全 文 ：大花紫玉盘素诱导肿瘤多药抗药性细胞凋亡及其机制
李艳芳1, 2 , 梁永钜 1 , 石　智 1 , 陈黎明 1 , 丁　岩1 , 符立梧 1*
(1. 中山大学 肿瘤防治中心 , 广东 广州 510060;2. 中山大学 附属第三医院 , 广东 广州 510630)
摘要:目的　比较研究番荔枝内酯大花紫玉盘素 (uva rig rin)诱导多药抗药性 KBv200细胞及其亲本 KB细胞凋
亡及其机制。 方法　以 MTT法进行细胞毒测定;用 Annexin V F ITC染色及流式细胞仪检测细胞凋亡。 活性氧
(ROS)测定以 DCFH-DA标记 , 细胞线粒体跨膜电位(ΔΧm)测定用 DiOC6标记 ,均以流式细胞仪检测。 C aspase-9激
活的测定用 W este rn b lo tting法。结果　大花紫玉盘素对 KBv200细胞及其亲本 KB细胞的生长均有明显的抑制作
用;大花紫玉盘素不仅能介导 KB细胞凋亡 ,而且也能介导 KBv200细胞凋亡;大花紫玉盘素作用于 KBv200细胞及其
亲本 KB细胞 12, 24和 48 h, 均引起 ROS升高以及 ΔΧm降低 , 而且呈时间依赖性。W estern b lo tting方法分析显示
Caspase-9被激活。结论　大花紫玉盘素可能通过线粒体通路诱导细胞凋亡。
关键词:大花紫玉盘素;线粒体跨膜电位;多药抗药性;细胞凋亡
中图分类号:R963;R979. 1　　　文献标识码:A　　　文章编号:0513 - 4870(2006)03 -0252 - 05
收稿日期:2005-06-14.
基金项目:国家自然科学基金资助项目 (30371659);广东省自
然科学基金资助项目(2003C30313).
*通讯作者　Tel:86 - 20 - 87343163, Fax:86 - 20 - 87343009,
E-m ai l:fu lw@ gzsum s. edu. cn
Induction of apoptosis of tumormultidrug resistance cell
by uvarigrin and itsmechan ism
LI Y an-fang1, 2 , LIANG Yong-ju1 , SH I Zh i1 , CHEN Li-m ing1 , D ING Yan1 , FU Li-wu1*
(1. Cancer Center, Sun Yat-Sen Un iversity, Guangzhou 510060 , China;
2. The Third Affilia ted Hospita l, Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510630 , Ch ina)
Abstract:Ami 　To study the effect o f uvarig rin on m itochondrial dependent pathw ay during the
apoptosis induced by it inMDR KBv200 ce lls and their parental sensitive KB ce lls. Methods　MTT assay
w as used to de tec t the cyto tox ic effect o f uvarigrin on KBv200 and KB cells. Annex in V FITC staining
iden tified uvarigrin-induced apoptosis in KBv200 and KB ce lls. These ce lls underw en t incubation w ith
DCFH-DA , o rD iOC6 , follow ed by flow cy tometry fo r the measuremen t o f reactive oxygen species (ROS)
and m itochondria lmembrane potential(ΔΧm ), respective ly. TheW estern b lo tting analy sis w as perfo rmed
on Caspase-9 activation. Results　Uvarigrin inh ib ited the grow th of KBv200 cells andKB cells in vitro.
M ost of the uvarigrin-induced ce lls death w as found to be due to apoptosis, as de te rm ined by Annex in V
FITC stain ing. During the apop to sis, the leve l o f ROS increased while the level of ΔΧm decreased in a
time-dependen tmanner. Uvarig rin triggered Caspase-9 activation. Conclusion Uvarig rin induced apop tosis
in KBv200 ce lls and KB ce lls probab ly th rough am itochondria-dependent pathw ay.
