全 文 ：书＊通讯作者，Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｉｎｓｘ３６９＠ｂｊｆｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
收稿日期：２０１６－０１－０７；修回日期：２０１６－０３－０８
基金项目：国家自然科学基金项目“空间诱变草地早熟禾矮化突
变体矮化机理研究”（３１３０２０１６）
作者简介：张兰（１９９０－ ），女，甘肃平凉人，研究方向为草坪草分
子生物学，在读硕士生，已发表论文１篇，Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｌａｎ２２１＠
１２６．ｃｏｍ．
ＤＯＩ：１０．１６７４２／ｊ．ｚｇｃｄｘｂ．２０１６－０４－０１
草地早熟禾叶绿素酶１基因ＰｐＣＨＬ１的克隆和表达分析
张　兰，滕　珂，尹淑霞＊
（北京林业大学草坪研究所，北京　１０００８３）
摘要：利用ＲＡＣＥ技术首次从草地早熟禾中克隆出叶绿素酶１基因（ＰｐＣＨＬ１）的全长ｃＤＮＡ序列，提交到Ｇｅｎ－
Ｂａｎｋ，登录号为ＫＵ１４５１２６；其开放阅读框为９５１ｂｐ，编码３６１个氨基酸，等电点６．１１，平均亲水指数０．０８４，属于疏水
性酸性蛋白。高级结构分析表明，其具有脂肪酶家族的保守域及水解酶特异的功能活性位点。利用实时荧光定量
ＰＣＲ分析其在草地早熟禾根、茎和叶及三种植物生长调节剂脱落酸（ＡＢＡ）、水杨酸（ＳＡ）和茉莉酸甲酯（ＭｅＪＡ）处理
后的表达情况，结果显示ＰｐＣＨＬ１基因在草地早熟禾不同组织的表达情况存在明显的组织差异性，叶中的表达量
最高且受ＡＢＡ、ＳＡ和 ＭｅＪＡ诱导。
关键词：草地早熟禾；叶绿素酶１；克隆；序列分析；表达分析
中图分类号：Ｓ６８８．４　　　文献标识码：Ａ　　　文章编号：１６７３－５０２１（２０１６）０４－０００１－０７
　　叶绿素是生物界最重要的色素之一，在一些低
等藻类、细菌和高等植物光合作用的能量捕获和传
递中起着重要作用［１］。对于正常生长发育的植物来
说，大多数叶绿素存在于叶蛋白复合体中，但它也是
四吡咯化合物之一，在植物细胞中过量或以自由形
式存在的叶绿素通过产生活性氧等有害物质对细胞
造成光氧化损伤，因此，植物细胞必须通过快速降解
体内过量或游离的叶绿素来避免细胞损伤和死
亡［２］。另外，植物在受到生物或非生物胁迫如低温、
强光、病虫害侵染等及在植物衰老过程中，均会发生
叶绿素的降解，从而出现一系列的生理反应，如叶片
褪绿、萎蔫、枯黄，提前结束生命周期等［３～４］。叶绿
素酶（ＣＨＬ）是叶绿素进行降解的第一个酶，也是植
物中研究最早的酶之一，广泛存在于高等植物、苔藓
和藻类中。大部分研究表明，叶绿素酶的Ｎ端都有
各自的转运肽，如柑橘（Ｃｉｔｒｕｓ　ｒｅｔｉｃｕｌａｔａ　Ｂａｎｃｏ．）叶
绿素酶具有典型的内质网导向转运肽［５］，但拟南芥
（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ　Ｌ．）却不具备这种转运
肽［６］。叶绿素酶的活性和表达量受多种因素影响，
细菌侵染拟南芥后其ＡｔＣＬＨ１的表达量快速增加，
利用ＲＮＡ干扰技术使ＡｔＣＬＨ１的表达沉默会影响
植物体内游离叶绿素的有效降解。ＡｔＣＬＨ１对植
物生长调节剂茉莉酸甲酯（ＭｅＪＡ）的诱导有明显反
应，在诱导初期其表达量明显增加，Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交
