全 文 ：入侵植物牛膝菊 ISSR- PCR 反应
体系的建立与优化
齐淑艳1，2，孔令群1，冯典兴1，2，杨彩霞1，2
(1.沈阳大学生命科学与工程学院，辽宁 沈阳 110044；
2.辽宁省城市有害生物治理与生态安全重点实验室，辽宁 沈阳 110044)
摘 要：通过 L16(45)正交试验，研究了 Mg2+、引物、dNTPs、Taq DNA 聚合酶、模板 DNA 浓度 5 个因素在 4 个水平
上对 ISSR-PCR 的影响，PCR结果应用 DPS数据处理软件分析，建立了适合于牛膝菊 ISSR-PCR 的反应体系。优化体
系 (25 μL) 为：Mg2+浓度 2.0 mmol/L，dNTP 浓度 0.5 mmol/L，Taq DNA 聚合酶浓度 0.08 U/μL， 引物浓度 0.2 μmol/L，
DNA浓度 1.5 ng/μL。 筛选出扩增稳定、多态性高、扩增条带清晰的 ISSR 引物 8条，并确定了 8条引物各自的最佳退
火温度。
关键词：牛膝菊； 正交设计； ISSR-PCR
中图分类号：S451 文献标识码：A 文章编号：1004-874X（2013）22－0150－06
Establishment and optimization of ISSR-PCR
reaction system of Galinsoga parviflora
QI Shu-yan1,2, KONG Ling-qun1, FENG Dian-xing1,2, YANG Cai-xia1,2
(1.College of Life Science and Engineering, Shenyang University, Shenyang 110044, China;
2.Liaoning Key Laboratory of Urban Integrated Pest Management and Eco-Security, Shenyang 110044, China)
Abstract: The effects of various factors on ISSR-PCR reaction, including concentration of Mg2+, dNTPs and primers,
DNA template and Taq DNA polymerase, were investigated to optimize the ISSR -PCR reaction system of Galinsoga
parviflora through orthogonal tests. The result of PCR was analyzed by software DPS, and the most suitable ISSR-PCR
system for G. parviflora was established, the 25 μL reaction system contained 2.0 mmol/L Mg2+, 0.5 mmol/L dNTPs, 0.08 U/
μL Taq DNA polymerase, 0.2 μmol/L primer, DNA template 1.5 ng/μL. Based on the above conditions, 8 primers with high
polymorphism, clear amplified bands and good repeatability were selected. The optimal annealing temperatures of 8 primers
were proposed by gradient PCR.
Key words: Galinsoga parviflora; orthogonal design; ISSR-PCR
牛膝菊 （Galinsoga parviflora） 为一年生草本菊科
（Compositae）植物，原产南美洲，是我国入侵杂草之一，
1915 年在我国云南省宁蒗和四川省木里发现 [1]，现分布
于全国各地。 牛膝菊 1964 年在辽宁省大连市星海公园
发现，为东北地区新记录种，目前在沈阳地区呈暴发式
生长态势[2]。 前人对牛膝菊种群分布和种群动态、危害
水平和控制技术、化学成分及化感作用、抗逆性及全球
气候变化等方面进行了广泛研究 [3-10]，但还未涉及关于