Key words:uvarig rin;m itochondrialmembrane potential;mu ltidrug resistance;apoptosis
　　番荔枝内酯 (annonaceous ace togenins, AA s)是
从番荔枝科植物中分离出来的一类具有广泛生物活
性的新型天然产物 ,是继紫杉醇后又一个有前途的 、
天然来源的抗肿瘤化合物 [ 1] 。 1982年 Jo lad等首先
从番荔枝科的紫玉盘属植物 Uvaria accum ina ta分离
出一种抗肿瘤活性很强的内酯 uvaricin,体外实验表
明其具有抗白血病的活性 ,到目前约有 400种番荔
枝内酯被报道 [ 2, 3] 。番荔枝内酯具有驱虫 、抗微生
物 、抗肿瘤细胞毒性 、抗寄生虫 、抗疟活性及抗肿瘤
多药耐药活性 [ 3 ～ 6] 。本研究选取的番荔枝内酯大花
紫玉盘素 (uvarigrin)为无色片状结晶 ,其相对分子
252 药学学报 Ac ta Pharm aceu tica S in ica 2006, 41(3):252 - 256
DOI牶牨牥牣牨牰牬牫牳牤j牣牥牭牨牫牠牬牳牱牥牣牪牥牥牰牣牥牫牣牥牨牫
质量为 608,分子式 C37H 68O6 ,分子结构见图 1。 Fu
等 [ 6]报道该化合物体外具有抗肿瘤作用 ,其作用机
制尚未见报道。本研究从线粒体凋亡通路中多个影
响凋亡的因素入手 ,揭示番荔枝内酯抗多药耐药肿
瘤作用的分子机制。
材料与方法
试剂 　MTT和 D iOC6均为 S igma公司产品 ,
RPM I 1640培养液及 DMEM 培养液为 G IBCO BRL
公司产品。 Annexin V FITC K it(Ca.t No 2375)购自
Immuno tech公司。 Caspase-9抗体购自 Santa生物有
限公司。流式细胞仪为 Becton Dickinson FACSCalibur。
细胞株　人喉癌细胞耐药株 KBv200及其亲本
细胞 KB均为中国医学科学院药物研究所提供 ,培
养在含 10%小牛血清的 RPM I 1640培养液内 ,置
37 ℃含 5% CO 2孵箱中培养 。KBv200细胞是以对
长春新碱(vincristine, VCR)敏感的 KB细胞为亲本 ,
通过诱变剂甲基磺酸乙酯刺激 ,然后在培养液中加
入浓度递增的 VCR诱导而得 ,较亲本 KB细胞对
VCR耐药约 100倍 , 且过度表达 P-糖蛋白 (P-
gp)[ 7, 8] 。KBv200细胞培养时加入 200 nmo l L -1
VCR维持耐药株的多药耐药性 ,实验前停药 1周 。
MTT法检测细胞毒作用　以对数生长期的 KB
细胞与 KBv200细胞每孔 0.19 mL分别接种于 96
孔板 ,细胞数为 0.4×104 /孔 ,细胞培养 24 h待细胞
贴壁后 ,分别加入 10μL不同浓度的药物 ,同时设空
白对照组 ,药物作用 72 h ,培养结束前 4 h加入
MTT,继续培养 4 h后 ,倾去培养液 ,加入 DMSO 0.1
mL,用酶联仪以 540 nm /655 nm双波长测定去除本
底光吸收值后的吸收度 (A)值 ,并以 B liss法计算
IC50值 , IC50 =(1 -样品的 A值 /对照组的 A值 ) ×
100%[ 7, 8] 。
Annexin V /PI双染色法检测细胞凋亡　收集
空白对照和经 10 μg mL -1大花紫玉盘素处理 12,
24和 48 h的培养细胞 ,离心收集 5×105个细胞 ,以
0.1mmo l L -1 PBS液 (pH 7.4)洗 2次 ,溶于结合
缓冲液 190 μL中 ,调整细胞数为 1×106 mL - 1。
加入 Annex in V FITC和 PI(使其终质量浓度为 1
μg mL - 1) 10 μL,混匀 ,避光室温孵育 10m in。用
结合缓冲液洗 1次 ,用流式细胞仪进行分析。每个
样品检测 10 000个细胞 [ 9] 。
活性氧(ROS)的测定　收集空白对照和经 10
μg mL - 1大花紫玉盘素处理 12, 24和 48 h的培养
细胞 ,离心收集 5 ×105个细胞 ,加入 5 μmo l L - 1
DCFH-DA 0.1 mL, 37 ℃孵育 30 m in。加入 PBS
1mL洗涤 2次。加入 PBS 1mL使细胞重新混悬 ,流
式细胞仪 (FCM)测定(FACScan, Bec ton D ickinson)。
DCFH-DA的激发波长为 488 nm ,发射波长为 530
nm
[ 9] 。
线粒体膜电位 (Χm)的测定　收集空白对照和