结果显示 ＡｔＣＬＨ１有诱导表达特性；但水杨酸
（ＳＡ）处理拟南芥后，ＡｔＣＬＨ１表达量在诱导初期无
明显变化，推测ＡｔＣＬＨ１的表达可能参与依赖于茉
莉酸的防御信号途径［７］；外源喷施乙烯能促进柑橘
叶绿素酶蛋白的从头合成［８］；用诱导叶绿素降解的
脱落酸（ＡＢＡ）处理蒌叶（Ｐｉｐｅｒ　ｂｅｔｌｅ　Ｌ．），处理初期
其叶绿素酶活性明显增加［９］。综上可知，在叶绿素
降解过程中叶绿素酶可能参与植物激素诱导途径。
草地早熟禾（Ｐｏａ　ｐｒａｔｅｎｓｉｓ　Ｌ．）是最重要的冷
季型草坪草之一，在我国北方地区应用广泛［１０］，但
有关草地早熟禾叶绿酶基因的克隆和表达分析鲜有
报道。本研究通过ＲＡＣＥ技术从草地早熟禾中克
隆叶绿素酶１基因，并进行生物信息学分析，利用
Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ技术研究其在草地早熟禾不同组织
和不同植物激素诱导下的表达特征，为初步探究叶
绿素酶１基因在草地早熟禾叶绿素降解代谢中的分
子调控机制及其功能奠定基础。
１　材料与方法
１．１　试验材料
１．１．１　植物材料
本研究所用植物材料是草地早熟禾的Ｂａｒｏｎ品
种（Ｐｏａ　ｐｒａｔｅｎｓｉｓ　Ｌ．ｖａｒ．Ｂａｒｏｎ），种植于温室，定
期修剪，每周浇灌１／２霍格兰营养液。
１．１．２　试剂
种植草地早熟禾所采用的基质为草炭、蛭石和
珍珠岩（１∶１∶１）混合基质。ＲＮＡ提取剂 Ｔｒｉｚｏｌ
—１—
第３８卷　第４期
Ｖｏｌ．３８　Ｎｏ．４
　　　　　　　　　
中　国　草　地　学　报
Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｒａｓｓｌａｎｄ
　　　　　　　　　
２０１６年７月
Ｊｕｌ．２０１６
购自 Ｉｎｉｔｒｏｇｅｎ，克隆载体 ｐＥＡＳＹ?－Ｔ１Ｓｉｍｐｌｅ、
ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ和大肠杆菌感受态Ｔｒａｎｓ１－Ｔ１Ｐｈａｇｅ
Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ购自北京全式金生物技术有限公司，ＰＣＲ
Ｍｉｘ、ＳＹＢＲ　Ｍｉｘ购自北京康为世纪生物技术有限
公司，ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ　ＲＴ　ｒｅａｇｅｎｔ　Ｋｉｔ、ＲＡＣＥ试剂盒购
自ＴａＫａＲａ公司，ＰＣＲ产物切胶回收试剂盒和纯化
试剂盒购自ＯＭＥＧＡ公司，三种外源喷施激素脱落
酸、茉莉酸甲酯和水杨酸购自ＳＩＧＭＡ公司。
１．２　基因全长ｃＤＮＡ的克隆
１．２．１　草地早熟禾ＲＮＡ的提取
选取健康生长的草地早熟禾，采用Ｔｒｉｚｏｌ法提
取叶片总 ＲＮＡ，通过１．０％琼脂糖凝胶电泳和
Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　ＮａｎｏＤｒｏｐ　２０００检测其完整性和
浓度，按照ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ　ＲＴ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｋｉｔ说明书合
成ｃＤＮＡ的第一条链。
１．２．２　全长ｃＤＮＡ克隆的获得
参照ＳＭＡＲＴ　ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ
操作说明书进行５′端和３′端的ＲＡＣＥ反应。以草
地早熟禾转录组测序得到的叶绿素酶１的ｃＤＮＡ
序列为模板，利用ＰｒｅｍｅＰｒｉｍｅｒ　５．０软件设计特异
性引物５′ＧＳＰ、３′ＧＳＰ－１和３′ＧＳＰ－２（表１）。其中，
基因的３′端先以３′ＧＳＰ－１／ＵＰＭ 为引物，３′－ＲＡＣＥ－
Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ为模板进行第１轮ＰＣＲ反应，反应条
件是 ９４℃１０ｍｉｎ；９５℃３０ｓ，５８℃３０ｓ（－０．１℃／循
环），７２℃３０ｓ，３０个循环；７２℃５ｍｉｎ，１２℃保温。可
能由于模板量太低，第一轮ＰＣＲ结果不太理想，因
此以第１轮ＰＣＲ产物为模板，３′ＧＳＰ－２／Ｎｅｓｔ为引
物进行第２轮巢式 ＰＣＲ 反应，反应条件是９４℃
１０ｍｉｎ；９５℃３０ｓ，６０℃３０ｓ，７２℃６０ｓ，３０个循环；７２℃
５ｍｉｎ，１２℃保温。５′ＲＡＣＥ以５′ＧＳＰ／ＵＰＭ 为引物
扩增，反应条件是９４℃１０ｍｉｎ；９５℃３０ｓ，６０℃３０ｓ，
７２℃６０ｓ，３０个循环；７２℃５ｍｉｎ，１２℃保温。
将所得的ＰＣＲ产物用１．０％琼脂糖凝胶电泳
检测，按照ＰＣＲ产物纯化试剂盒和切胶回收试剂盒
说明书分别纯化回收３′端和５′端的目的条带。将
回收产物连入ｐＥＡＳＹ?－Ｔ１Ｓｉｍｐｌｅ载体中转化大
肠杆菌，挑取阳性克隆测序，用ＤＮＡＭＡＮ软件和
ＮＣＢＩ　Ｂｌａｓｔ分析测序结果。
表１　试验中所用的引物及序列
Ｔａｂｌｅ　１　Ｐｒｉｍｅｒｓ　ａｎｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
引物名称
Ｎａｍｅ　ｏｆ　ｐｒｉｍｅｒｓ
序 列
Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
用　途
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ
３′ＧＳＰ－１
３′ＧＳＰ－２
ＣＣＡＡＧＧＴＣＧＣＡＧＡＣＴＧＧＣＴＣ
ＣＡＣＡＧＣＣＧＡＧＧＡＧＧＣＣＡＣＡＣ
扩增ＣＨＬ１的３′端
５′ＧＳＰ　 ＣＣＣＡＴＡＧＴＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＧＡＡＧＴＡＧ 扩增ＣＨＬ１的５′端
ＵＰＭ－Ｌ
ＵＰＭ－Ｓ
ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡ
ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ
ＲＡＣＥ通用引物
ＣＨＬ１－ＯＲＦ－Ｆ
ＣＨＬ１－ＯＲＦ－Ｒ
ＣＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＡ
ＡＧＴＴＴＴＡＴＡＴＣＡＧＣＡＧＧＧＣＡＣＡＧＣＡ
扩增ＣＨＬ１的全长
ｑＰＣＲ－Ｆ
ｑＰＣＲ－Ｒ
ＴＴＣＴＡＣＣＡＡＧＣＧＣＴＣＣＣＡＧＡ
ＧＧＣＡＡＣＧＣＡＣＣＴＣＣＴＣＡＴＣＣ
扩增部分片段，用于荧光定量
　　用ＤＮＡＭＡＮ软件将５′ＲＡＣＥ和３′ＲＡＣＥ序
列进行拼接，根据拼接后的全长ｃＤＮＡ设计引物对
ＣＨＬ１－ＯＲＦ－Ｆ／ＣＨＬ１－ＯＲＦ－Ｒ（表１），扩增其开放
阅读框，反应条件为９４℃１０ｍｉｎ；９５℃３０ｓ，６０℃３０ｓ，
７２℃６０ｓ，３０个循环；７２℃５ｍｉｎ；１２℃保温。
１．３　编码蛋白的生物信息学分析