牛膝菊入侵后适应性进化的遗传学基础方面的研究。
而适应性进化的遗传学研究对于认识入侵种的适应性
机制具有重要意义[11-13]。
入侵种群的分子标记分析是外来入侵生物研究的
重要途径。 研究表明，作为多位点标记 ISSR 在物种和
种群遗传分化、 亲缘关系分析等研究方面的应用非常
有效，ISSR 分子标记技术已成为入侵生态学研究中强
有力的工具[14-15]。 ISSR 是基于 PCR 的一种分子标记技
术，但其扩增结果易受 Mg2+、引物、dNTPs、Taq DNA 聚
合酶、模板 DNA 等因素的影响。 为了获得稳定可靠的
试验结果，需要对这些因素进行优化，本研究通过 5 因
素 4 水平的正交试验，对上述各因子进行优化，以期建
立一个稳定、可靠的牛膝菊的 ISSR 反应体系，为牛膝
菊的分子鉴定和遗传多样性的分析奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
从沈阳大学校园草坪上采集自然生长的牛膝菊
（G. parviflora）叶片，将其置于装有变色硅胶的自封口
塑料袋中干燥，常温保存备用。
收稿日期：2013-07-02
基金项目：国家自然科学基金（31070466）
作者简介：齐淑艳（1963-），女，硕士，教授，Email：qshuyan@
sina.com
广东农业科学 2013年第 22期150
DOI:10.16768/j.issn.1004-874x.2013.22.024
M：DL2000；-：空白对照；1~16：正交试验中的 16 个处理组合
图 1 正交试验 PCR 产物电泳图
E(模板
DNA，ng/μL)
0.5
1.0
1.5
2.5
D（引物，
μmol/L）
0.1
0.2
0.3
0.4
C(Taq 酶，
U/μL)
0.06
0.08
0.10
0.12
B（dNTP，
mmol/L）
0.3
0.4
0.5
0.6
A（Mg2+，
mmol/L）
2.0
2.5
3.0
3.5
水平
1
2
3
4
表 1 ISSR-PCR 反应因素水平
因素
模板 DNA
(ng/μL)
0.5
1.0
1.5
2.5
2.5
1.5
1.0
0.5
1.0
0.5
2.5
1.5
1.5
2.5
0.5
1.0
引物
(μmol/L)
0.1
0.2
0.3
0.4
0.3
0.4
0.1
0.2
0.4
0.3
0.2
0.1
0.2
0.1
0.4
0.3
Taq 酶
(U/μL)
0.06
0.08
0.10
0.12
0.08
0.06
0.12
0.10
0.10
0.12
0.06
0.08
0.12
0.10
0.08
0.06
dNTP
(mmol/L)
0.3
0.4
0.5
0.6
0.3
0.4
0.5
0.6
0.3
0.4
0.5
0.6
0.3
0.4
0.5
0.6
Mg2+
(mmol/L)
2.0
2.0
2.0
2.0
2.5
2.5
2.5
2.5
3.0
3.0
3.0
3.0
3.5
3.5
3.5
3.5
处理
组合
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
表 2 ISSR-PCR 反应因素水平的 L16(45)正交试验设计
1.2 试验方法
1.2.1 总 DNA 提取 采用改良 CTAB 法从叶片中提
取牛膝菊基因组 DNA[16]。 经 UV-1800型紫外分光光度
计检测 DNA 浓度与纯度， 将浓度稀释至 50 μg/μL，保
存于-20℃冰箱中备用。
1.2.2 ISSR 原初扩增条件及 PCR 扩增程序 将初步
筛选出的引物 UBC848 （ISSR 引物参照加拿大哥伦比
亚大学 UBC 公司 2006 年公布的序列， 上海生工生物
工程技术服务有限公司合成） 作为本次正交试验的固
定引物。 原初扩增条件为 25 μL PCR 反应体系：1×Taq
酶缓冲液，所有反应均在 Agilent SureCycler 8800 梯度
PCR 仪中进行，退火温度为 55℃，扩增产物在 1%的琼
脂糖凝胶 (Genefinder 染色 )中电泳，电泳缓冲液为 1×
TBE, 以 DL2000（Takara）作为分子标记。 电泳凝胶用
BIORAD 凝胶成像分析系统进行拍照和分析。
1.2.3 ISSR-PCR 反应因素水平的确定与正交试验设
