、亮度高、多态性较高。因
此，确定 UBC840 的最佳退火温度为 42. 5 ℃。
1 ～ 8. 40. 0，40. 9，42. 5，44. 2，45. 8，47. 5，49. 0，50. 0 ℃
图 3 引物 840 最佳退火温度考察电泳
3. 3 ISSR-PCR 反应程序优化
3. 3. 1 变性时间的影响 变性所需的时间与 DNA
分子的长度相关，DNA 分子越长，在特定的变性温
度下使双链 DNA 分子完全分离所需的时间就越长。
若变性时间太短，则只能使 DNA 模板中富含 A，T
的区域产生变性，导致 DNA 变性不完全，从而导致
PCR 的失败。本实验考察了变形时间为 30，60，90 s
的 PCR 扩增结果，由图 4 可知，变性时间为 30 s 时，
扩增结果较 60，90 s 理想，因此选择变性时间为
30 s。
1 ～ 3. 30 s;4 ～ 6. 60 s;7 ～ 9. 90 s
图 4 ISSR-PCR 反应程序变性时间考察电泳
3. 3. 2 退火时间的影响 时间过长会导致变性的
DNA 两条链重新连接，影响下一步的延伸过程;退
火时间过短，会导致引物与 DNA 链连接不完全，造
成延伸失败或复制错配，出现条带的模糊，特异性降
低。由图 5 可知，退火时间 45 s 时，扩增的条带模
糊，特异性较差;延伸时间为 90 s 时，出现模糊的大
片段和小片段结果;退火时间为 60 s 时，片段清晰
可见，扩增结果理想。因此确定 60 s 为蒲公英 ISSR
反应最佳退火时间。
1 ～ 3. 45 s;4 ～ 6. 60 s;7 ～ 9. 90 s
图 5 ISSR-PCR 反应程序退火时间考察电泳
3. 3. 3 循环次数的影响 PCR 反应过程中一般使
用 25 ～ 35 个循环，低拷贝模板可适当增加循环数。
过多的循环数不见得可以提高 PCR 产量，相反可能
会增加非特异性扩增，减少特异性产物。循环次数
为 25 时，扩增量很少，条带模糊;随着循环次数的
增加，条带清晰度逐渐提高，但条带数目不断减少;
循环 40 次时，得到清晰度较高，数目合适的条带。
因此，确定 40 个循环为蒲公英 ISSR 反应最佳循环
次数(图 6)。
1 ～ 3. 25 次;4 ～ 6. 30 次;7 ～ 9. 35 次;10 ～ 12. 40 次;
13 ～ 15. 45 次;16 ～ 18. 50 次;19 ～ 21． 55 次
图 6 ISSR 反应循环次数的考察
3. 4 引物筛选及最佳反应方法的验证 按上诉最
佳反应体系及扩增程序，筛选适合蒲公英 ISSR-PCR
反应的引物，结果见表 3。随机选择 ISSR 引物
UBC857 对优化确立的蒲公英 ISSR-PCR 反应体系
的稳定性进行验证，能得到清晰、重复性好的谱带，
表明优化确立的蒲公英 ISSR-PCR 体系是稳定可靠
的。21 个居群蒲公英扩增结果见图 7。
图 7 UBC857 对 21 个居群蒲公英扩增电泳
本实验以蒲公英 DNA 为模板，建立了稳定、可靠、
重复性好、分辨率高的 ISSR 反应体系及扩增程序，
即在 25 μL 反应体系中，模板 DNA 为 5 ng，Taq 酶
MIX 15 μL(Taq DNA 聚合酶 0. 75 U，dNTPs 0. 24
mmo·L － 1，Mg2 + 1. 8 mmol·L － 1) ，引物 0. 3 μmol·
L － 1;扩增程序为 94 ℃预变性 5 min，94 ℃变性 30
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李喜凤，等:蒲公英 ISSR-PCR 反应体系及扩增程序的建立与优化
表 3 蒲公英 ISSR-PCR 引物和最佳退火温度
引物 序列(5→3)
退火温度
/ ℃
UBC808 AGA GAG AGA GAG AGA GC 49. 2
UBC811 GAG AGA GAG AGA GAG AC 44. 2