基于草地早熟禾ＰｐＣＨＬ１的ＤＮＡ序列，通过
ＤＮＡ　ＭＡＮ　７．０软件对其序列进行分析，对编码的
氨基酸序列进行预测。将编码的氨基酸序列通过
ＮＣＢＩ网站Ｂｌａｓｔ功能，进行同源比对。对不同物种
中的同源蛋白通过 ＭＥＧＡ　５．０软件进行进化树分析。
通过ＰｒｏｔＰａｒａｍ（ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ／）
和ＰｒｏｔＳｃａｌｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔｓｃａｌｅ／）分析
推导蛋白质的等电点、分子量及亲疏水性。利用
Ｉ－ＴＡＳＳＥＲ网 站［１１～１２］预 测 蛋 白 质 的 三 级 结 构
（ｈｔｐ：／／ｚｈａｎｇｌａｂ．ｃｃｍｂ．ｍｅｄ．ｕｍｉｃｈ．ｅｄｕ／Ｉ－ＴＡＳＳＥＲ／），
并分析其作用位点。通过ＳｉｇｎａｌＰ　４．１Ｓｅｒｖｅｒ网站
（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／）预测
其信号肽。
１．４　基因的表达特性分析
１．４．１　组织表达分析
分别提取健康生长的草地早熟禾的根、茎和叶
的总 ＲＮＡ，设计荧光定量引物ｑＰＣＲ－Ｆ／ｑＰＣＲ－Ｒ
（表１），以 Ａｃｔｉｎ－Ｆ／Ａｃｔｉｎ－Ｒ作为内参，利用 ＢＩＯ－
—２—
中国草地学报　２０１６年　第３８卷　第４期
ＲＡＤ　ＣＦＸ　Ｃｏｎｎｅｃｔ　９６孔荧光定量仪，参照北京康
为世纪生物技术有限公司ＳＹＢＲ　Ｍｉｘ的操作说明
书进行荧光定量ＰＣＲ反应，每个样品３个生物学重
复，４个技术重复。ＰＣＲ反应体系为：ＳＹＢＲ　Ｍｉｘ
１０μｌ、ｃＤＮＡ　１μｌ、ｄｄＨ２Ｏ　７μｌ和上下游引物各１μｌ。
反应条件为９５℃１０ｍｉｎ；９５℃１０ｓ，６０℃３０ｓ，３０个循
环。
１．４．２　激素处理表达分析
对三盆长势一致的草地早熟禾分别喷施
１０μｍｏｌ／Ｌ　ＡＢＡ、１０μｍｏｌ／Ｌ　ＭｅＪＡ 和０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
ＳＡ溶液，取处理第０ｈ、１ｈ、３ｈ、６ｈ、１２ｈ和２４ｈ的草
地早熟禾叶片在液氮中速冻后放于－８０℃冰箱保
存。提取上述叶片总ＲＮＡ，反转录操作和荧光定量
具体操作如上述，采用２－ΔΔＣｔ法计算基因的相对表达
量。
１．５　数据分析
采用Ｅｘｃｅｌ　２０１０和ＳＰＳＳ　１８．０对荧光定量所
得数据进行统计分析，采用Ｏｒｉｇｉｎ９．０作图。
２　结果与分析
２．１　ＲＮＡ的提取和琼脂糖凝胶电泳检测
采用改良 Ｔｒｉｚｏｌ法提取草地早熟禾总 ＲＮＡ，
提取产物经分光光度计测定表明其 ＯＤ２６０／ＯＤ２８０值
处于１．８～２．１之间，经１％琼脂糖凝胶电泳检测显
示２８ｓ和１８ｓ条带较清晰［１３］，得到的总ＲＮＡ未发
生降解，无蛋白质等的污染（图１）。说明成功提取
了草地早熟禾总 ＲＮＡ，能够满足合成ｃＤＮＡ的要
求，可用于后续试验。
图１　草地早熟禾总ＲＮＡ
Ｆｉｇ．１　Ｔｈｅ　ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　ｏｆ　Ｐｏａ　ｐｒａｔｅｎｓｉｓ　ｌｅａｖｅｓ
２．２　基因全长序列的获得
以草地早熟禾转录组数据为基准，设计３′和５′
特异性引物，得到约７５０ｂｐ的特异性条带（图２－Ａ
和２－Ｂ）；５′和 ３′比对拼接后设计引物，得到约
１２００ｂｐ的特异性条带（图２－Ｃ）。综合测序分析表