计 为确定 PCR 反应中 5 个因素 （Mg2+浓度、dNTP 浓
度、Taq DNA 聚合酶浓度、引物浓度、模板 DNA 浓度）
的最佳水平，采用 L16(45)正交设计，在 4 个水平上进行
优化试验， 不同水平浓度的设计参照周凌瑜等 [17]的
PCR因素水平，对个别因素的水平进行调整。本试验因
素水平见表 1，L16(45)设计方案见表 2。
1.2.4 引物筛选及退火温度梯度试验 本研究所用
ISSR 引物均购自上海生物工程技术服务有限公司，引
物序列参照加拿大哥伦比亚大学 UBC 公司公布的
ISSR 引物序列 UBC801~UBC899。 根据上述试验优化
的 ISSR-PCR 反应体系对 UBC801~UBC899 共 99 个引
物进行筛选， 每个引物选取测试报告上提供的退火温
度 为标准 ， 上下 各增加 2℃为范 围 ， 由 Agilent
SureCycler 8800 梯度 PCR 仪自动生成 12 个退火温度
进行扩增。 对扩增产物电泳检测，选择扩增条带清晰、
稳定、多态性高的引物。
2 结果与分析
2.1 正交试验的观察结果
牛膝菊 ISSR-PCR 正交试验根据表 2 设计的 16
个处理重复 3 次进行，PCR 反应后将得到的产物分别
进行电泳，结果如图 1所示。 观察图 1A 中处理组合 1、
3、7、9、13， 图 1B 中处理组合 7、8、9、13、15、16， 图 1C
中处理组合 8、9、11、15 的可识别条带较多， 且主带明
显。 综合以上观察结果判断， 处理组合 9 在牛膝菊
ISSR-PCR 扩增中稳定性效果较好，其反应体系为 Mg2+
3.0 mmol/L，dNTP 0.3 mmol/L，Taq 酶 0.10 U/μL， 引物
0.4 μmol/L，DNA 1.0 ng/μL。
2.2 正交试验的极差分析
根据图 1 中 16 个处理组合条带的数量丰富度、清
晰度从高到低分别赋值 16~1 分， 未见产物记为 0 分，
权重各占 0.5，然后将二者相加作为每个处理组合的综
合试验指标的最终得分，3次重复分别独立统计， 结果
见表 3 中的 yi1、yi2、yi3（i 表示正交试验设计的处理组合
编号）。
151
均值
8.3
6.7
9.3
5.3
4.0
5.3
11.3
13.7
14.3
5.7
4.3
9.7
12.3
2.3
8
7
yi3
3
7
8
7
4
5
6
16
15
14
11
12
13
0
10
0
yi2
7
5
4
9
8
6
16
15
14
3
2
10
11
1
13
12
yi1
15
8
16
0
0
5
12
10
14
0
0
7
13
6
11
9
E
1（0.5）
2（1.0）
3（1.5）
4（2.0）
4
3
2
1
2
1
4
3
3
4
1
2
9.75
10.00
9.17
4.00
6.00
E2
D
1（0.1）
2（0.2）
3（0.3）
4（0.4）
3
4
1
2
4
3
2
1
2
1
4
3
7.92
9.42
6.50
9.08
2.92
D2
C
1（0.06）
2（0.08）
3（0.10）
4（0.12）
2
1
4
3
3
4
1
2
4
3
2
1
6.25
8.08
9.92
8.67
3.67
C3
B
1（0.3）
2（0.4）
3（0.5）
4（0.6）
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
9.72
5.17
9.08
8.92
4.58
B1
A
1（2.0）
1
1
1
2（2.5）
2
2
2
3（3.0）
3
3
3
4（3.5）
4
4
4
7.58
8.58
8.50
8.25
1.00
A2
处理组合
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
Kj1均值
Kj2均值
Kj3均值
Kj4均值
极差 R
主次顺序
优水平
优组合
表 3 正交试验结果分析
EBCDA
A2B1C3D2E2
指标结果
在极差分析中， 求出同一因素不同水平下的均值
和同一因素不同水平间的极差 R 值。 极差 R 值反映了
每个因素对 PCR反应的影响程度， 值越大说明该因素
对试验结果影响越显著。 从表 3 极差计算结果可以看
出， 各因素对牛膝菊 ISSR-PCR 反应体系的影响从大
到小依次为 DNA、dNTP、Taq酶、引物、Mg2+。