UBC817 CAC ACA CAC ACA CAC AA 44. 2
UBC825 ACACACACACACACACT 49. 2
UBC826 ACA CAC ACA CAC ACA CC 45. 8
UBC828 TGT GTG TGT GTG TGT GA 42. 5
UBC830 TGT GTG TGT GTG TGT GG 47. 5
UBC835 AGA GAG AGA GAG AGA GYC 50. 8
UBC840 GAG AGA GAG AGA GAG AYT 42. 5
UBC846 CAC ACA CAC ACA CAC ART 43. 3
UBC847 CAC ACA CAC ACA CAC ARC 50. 8
UBC851 GTG TGT GTG TGT GTG TYG 50. 0
UBC855 ACA CAC ACA CAC ACA CYT 50. 8
UBC857 ACA CAC ACA CAC ACA CYG 46. 7
UBC862 AGC AGC AGC AGC AGC AGC 55. 5
UBC880 GGA GAG GAG AGG AGA 43. 3
s，引物在筛选后的最佳退火温度退火 45 s，72 ℃延
伸 2 min，共计 40 个循环，循环结束后在 72 ℃延伸
7 min。利用该体系，对 50 条 ISSR 引物进行筛选，
得到了 16 条反应条带清晰、多态性丰富的引物。
4 讨论
研究表明，ISSR-PCR 扩增结果很容易受到 Taq
酶、模板、引物、退火温度、循环次数等因素的影响。
但通过反应体系及反应程序的优化，可得到稳定、清
晰、重复性好的扩增结果。这与有关文献报道相
一致［5］。
Taq 酶在 PCR 反应过程中起着非常重要的作
用，用量过高，导致扩增条带弥散，非特异性条带增
加，且实验成本提高。用量过低，导致扩增量减少，
条带模糊。目前，一些大型生物试剂公司已经开发
出多种用于 PCR 反应的 Taq 酶，大大简化了操作步
骤，提高了实验效率。因此，在具体实验过程中要根
据自己的具体情况，选择 Taq 酶的类型，以达到理想
的实验结果。
在 ISSR-PCR 反应体系中有人认为，模板浓度
对 ISSR 反应不太敏感［6］，也有人发现 DNA 模板浓
度对扩增的稳定性有较大的影响［7］。作者在研究
中发现，DNA 模板浓度对蒲公英的 ISSR 反应结果
有较大影响，浓度过高时，扩增结果不理想，甚至没
有条带，可能是反应体系中 Taq 酶的活力不足，不能
催化浓度过高的模板。模板浓度过低时，模板与引
物结合几率降低，使扩增量减少。此外，扩增结果与
模板 DNA 的纯度也有较大关系，纯度较高时，模板
用量减少，且扩增结果良好;纯度较低时，其中所含
的蛋白质、多糖、多酚类等成分会干扰 ISSR-PCR 扩
增反应，使其变性不完全或与引物结合率降低，从而
导致实验结果不理想。因此，高纯度的模板是 PCR
反应的基础，不同的物种在 PCR 反应体系中模板的
用量也可能不同。
不同的引物在 PCR 反应过程中最佳退火温度
不一定相同。同一种引物在不同物种的 PCR 反应
中，退火温度也不尽相同。对同一物种，不是所有的
ISSR 引物都能扩增出理想的结果。因此，在试验中
有必要筛选出合适引物及其最佳退火温度。
PCR 反应程序的优化对扩增结果也有较大的
影响，在最佳反应体系的基础上，通过对反应程序的
优化，可以获得更理想的实验结果。本实验通过最
佳反应体系的建立及扩增程序的优化，建立了稳定、
可靠的蒲公英 ISSR-PCR 方法，为后续蒲公英遗传
多样性分析奠定了方法基础。
［参考文献］
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［责任编辑 邹晓翠］
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