明，该基因ｃＤＮＡ 全长１３９１ｂｐ，其开放阅读框为
９５１ｂｐ。本试验获得的草地早熟禾叶绿素酶１基因
命名为ＰｐＣＨＬ１，并提交到ＧｅｎＢａｎｋ中，登录号为
ＫＵ１４５１２６。
Ａ：ＰｐＣＨＬ１的３′端；Ｂ：ＰｐＣＨＬ１的５′端；Ｃ：ＰｐＣＨＬ１的全长
Ａ：Ｔｈｅ　３′ｒｅｇｉｏｎ　ｏｆ　ＰｐＣＨＬ１；Ｂ：Ｔｈｅ　５′ｒｅｇｉｏｎ　ｏｆ　ＰｐＣＨＬ１；
Ｃ：Ｔｈｅ　ｆｕｌ　ｌｅｎｇｔｈ　ｏｆ　ＰｐＣＨＬ１
图２　ＰｐＣＨＬ１基因的克隆
Ｆｉｇ．２　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　ＰｐＣＨＬ１
２．３　编码蛋白的生物信息学分析
ＰｐＣＨＬ１基因的氨基酸序列比对分析表明，其
与乌拉尔图小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ａｅｓｔｉｖｕｍ）、山羊草（Ａｅ－
ｇｉｌｏｐｓ　ｔａｕｓｃｈｉｉ）、野生大豆（Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｓｏｊａ）、蒺藜苜
蓿（Ｍｅｄｉｃａｇｏ　ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）和拟南芥的氨基酸序列均
有同源性，其中与乌拉尔图小麦的同源性最高，达
７４％；与蒺藜苜蓿的同源性最低，仅有４９％（图３）。
将草地早熟禾ＰｐＣＨＬ１基因编码的氨基酸序
列提交至 ＮＣＢＩ－ｐｒｏｔｅｉｎ　ｂｌａｓｔ在线分析软件，用
ＭＥＧＡ　５软件对不同物种的蛋白进行了聚类分析，
构建了系统进化树，如图４所示。结果表明，草地早
熟禾ＰｐＣＨＬ１与乌拉尔图小麦的亲缘关系最近。
信号肽预测结果表明，ＰｐＣＨＬ１基因编码的蛋白不
含信号肽。
ＥｘＰＡＳＹ　ＰｒｏｔＰａｒａｍ氨基酸系列分析表明，该
酶蛋白共编码３６１个氨基酸，分子量为３３．６６７８ｋＤ，
等电点（ＰＩ）为６．１１，为酸性蛋白。氨基酸组成中亮
氨酸 （Ｌｅｕ）最 多 （１２．３％），色 氨 酸 （Ｔｒｐ）最 少
（０．３％）；该蛋白中具有负电荷的氨基酸（Ａｓｐ＋
Ｇｌｕ）有３２个，具有正电荷的氨基酸（Ａｒｇ＋Ｌｙｓ）有
２７个；该蛋白的不稳定系数是３６．２３，属于稳定蛋
白；其平均亲水指数为０．０８４，为疏水性蛋白；脂肪
数（Ａｌｉｐｈａｔｉｃ　ｉｎｄｅｘ）为９３．８９。蛋白的保守结构域
—３—
张　兰　滕　珂　尹淑霞　　　草地早熟禾叶绿素酶１基因ＰｐＣＨＬ１的克隆和表达分析
Ｐ．ｐｒａｔｅｎｓｉｓ：草地早熟禾；Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍ：乌拉尔图小麦；Ａ．ｔａｕｓｃｈｉｉ：山羊草；Ｔ．ｕｒａｒｔｕ：小麦；Ｍ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ：蒺藜苜蓿；
Ａ．ｔｈｌｉａｎａ：拟南芥；Ａ．ｔａｕｓｃｈｉｉ：节节麦；图４同。Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ：表示相同的序列，在序列下方用小写字母表示
图３　草地早熟禾ＰｐＣＨＬ１氨基酸序列与其他植物ＣＨＬ蛋白氨基酸序列的比对分析
Ｆｉｇ．３　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｏｆ　ＰｐＣＨＬ１ａｍｉｏｎ　ａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｗｉｔｈ　ｏｔｈｅｒ　ｐｌａｎｔ　ＣＨＬ