根据 Kjm均值（j代表不同因素、m代表不同水平）的
大小可以判断第 j列因素的优水平和优组合。 若 Kjm相
等说明 j因素对试验指标无影响，Kjm不同说明 j 因素的
水平变动对试验指标有影响。本试验综合指标为清晰度
和条带的丰富度，数值越大越好，以此判断某因素的优
水平。 表 3 结果表明，Mg2+浓度的 Kjm大小为 KA2>KA3>
KA4>KA1，可以断定 KA2 的水平浓度（2.5 mmol/L）为 Mg2+
的优水平。 同理，dNTP的优水平为 KB1(0.3 mmol/L)，Taq
酶的优水平为 KC3 (0.10 U/μL)， 引物的优水平为 KD2(0.2
μmol/L)，DNA的优水平为 KE2(1.0 ng/μL)。 5个因素的优
水平组合A2B1C3D2E2为本试验的最优水平反应体系，
即牛膝菊 ISSR -PCR 反应体系为 Mg2 +2.5 mmol/L、
dNTP0.3 mmol/L、Taq 酶 0.10 U/μL、 引物 0.2 μmol/L、
DNA1.0 ng/μL。
2.3 正交试验的方差分析
因极差分析不能估计试验误差，无法确定分析的精
度。 为了准确判断各因素对牛膝菊 ISSR-PCR反应的影
响是否显著，进一步对试验结果进行了方差分析。由表 4
可知，各因素对牛膝菊 ISSR-PCR反应的影响从大到小
顺序为 DNA、dNTP、Taq酶、引物、Mg2+，这一结果与极差
分析的结果相同。 从方差分析的结果中还发现 Mg2+浓
度、dNTP浓度、Taq DNA聚合酶浓度、 引物浓度对试验
结果的影响并未达到显著水平，说明 Mg2+的浓度在 2.0~
3.5 mmol/L之间、dNTP浓度在 0.3~0.6 mmol/L之间、Taq
DNA 聚合酶浓度在 0.06~0.12 U/μL 之间、 引物浓度在
0.1~0.4 μmol/L之间对试验指标没有明显影响。 而 DNA
浓度对牛膝菊 ISSR-PCR反应的影响达到了显著水平。
2.4 各因素的不同水平对牛膝菊 ISSR-PCR 反应的
影响
方差分析结果表明 ，Mg2+浓度 、dNTP 浓度 、Taq
DNA聚合酶浓度、 引物浓度因素对试验指标的影响并
未达到显著水平。 但在本试验中同一因素的不同处理
间存在差异，因此需要对这些因子的浓度进行优化，选
取最佳组合。
Mg2+是 Taq DNA 聚合酶活性所必需的，对 PCR 扩
增的效率、特异性、退火温度都有影响[18]。而且 Mg2+可以
152
采集时间
2012-07-12
2012-07-14
2012-07-19
2012-07-23
2012-07-19
2012-07-31
2012-11-07
2012-08-15
2012-08-14
2012-08-13
海拔高度（m）
1891.4
2450.8
1071.2
1517.2
1700.0
168.7
41.6
236.8
171.7
250~300
生境
路旁
草坪
草坪
铁路边
草坪
荒地
草坪
路旁
草坪
花坛
采集地
云南昆明
云南丽江
贵州贵阳
甘肃兰州
甘肃嘉峪关
辽宁朝阳
辽宁沈阳
吉林长春
黑龙江哈尔滨
黑龙江五大连池
编号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
表 6 不同牛膝菊种群采集信息
均值
9.75aA
10.00aA
9.17aA
4.00bB
DNA 水平（ng/μL）
0.5
1.0
1.5
2.5
表 5 DNA 浓度各水平间差异显著性检验
注：同列数据后小写英文字母不同者表示差异显著，大写
英文字母不同者表示差异极显著。
P 值
0.9411
0.0598
0.2385
0.3598
0.0052
F 值
0.1308
2.7355
1.4803
1.1090
5.1370
均方
2.4653
51.5763
27.9097
20.9097
96.8542
18.8542
自由度
3
3
3
3
3
32
平方和
7.3958
154.7290
83.7290
62.7290
290.5620
603.3300
1202.4800
变异来源
Mg2+
dNTP
Taq 酶
引物
DNA
误差
总和
表 4 ISSR-PCR 正交试验各因素间的方差分析
与 dNTP、DNA 和引物形成复合物， 从而降低 Mg2+的有
