全 文 ：·药理与临床·
大黄素蒽醌衍生物介导 KB 及 KBv200 细胞氧化损伤的研究
丁　岩1, 梁永钜1, 陆　豫2, 陈黎明1, 李艳芳1, 古练权2, 符立梧1Ξ
(11 中山大学 肿瘤防治中心, 广东 广州　510060; 21 中山大学 有机合成教研室, 广东 广州　510275)
摘　要: 目的　研究以大黄素为母体结构, 人工半合成的 4 种蒽醌衍生物抑制 KB 和 KBv200 细胞增殖的作用机
制。方法　采用M T T 比色法测定细胞毒作用; 采用流式细胞仪检测分别用 DCFH 2DA 和 D iOC6荧光探针标记的
细胞内活性氧 (RO S) 和线粒体跨膜电位 (∃7 m )。结果　4 种蒽醌衍生物均能不同程度地抑制 KB 和 KBv200 细
胞的增殖, 表现为较强的体外抗肿瘤作用: 1, 82二 (二甲氨乙氨基) 232甲基262甲氧基蒽醌 (H 219) 对 KB 和 KBv200
细胞 IC50分别为 1137 和 1142 Λmo löL ; 12吡啶乙氨基232甲基26, 82二甲氧基蒽醌 (H 221) 的 IC50分别是 1310 和
1719 Λmo löL ; 12吡咯烷乙氨基232甲基26, 82二甲氧基蒽醌 (H 225) 的 IC50分别是 815 和 1117 Λmo löL ; 12羟丁氨基2
32甲基26, 82二甲氧基蒽醌 (H 228) 的 IC50分别是 716 和 816 Λmo löL , 且各药对敏感株 KB 和相应的多药耐药
(M DR ) 细胞 KBv200 的 IC50相近 (P > 0105)。用 4 种药物分别处理两种细胞 12、24、48 h, 12 h 即能引起 RO S 的
明显增加, 24 h 达到最大, 与 48 h 引起的 RO S 增加差异不显著; 各药均引起两种细胞 ∃7 m时间依赖性的降低, 48
h 时 ∃7 m降低达到最大。结论　4 种大黄素蒽醌衍生物可能通过诱导细胞内 RO S 的增加, 使得 ∃7 m降低, 从而抑
制 KB 和 KBv200 细胞的生长, 且对M DR 细胞无抗药性, 具有开发前景。
关键词: 蒽醌衍生物; 活性氧; 线粒体跨膜电位; 抗肿瘤
中图分类号: R 286191　　　文献标识码: A 　　　文章编号: 0253 2670 (2004) 11 1259 04
Ox ida tive damage of paren ta l drug- sen sit ive KB cells and m ultidrug resistan t
KBv200 cells m ed ia ted by an thraqu inone der iva tives
D IN G Yan1, L IAN G Yong2ju1, LU Yu2, CH EN L i2m ing1, L I Yan2fang1, GU L ian2quan2, FU L i2w u1
(11 Cancer Cen ter, Sun Yat2sen U niversity, Guangzhou 510060, Ch ina; 2. D epartm ent of O rgan ic
Chem istry, Sun Yat2sen U niversity, Guangzhou 510275, Ch ina)
Abstract: Object　To study the inh ib ito ry m echan ism of fou r an th raqu inone derivat ives, w h ich w ere
ob ta ined from modifying the st ructu re of emodin, on p ro lifera t ion of paren ta l drug2sen sit ive KB cells and
m u lt idrug resistan t (M DR ) KBv200 cells. M ethods　Cyto tox icity w as determ ined by tet razo lium (M T T )
assay. R eact ive oxygen species (RO S) levels and m itochondria l m em b rane po ten t ia l (∃7 m ) in cells respec2
t ively labelled by DCFH 2DA and D iOC6 w ere assayed by flow cytom etry. Results　A ll fou r an th raqu inone
derivat ives supp ressed p ro lifera t ion of KB and KBv200 cells, show ed po ten t cyto tox icity, the m ean IC 50 of
H 219 (1, 82dim ethylam inethylam ine232m ethyl262m ethoxy2an th raqu inone) to KB and KBv200 cells w as 1.
37 and 1. 42 Λmo löL , respect ively. IC 50 of H 221 ( 12pyridylethylam ine232m ethyl26, 82dim ethoxy2an2
th raqu inone) w as 13. 0 and 17. 9 Λmo löL , IC 50 of H 225 (12pyrro lylethylam ine232m ethyl26, 82dim ethoxy2an2
th raqu inone) w as 8. 5 and 11. 7 Λmo löL , IC 50 of H 228 (12hydroxybu tylam ine232m ethyl26, 82dim ethoxy2an2
th raqu inone) w as 7. 6 and 8. 6 Λmo löL. T he IC 50 of them to M DR KBv200 cells w as sim ilar to that of them
to the paren ta l drug2sen sit ive KB cells (P > 0105). T he genera t ion of RO S increased obviou sly after the
cells w ere incubated w ith them fo r 12 h, and the increase of RO S reached the peak trea ted fo r 24 h. T he
levels of ∃7 m w ere t im e2dependen t ly decreased after t rea t ing w ith fou r compounds fo r 12, 24, and 48 h.
Conclusion　T he grou th of bo th M DR KBv200 cells and paren ta l drug2sen sit ive KB cells w ere inh ib ited to
the trea tm en t of fou r an th raqu inone derivat ive in v itro. T he m echan ism of their effects is associa ted w ith
the increase of the cellu lar RO S level and the decrease of ∃7 m.