图４　草地早熟禾与其他植物ＣＨＬ蛋白的系统进化树
Ｆｉｇ．４　Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒｅｅ　ｏｆ　Ｐｏａ　ｐｒａｔｅｎｓｉｓ　ｗｉｔｈ　ｏｔｈｅｒ　ｐｌａｎｔ　ＣＨＬｓ
分析表明，ＰｐＣＨＬ１基因编码的蛋白属于酯酶－脂
肪酶家族，包含α／β水解酶的结构域，具有水解酶的
特性（图５）。ＳＯＰＭＡ预测结果显示，该编码蛋白
的氨基酸序列的二级结构主要由无规则卷曲
（３７．０３％）、α螺旋（２９．７５％）、延伸链（２１．５２％）和
较少量的β转角（１１．７１％）组成（图６）。
图５　ＰｐＣＨＬ１的保守结构域分析
Ｆｉｇ．５　Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ　ｄｏｍａｉｎｓ　ｏｆ　ＰｐＣＨＬ１
—４—
中国草地学报　２０１６年　第３８卷　第４期
图６　ＰｐＣＨＬ１的二级结构预测
Ｆｉｇ．６　Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＰｐＣＨＬ１ｓｅｃｏｎｄａｒｙ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ
　　根据Ｉ－ＴＡＳＳＥＲ网站预测，该蛋白质的保守催化
位点可能位于组氨酸（２３７）和丝氨酸（１３８）处（图７），与
结构域预测结果相符。
图７　ＰｐＣＨＬ１的三级结构预测
Ｆｉｇ．７　Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＰｐＣＨＬ１ｔｅｒｔｉａｒｙ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ
２．４　表达特性分析
２．４．１　组织表达分析
取正常生长条件下草地早熟禾根、茎和叶分别
提取ＲＮＡ，反转录成ｃＤＮＡ，进行荧光定量ＰＣＲ反
应。结果表明，ＰｐＣＨＬ１基因在草地早熟禾根、茎、
叶中均有表达，且差异明显。该基因在叶中的表达
量最高，达３．０５；茎次之，为０．０４４；根中最少，为
０．０１１；叶中的表达量是根中的２６７．４７倍。
２．４．２　在不同激素处理下的表达分析
采用 Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ　ＰＣＲ 方 法 对 草 地 早 熟 禾
ＰｐＣＨＬ１基因在ＡＢＡ、ＭｅＪＡ和ＳＡ三种不同激素
处理下的表达情况进行分析，结果表明１０μｍｏｌ／Ｌ
ＡＢＡ对ＰｐＣＨＬ１的早期表达有促进作用（表２），
随着处理时间的延长，ＰｐＣＨＬ１的相对表达量呈先
增加后降低并最终趋于稳定的趋势。ＡＢＡ处理３ｈ
时，ＰｐＣＨＬ１的相对表达量达到顶峰，为对照（０ｈ）
的２．４７倍；其表达量在１２ｈ最低，为对照的０．７倍，
随后趋于稳定。１０μｍｏｌ／Ｌ　ＭｅＪＡ对ＰｐＣＨＬ１的表
达有类似的诱导作用（表２），处理１ｈ时表达量最
高，为对照的１．７１倍；ＰｐＣＨＬ１的表达量在３ｈ时
最低，为对照的０．４５倍；而后又逐渐升高并处于稳
定水平，维持在对照的０．９２倍左右。与 ＡＢＡ 和
ＭｅＪＡ相比，０．５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＳＡ对ＰｐＣＨＬ１表达量的
促进作用时间比较迟缓（表２），ＳＡ 处理３ｈ后，