效浓度，影响 PCR结果。 在结果类似的条件下，选用较
低的 Mg2+浓度可降低非特异性扩增。 本试验极差分析
中表明，Mg2+浓度为 2.5 mmol/L扩增效果最好， 但方差
分析结果表明 2.5 mmol/L 与其他水平差异不显著。 因
此，在本试验中 Mg2+浓度以 2.0 mmol/L 为宜。
dNTP 是 Taq DNA 聚合酶的底物，浓度过高，造成
延伸时核苷酸错误掺入，引起错配；浓度过低，影响扩
增效率， 且会因 dNTP 过早消耗使产物单链化， 降低
PCR 产物的产量。 本试验中极差分析结果表明，dNTP
浓度 0.3 mmol/L 的扩增效果最好， 但方差分析结果表
明 0.3 mmol/L 与其他水平差异不显著。 因此，在本试验
中 dNTP 浓度以 0.5 mmol/L 为宜。
Taq DNA 聚合酶是 PCR 反应中的关键因素，酶用
量过高不仅会增加成本，还会造成非特异性扩增；酶用
量过低则会降低产物合成效率。 Taq DNA 聚合酶还是
Mg2+的依赖性酶，对 Mg2+浓度非常敏感。 本试验中极差
分析可以看出，Taq DNA 聚合酶浓度为 0.10 U/μL 时，
牛膝菊 ISSR-PCR的结果最好。 但方差分析结果表明，
0.10 U/μL 与其他水平差异不显著。 因此，本试验选择
Taq DNA 聚合酶浓度 0.08 U/μL为宜。
引物质量和浓度是影响 PCR 结果的一个重要因
素，对 ISSR-PCR的带型和背景会产生明显的影响。 浓
度偏高会引起错配和非特异性扩增， 浓度太低则无法
进行有效扩增。 本试验中极差分析表明引物浓度为
0.2 μmol/L牛膝菊 ISSR-PCR的结果最好。但方差分析
结果表明，0.2 μmol/L与其他水平差异不显著。因此，在
本试验条件下，考虑到成本，牛膝菊 ISSR-PCR 反应体
系中最适宜的引物浓度为 0.2 μmol/L。
DNA 模板浓度过低致使扩增产物不稳定， 过高则
可能出现非特异性扩增[19]。 浓度对 PCR 反应体系的影
响，不同的试材获得的数据不尽相同[20-21]。 极差分析中
看出，DNA 浓度为 1.0 ng/μL 时， 牛膝菊 ISSR-PCR 的
结果最好。 方差分析结果表明，DNA 浓度为 1.0 ng/μL
时与其他水平差异显著。 多重比较结果 （表 5） 表明，
1.0 ng/μL与 0.5 ng/μL和 2.5 ng/μL差异不显著。因此，
在本试验条件下， 牛膝菊 ISSR-PCR 反应体系中的最
适宜 DNA 浓度为 1.0 ng/μL。
2.5 牛膝菊 ISSR-PCR优化体系的确定
综合以上分析， 牛膝菊 ISSR-PCR 最佳反应体系
为 A1B3C2D2E2， 即 Mg2+浓度 2.0 mmol/L、dNTP 浓度
0.5 mmol/L、Taq DNA 聚合酶浓度 0.08 U/μL、引物浓度
0.2 μmol/L、DNA 浓度 1.0 ng/μL。 为了验证该体系的效
果，我们应用该体系对不同地理来源的牛膝菊种群（表
6）进行扩增，结果见图 2，表明不同来源的牛膝菊种群
电泳主条带清晰度均较高。
2.6 不同引物筛选及其退火温度的确定
以牛膝菊 ISSR-PCR 最佳反应体系（Mg2+浓度以
2.0 mmol/L、dNTP 浓度 0.5 mmol/L、Taq DNA 聚合酶浓
度 0.08 U/μL、引物浓度为 0.2 μmol/L、DNA 浓度为 1.0
ng/μL），从 UBC 801~899 引物中筛选出 8 个条带清晰、
153
M：DL2000；-：空白对照；1~10：不同种群的牛膝菊
图 2 不同种群牛膝菊 PCR 电泳结果
M：DL2000；1~12：不同引物的退火温度
图 3 不同引物温度退火梯度电泳结果
12
54.0
54.0
56.0
56.0
55.0
56.0
55.0
56.0
11
53.9
53.9
55.9
55.9
54.9
55.9
54.9
55.9
10
53.4
53.4
55.6
55.6
54.4
55.6
54.4
55.6
9
53.0
53.0
55.2
55.2
54.0
55.2
54.0
55.2
8
52.5
52.5
54.9
54.9
53.5
54.9
53.5
54.9
7
52.2
52.2
54.7
54.7
53.2
54.7
53.2
54.7
6
51.8
51.8
54.3