经 10μg mL- 1大花紫玉盘素处理 12, 24和 48 h的
培养细胞 ,离心收集 5×105个细胞 ,加入 40 nmo l
L
-1
D iOC6 0.1 mL, 37 ℃孵育 15 m in。加入 PBS 1
mL洗涤 2次 。加入 PBS 1 mL使细胞重新混悬 ,流
式细胞仪测定 (FACScan, Becton Dickinson)。 D iOC6
的激发波长为 488 nm ,发射波长为 525 nm[ 9] 。
Caspase-9被激活的检测 　用 W estern blotting
方法分析 [ 10] ,配制 12%的分离胶 ,加水封闭。待分
离胶凝固后加入积层胶 ,把已提取的蛋白加入 1∶1
的上样液 (SDS)放入 95 ℃以上的水中水浴 5m in。
待积层胶凝固后按相同蛋白量加入样本 ,经 150
g L -1聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白 ,电压为 100
V ,电泳 1.5 h,转印至硝酸纤维素 (NC)膜上。用含
50 g L -1脱脂奶粉及体积分数为 0.05%的 Tw een-
20的 TBST封闭 1 h,与抗 Caspase-9抗体反应过夜 ,
以 TBST洗膜 ,再与 HRP标记的二抗反应 1 h,发光
试剂盒发光压片检测。
统计学分析　实验数据以 –x ±s表示 ,显著性检
验采用 t检验 ,P <0.05为统计学差异有显著性 。
结果
1　大花紫玉盘素对耐药 KBv200细胞及其亲本 KB
F igure 1　Chem ica l structure of uvarig rin
253 李艳芳等:大花紫玉盘素诱导肿瘤多药抗药性细胞凋亡及其机制
细胞生长的影响
大花紫玉盘素不仅对 KB细胞具有较强的细胞
毒性 ,而且对 MDR细胞 KBv200也具有强的细胞毒
作用。其 IC50分别为 (0.86 ±0.03) μg mL -1和
(1.13±0.04) μg mL - 1。 KBv200细胞与 KB细胞
的 IC50值相近 ,差别无显著性 (P >0.05),显示大花
紫玉盘素也具有抗多药耐药肿瘤的作用(图 2)。
2　大花紫玉盘素诱导 KBv200细胞及 KB细胞凋
亡的作用
用 Annex in V FITC染色检测到加入药物作用
24和 48 h后 ,实验组的凋亡细胞明显比对照组多 。
大花紫玉盘素对 KBv200细胞和 KB细胞分别作用
24和 48 h后 ,细胞凋亡率分别为 (12.3±2.7)%,
(45.5±12.8)%和 (21.1±5.7)%, (63.2±18.7)%。
提示大花紫玉盘素不仅能时间依赖性地介导 KB细
胞凋亡 ,而且能介导 KBv200细胞凋亡(图 3和表 1)。
3　反应性氧类(ROS)的测定结果
用 DCFH-DA标记检测细胞活性氧在凋亡过程
中的变化 ,结果显示 10 μg mL -1大花紫玉盘素在
不同时间点均显著增加 KB细胞及 KBv200细胞的
ROS, 48 h的 ROS增加程度有所减少 ,但较未处理
组 ROS改变程度仍较明显 (图 4)。
F igure 2　Cy to toxicity of uvarig rin on KB cells and
KBv200 ce lls. n =3, –x ±s
Table 1　Summary o f the cell apoptosis induced by
uva rigrin (10μg mL -1) in KB ce lls and KBv200
ce lls(n =3, –x ±s)
G roup
Apop tosis rate /%
0 h 12 h 24 h 48 h
KB cel ls 7. 8±1.8 9. 1±1. 3 21. 1±5. 7 63. 2±18. 7
KBv200 cel ls 5. 6±0.8 10. 5±3. 6 12. 3±2. 7 45. 5±12. 8
4　ΔΧm的测定结果
用 D iOC6作为荧光探针测定线粒体跨膜电位
时 ,发现 10 μg mL - 1大花紫玉盘素处理细胞 ,能时
F igure 3　Ce ll apop tosis induced by uvarigrin (10 μg mL - 1) in KBv200 cells and KB cells
254 药学学报 Ac ta Pharm aceu tica S in ica 2006, 41(3):252 - 256
F igure 4　E ffec t o f uvarigrin (10 μg mL- 1) on ROS in KBv200 cells (A) and KB cells (B)