ＰｐＣＨＬ１的相对表达量达到第一个峰值，为对照的
１．９８倍；而后随处理时间延长，其表达量下降；但在
处理２４ｈ，ＰｐＣＨＬ１的相对表达量再次达到峰值，
为对照的４．２２倍。
表２　ＰｐＣＨＬ１在ＡＢＡ、ＭｅＪＡ和ＳＡ处理下的相对表达量
Ｔａｂｌｅ　２　Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ＰＣＲ　ｏｆ　ＰｐＣＨＬ１ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｕｎｄｅｒ　ＡＢＡ，ＭｅＪＡ　ａｎｄ　ＳＡ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
激素处理
Ｈｏｒｍｏｎｅ
ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
不同处理时间（ｈ）
Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｔｉｍｅ（ｈ）
０　 １　 ３　 ６　 １２　 ２４
０．５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＳＡ　０．０１７３　０．０１９５　０．０３４３　０．０２９９　０．０１９１　０．０７２９
１０μｍｏｌ／Ｌ　ＭｅＪＡ　０．０３７５　０．０６４０　０．０１６８　０．０２５５　０．０３３８　０．０３４６
１０μｍｏｌ／Ｌ　ＡＢＡ　０．０３０１　０．０２４８　０．０７４３　０．０２４６　０．０２１１　０．０２３１
３　讨论
自从发现叶绿素酶之后，从多种植物如藜
（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ　ａｌｂｕｍ Ｌ．）［１４］、黑麦（Ｓｅｃａｌｅ　ｃｅｒｅａｌｅ
Ｌ．）［１５］、柑橘［１６］和橄榄（Ｃａｎａｖｉｕｍ　ａｌｂｕｍ Ｒ．）［１７］等
分离纯化出了叶绿素酶，并从该酶的分离和纯化方
法、酶学性质以及内外因子如植物激素、温度、金属
离子等对酶活性的影响方面进行了广泛的研究；在
分子水平上，从拟南芥［２］、花椰菜（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｏｌｅｒａ－
ｃｅａ）［１８］、发财树（Ｐａｃｈｉｒａ　ｍａｃｒｏｃａｒｐａ）［１９］、莱茵衣
藻（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ　ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）［２０］、藜［５］等植物
中克隆出了叶绿素酶基因，序列比对发现尽管它们
的Ｎ端氨基酸都不相同，同源性较低，但仍有一些
共同点，如均有以丝氨酸为活性中心的脂肪酶保守
区等。本研究利用ＲＡＣＥ技术成功克隆出了草地
早熟禾ＰｐＣＨＬ１基因，系统进化树分析表明该基
因与乌拉尔图小麦亲缘关系最近。氨基酸序列分析
显示，ＰｐＣＨＬ１基因编码的蛋白含有高度保守的脂
肪酶基序，具有以丝氨酸为活性中心的脂肪酶结构
域，这与水解酶的特性相符，属于酯酶－脂肪酶超家
族类，与藜叶绿素酶基因ＣａＣＬＨ 的研究结果一
—５—
张　兰　滕　珂　尹淑霞　　　草地早熟禾叶绿素酶１基因ＰｐＣＨＬ１的克隆和表达分析
致［５］。这种类型的酶都含有类似于“丝氨酸－组氨
酸－天冬氨酸”的催化三联体，以此形成与不同理化
性质底物结合的高效运转机制，用来适应外界多变