54.3
52.8
54.3
52.8
54.3
5
51.4
51.4
54.1
54.1
52.4
54.1
52.4
54.1
4
51.0
51.0
53.8
53.8
52.0
53.8
52.0
53.8
3
50.5
50.5
53.4
53.4
51.5
53.4
51.5
53.4
2
50.2
50.2
53.1
53.1
51.2
53.1
51.2
53.1
1
50.1
50.1
53.1
53.1
51.1
53.1
51.1
53.1
引物编号
UBC816
UBC817
UBC818
UBC826
UBC846
UBC847
UBC855
UBC857
表 7 不同引物的退火温度 （℃）
泳 道
注：标有下划线的为引物最佳退火温度。
重复性强和扩增稳定的引物用于 PCR 扩增，并进一步
对其引物进行 12 个温度梯度的退火温度试验，具体退
火温度见表 7。 图 3 为不同引物的梯度退火 PCR 产物
的凝胶成像。从图 3可以看出，引物 UBC816 第 3、5、6、
9、10、12 泳道扩增结果相近，引物 UBC818 第 4、7 泳道
扩增结果相近，引物 UBC855 第 2、6、8、10 泳道扩增结
果相近，引物 UBC857 第 1、7泳道扩增结果相近。 在扩
增结果相近的条件下， 选择较高的退火温度作为最佳
退火温度，以提高反应的特异性[22]。
3 结论与讨论
ISSR-PCR 体系的建立与优化目前主要有正交优
化试验设计和单因素水平优化试验两种方法[22-26]。 利用
正交设计直观分析法能够迅速获得满意试验结果[22]。针
对各因素对牛膝菊 ISSR-PCR 影响程度未知， 本试验
利用正交试验考查各种因素及其交互作用。 从直观分
析和极差分析结果看，Mg2+浓度和引物浓度的水平不
同。 直观分析中 Mg2+浓度为 3.0 mmol/L、 引物浓度为
0.4 μmol/L，而极差分析中 Mg2+浓度为 2.5 mmol/L、引物
154
浓度为 0.2 μmol/L， 但方差分析表明，Mg2+浓度和引物
浓度各水平间差异不显著。 而其他 3 个因素的浓度水
平相同， 即 dNTP 为0.3 mmol/L、Taq 酶为 0.10 U/μL、
DNA 为 1.0 ng/μL。 本试验结果表明，可以用电泳直接
观察代替极差分析法使分析过程更简便， 但这不可避
免由于主观观察造成的试验误差。 在本试验中我们采
用直观分析、极差分析和方差分析法，根据每个因素的
作用特点对试验结果进行综合分析， 确定体系反应中
各影响因子的最佳组合，使分析结果更为科学和客观，
但这仍不可避免由于主观打分造成的试验误差。 通过
反应体系稳定性检测结果表明，用于牛膝菊 ISSR 分析
的最佳扩增体系 20 μL 中含有 1×Taq Buffer、Mg2+浓度
2.0 mmol/L、dNTP 浓度 0.5 mmol/L、Taq DNA 聚合酶浓
度 0.08 U/μL、 引物浓度 0.2 μmol/L、DNA 浓度 1.0
ng/μL。 本试验利用该体系对引物进行筛选和不同引物
最适退火温度的确定。
不同引物由于碱基构成不同， 反应程序中退火温
度对 ISSR 扩增谱带有一定影响 [27]，对相同材料不同引
物用同样的退火温度也可以扩增出稳定性、 多态性高
的产物[28]。 我们在确定不同引物退火温度的检测中发
现，8 个引物中有 6 个引物在 53.4℃的退火温度都能够
扩增出比较清晰稳定的条带 ，与缪恒彬等 [29]对菊属
ISSR反应体系的建立与优化结论相同。 本试验为不同
地理来源牛膝菊种群的遗传多样性及其分布和入侵路
线的分析奠定了基础。
参考文献：
[1] 李振宇 ,解焱 .中国外来入侵种 [M].北京 :中国林业出版社 ,
2002:166.
[2] 齐淑艳,徐文铎,文言.外来入侵植物牛膝菊种群构件生物量
结构[J].应用生态学报,2006,17(12):2283-2286.
[3] 齐淑艳 ,徐文铎 .辽宁外来入侵植物种类组成与分布特征的
研究[J].辽宁林业科技,2006(3):11-17.
[4] 何永福,陆得清,叶照春,等.50％乙草胺对旱地杂草辣子草防
除效果研究[J].植物保护,2007,33(4):132-134.
[5] 潘争红,赵檑,黄荣,等.牛膝菊中的萜类及甾醇类成分[J].云南
大学学报,2007,29(6):613-616.