F igure 5　Time-dependent decrease o f m itochondrial membrane po tential induced by uva rigrin
(10 μg mL- 1) in KBv200 cells (A) and KB cells (B)
间依赖性地降低 KB细胞及 KBv200细胞线粒体跨
膜电位的水平(图 5)。
5　Caspase-9被激活的检测结果
以 10 μg mL- 1大花紫玉盘素分别处理耐药细
胞 KBv200细胞及其相应的敏感株 KB细胞 12及 24
h,结果显示大花紫玉盘素在 12及 24 h均能介导
KB细胞及 KBv200细胞 Caspase-9的裂解 , 表明
Caspase-9被激活(图 6)。
F igure 6　C leavage o f Caspase-9 w as show ed in KB
ce lls andKBv200 cells treated w ith uvarigrin (10μg
mL
-1)
讨论
本研究发现大花紫玉盘素对 MDR细胞 KBv200
作用的 IC50值与其亲本细胞 KB的 IC50值相近 ,且差
别无显著性 (P >0.05);显示大花紫玉盘素不仅对
敏感细胞具有生长抑制作用 ,而且对 MDR肿瘤同
样也具有显著的细胞毒作用。与已报道同类物
Bu llatacin等作用相似 [ 10 ～ 12] 。
Annexin V FITC /PI染色检测细胞凋亡是一种
特异性强且较敏感的凋亡检测方法。本研究以
Annexin V FITC /PI双染色法检测大花紫玉盘素处
理的 KBv200细胞和 KB细胞 24和 48 h后的细胞凋
亡 ,结果表明 ,大花紫玉盘素不仅能诱导 KB细胞凋
亡 ,而且也能诱导 KBv200细胞凋亡 ,且具有时间依
赖性 。本结果与 Yuan等 [ 13] 报道番荔枝内酯
annonacin诱导 T24细胞凋亡;Chiu等 [ 14] 报道另一
种番荔枝内酯 bullatacin诱导 2. 2. 15细胞凋亡等结
果相似。
番荔枝内酯化合物诱导细胞凋亡过程中 ROS
与线粒体膜电位的改变均未见报道。Wei和 Li
等[ 15, 16]证明当线粒体内 ROS大量产生 ,使其选择性
地使离子通透性丧失或线粒体膜通透性改变 ,导致
线粒体膜势能发生改变 ,进而引起线粒体释放细胞
色素 c及细胞凋亡起始因子 (apop tosis-initiating
factors, A IFs)或细 胞凋亡蛋 白酶激 活因子-1
(apoptotic pro tease activating factor-1, Apaf-1)等 ,这
样可以激活半胱氨酸蛋白酶 (Caspases),从而诱导
细胞凋亡的发生。本研究利用荧光探针 DCFH-DA
255 李艳芳等:大花紫玉盘素诱导肿瘤多药抗药性细胞凋亡及其机制
检测到 10μg mL -1大花紫玉盘素处理 KBv200细
胞和 KB细胞作用 12, 24和 48 h后 ROS明显增加 。
说明大花紫玉盘素诱导细胞凋亡的过程中 ROS的
改变起到了重要的作用。
ROS的改变可导致线粒体膜电位的改变 ,作者
用流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位水平 ,发现大
花紫玉盘素作用 12, 24和 48 h后荧光增强 。证实
大花紫玉盘素诱导细胞凋亡的过程中出现了线粒体
膜电位的减低。由此推测大花紫玉盘素可能是通过
线粒体通路诱导细胞凋亡发挥抗肿瘤作用的。
线粒体外膜的损伤可以导致细胞色素 c释放 ,
进而在 ATP的参与下 ,细胞色素 c结合并活化 Apa f-
1, 活化的 Apaf-1与 Caspase-9 前体结合 , 导致
Caspase-9的自身剪切和活化 。活化的 Caspase-9作
为始动 Caspase 进一 步诱导效应 Caspase (如
Caspase-3)的活化 。本研究发现大花紫玉盘素能介
导 KB细胞和 KBv200细胞的 Caspase-9的裂解激
活 。
综上所述 ,大花紫玉盘素不仅能介导 KB细胞
凋亡 ,而且也能介导 KBv200细胞凋亡 。其机制可
能与大花紫玉盘素介导 ROS升高 ,导致细胞线粒体
膜电位的降低有关 ,进而促进细胞色素 c及其他凋
亡活性物质释放 ,依次激活 Caspase-9和-3,导致细
胞凋亡 。
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