的环境条件，该结果与拟南芥叶绿素酶基因 Ａｔ－
ＣＬＨ１参与植物逆境胁迫响应并平衡防御途径的结
果相符［７］。
ＰｐＣＨＬ１在草地早熟禾叶中的表达量最高，茎
次之，根中表达量最少，这与叶绿素酶催化水解的底
物叶绿素主要存在于叶片中，其他组织中较少有关。
ＡＢＡ、ＭｅＪＡ和ＳＡ是参与植物生理调节信号途径
中的重要信号分子［２１］。例如，在环境胁迫如高温环
境中，植物体内ＡＢＡ含量迅速增加，能明显降低高
温对叶绿体结构的破坏，从而增加叶绿体的热稳定
性，同时 ＡＢＡ通过诱导某些酶的重新合成来提高
植物的抗性［２２］。ＭｅＪＡ参与叶绿体发育［２３］，外源喷
施 ＭｅＪＡ还能诱导拟南芥叶绿素酶基因ＡｔＣＬＨ１
表达量增加［５］，这可能与物理创伤和病原菌侵染能
激活植物体内 ＭｅＪＡ 信号途径有关［２４］。外源ＳＡ
处理高羊茅、玉米、水稻等植物均能产生局部抗性，
这可能与外源ＳＡ可以显著提高植物体内的相关酶
活性，诱导植物抗病性酶的活性，从而抑制病原致病
性酶活性有关［２５～２６］。荧光定量数据表明，草地早熟
禾ＰｐＣＨＬ１基因的表达水平受 ＡＢＡ和ＳＡ诱导，
并呈现出诱导初期表达骤升、随后下降最后呈现相
对稳定的趋势，二者具有相同的诱导趋势，这与拟南
芥ＡｔＣＬＨ１受ＳＡ诱导［７］和ＡＢＡ处理蒌叶其叶绿
素酶活性升高的结果相一致［８］。有研究表明，ＳＡ
和茉莉酸类物质二者之间存在相互抑制的拮抗作
用，本研究中ＰｐＣＨＬ１基因受ＳＡ 和 ＭｅＪＡ 诱导
后，其相对表达量正好相反，ＰｐＣＨＬ１在ＳＡ处理
后期表达量增加，推测ＰｐＣＨＬ１基因有可能参与
ＡＢＡ、ＭｅＪＡ和ＳＡ信号诱导途径且在诱导过程中
ＳＡ和 ＭｅＪＡ之间存在拮抗作用。
４　结论
本研究利用ＲＴ－ＰＣＲ和ＲＡＣＥ技术从草地早
熟禾中首次克隆得到了叶绿素酶基因ＰｐＣＨＬ１，其
开放阅读框为９５１ｂｐ，编码３６１个氨基酸，编码的蛋
白质具有典型的α／β水解酶结构域；提交该基因到
ＧｅｎＢａｎｋ中，登录号为ＫＵ１４５１２６。表达分析表明，
ＰｐＣＨＬ１基因在草地早熟禾叶中的表达量最高，并
响应ＡＢＡ、ＳＡ和 ＭｅＪＡ信号诱导途径。
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Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ｆｕｌ　ｌｅｎｇｔｈ　ｃＤＮＡ　ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌａｓｅ１（ＰｐＣＨＬ１）ｗａｓ　ｃｌｏｎｅｄ　ｆｒｏｍ　Ｐｏａ　ｐｒａｔｅｎｓｉｓ
ｔｈｒｏｕｇｈ　ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　ＲＡＣＥ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．Ｔｈｅ　ＰｐＣＨＬ１ｇｅｎｅ　ｗａｓ　ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ　ｔｏ　ＧｅｎＢａｎｋ　ａｎｄ　ｏｂｔａｉｎｅｄ
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（责任编辑　胡卉芳）
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张　兰　滕　珂　尹淑霞　　　草地早熟禾叶绿素酶１基因ＰｐＣＨＬ１的克隆和表达分析