[6] 郭振清,赵永光,张风娟,等.入侵植物牛膝菊对白菜、萝卜、生
菜、油菜子和幼苗的化感作用 [J].河北科技师范学院学报 ,
2008,22(3):13-16.
[7] 马丹炜,范雪涛,葛方兰,等.低温胁迫对辣子草水浸提液化感
作用的影响[J].热带亚热带植物学报,2008,16(6):526-530.
[8] 陈丽萍,范雪涛,马丹炜.入侵植物辣子草对油菜幼苗抗氧化
系统的化感效应[J].西南农业学报,2008,21(2):332-334.
[9] 范雪涛,马丹炜,向莎,等.不同逆境条件下辣子草抗氧化酶系
统的变化[J].应用与环境生物学报,2008,14(5):616-619.
[10] 齐淑艳 ,郭晓华 ,赵明 . CO2、O3 浓度升高对入侵植物牛膝菊
叶片形态特征的影响 [J].东北师大学报 (自然科学版 ),2009,
41(2):149-153.
[11] Hanlon P C, Peakall R, Briese D T. A Review of new
PCR -based genetic Markers and their utility to weed
ecology[J]. Weed Research, 2000,40:239-254.
[12] Bush R M. Predicting adaptive evolution[J]. Nat Rev Genet,
2001,17(8): 386-391.
[13] Reznick D N, Ghalambor C K. The population ecology of
contemporary adaptations what empirical studies reveal
abort the conditions that promote adaptive evolution [J].
Genetica, 2001, 112:183-198.
[14] Wang B R, LI W G, Wang J B. Genetic diversity of
Alternanthera philoxeroides in China [J]. Aquatic Botany,
2005,81:277-283.
[15] Li W G, Wang B R, Wang J B. Lack of genetic variation
of an invasive clonal plant Eichhornia crassipesin China
revealed by RAPD and ISSR markers [J]. Aquatic Botany,
2006,84:176-180.
[16] Clark M S.植物分子生物学实验手册[M].顾红雅 ,瞿礼嘉译 .
北京:高等教育出版社,1998:3-11.
[17] 周凌瑜,吴晨炜,唐东芹,等.利用正交设计优化小苍兰 ISSR-
PCR 反应体系[J].植物研究,2008,28(4):402-407.
[18] 欧文军 ,李开绵 ,王文泉 ,等 .小桐子基因组 DNA 的提取及
ISSR-PCR 反应体系的优化 [J].中国农学通报 ,2008,24(5):
409-413.
[19] 王桂娟,陈茂盛 ,向振勇 .小桐子 ISSR-PCR 体系的优化[J].生
物技术通报,2008(3):162-165.
[20] 潘坤,王文泉,吴翼,等.椰子 ISSR 体系优化[J].中国农学通报,
2009,25(4):24-29.
[21] 曾黎辉 ,洪自同 ,许家辉 ,等 .龙眼 ISSR 反应体系的建立和优
化[J].中国农学通报,2007,23(9):111-113.
[22] 陈亮明,相阳,张冬林,等.两种方法对广玉兰 ISSR-PCR 反应
体系的优化比较[J].种子,2008,27(6):10-14.
[23] 曹嵩晓,李娟玲,刘国民,等.利用单因子和正交设计双重实验
方法优化广藿香 ISSR-PCR 实验体系 [J].热带生物学报 ,
2011,2(1):35-40.
[24] 毕红园 ,王长彪 , 段永红 ,等 .采用正交设计法优化梨 SSR-
PCR 体系[J].生物技术通报,2013(5):111-115.
[25] 赵孟良 ,韩睿 .菊芋 ISSR-PCR 反应体系的建立与优化 [J].西
南农业学报,2012(1):243-246.
[26] 沈鹏 ,董丽 .大苞萱草 ISSR-PCR 反应体系的建立与优化 [J].
生物技术通报,2010(8):129-133.
[27] 冯富娟,王凤友 ,刘彤.红松 ISSR-PCR 试验系统影响因素[J].
植物学通报,2004,21(3):326-331.
[28] 王建波.ISSR 分子标记及其在植物遗传学中的应用[J].遗传 ,
2002,24(5):613-616.
[29] 缪恒彬 ,陈发棣 ,房伟民 .菊属 ISSR 反应体系的建立与优化
[J].江苏农业科学,2007(5):94-97.
（责任编辑 崔建勋）
155