Key words: an th raqu inone derivat ives; react ive oxygen species (RO S ) ; m itochondria l m em b rane
po ten t ia l (∃7 m ) ; an t itumo r
·9521·中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 11 期 2004 年 11 月
收稿日期: 2004202213
作者简介: 丁　岩 (1976—) , 女 (回族) , 新疆人, 博士, 中山大学肿瘤防治中心抗癌药物室助理研究员, 主要从事抗肿瘤药物及多药耐药
机制的研究。T el: (020) 87343164　E2m ail: yanding66@ho tm ail. com　rubydy@yahoo. com3 通讯作者　T el: (020) 87343163　E2m ail: Fu lw @gzsum s. edu. cn
　　目前化学治疗仍是重要的肿瘤治疗手段之一,
许多化疗药物如 52氟脲嘧啶 (52Fu)、阿霉素、顺铂、
长春新碱等是通过诱导细胞内活性氧 (RO S) 的产
生, 引起细胞凋亡的途径来杀死肿瘤细胞, 但它们引
起的不良反应及多药耐药作用 (m u lt i2drug resis2
tance, M DR ) 限制了其临床应用[1 ]。我国植物资源
丰富, 从中药中寻找新的不良反应少、疗效好的化疗
药物成为临床和基础研究中十分重要的课题。大黄
素 (emodin, EM O ) 为蒽醌类衍生物, 是中药大黄
的主要有效单体, 具有多种药理作用, 如抗菌、抗病
毒等, 也有抑制肿瘤生长或促进肿瘤细胞凋亡的作
用[2 ] , 但由于其抗癌活性不够高, 难应用于临床。初
步研究发现以大黄素为先导化合物人工半合成的 4
种蒽醌衍生物均不同程度抑制人口腔鳞癌细胞 KB
及其多药耐药株 KBv200 的增殖, 具有一定的体外
抗肿瘤作用, 本研究拟从线粒体依赖性凋亡通路探
讨其可能的作用机制。
1　材料与方法
111　药品: 本实验所用的 4 种单体物质是对天然药
材虎杖中分离获得的大黄素 (1, 6, 82三羟基232甲基
蒽醌)进行相应的结构改造而合成, 分别为 H 219[ 1,
82二 (二甲氨乙氨基) 232甲基262甲氧基蒽醌 ]、H 221
( 12吡啶乙氨基232甲基26, 82二甲氧基蒽醌)、H 225
(12吡咯烷乙氨基232甲基26, 82二甲氧基蒽醌)、H 2
28 (12羟丁氨基232甲基26, 82二甲氧基蒽醌) (纯度
均> 98% ) ; 溶于DM SO 配成 100 mmo löL 的母液,
临用前注射用水稀释至所需浓度。它们的化学结构
见图 1。
图 1　大黄素蒽醌衍生物的化学结构
F ig. 1　Structure of an thraquinone der ivatives of emodin
112　试剂: 噻唑蓝 (M T T )、D iOC 6购于 Sigm a 公
司; R PM I1640 培养基购于 Gibco 公司; 2, 72D ich lo2
rofluo rescein diaceta te (DCFH 2DA ) 分子探针购于
Egene, OR 公司。
113　细胞培养: KB 细胞和 KBv200 细胞培养在含
10% 小牛血清的 R PM I1640 培养液内, 置 37 ℃、
5% CO 2温箱中培养。KBv200 细胞是用对长春新碱
(V CR ) 敏感的 KB 细胞为亲本, 通过诱变剂甲基磺
酸乙酯刺激, 然后在培养液中加入浓度递增的V CR
诱导而得, 在 V CR 浓度为 200 nmo löL 时生长良
好, 较 KB 细胞对V CR 耐药约 100 倍, 其耐药机制
主要与 P2gp 过度表达有关[3 ]。两细胞均为中国医学
科学院中国协和医科大学药物研究所提供。
114　细胞毒的测定: 本实验以M T T 法[4 ]进行。细
胞以 8×103ömL 接种于 96 孔板上, 每孔总体积为
190 ΛL , 培养 24 h 后, 分别加入 10 ΛL 不同浓度的
4 种化合物, 同时设立生理盐水对照组, 药物作用
72 h, 结束前 4 h 加入M T T 溶液, 继续培养 4 h
后, 倾去培养液, 加入二甲基亚砜, 待完全溶解显色
后, 用酶联仪以 540 nm ö650 nm 双波长测定吸光度
(A ) 值, 计算细胞存活率。以B liss 法分别计算各化
合物抑制细胞生长达 50% 时药物浓度, 即 IC 50值。
细胞存活率= 实验组 A 值ö对照组 A 值×100%
115　细胞内 RO S 检测: DCFH 2DA 可被细胞内
RO S 氧化为发荧光的DCF, 故 DCF 的强度即代表
细胞内 RO S 水平。将各种药物分别与两种细胞共
同培养 12、24、48 h 后, 收集细胞, 加入 DCFH 2DA
10 Λmo löL , 37 ℃ 孵育 15 m in 后, 冰 PBS 漂洗、重
悬后避光置于冰上待检, 用流式细胞仪 (FA CScan;
Becton D ick in son) 检测细胞荧光强度[5 ]。
116　线粒体跨膜电位 (∃7 m ) 检测: 3, 3′2碘化二己
基羰花箐 (D iOC 6) 是一种亲脂性荧光染料, 可借助
线粒体的负膜电位进入线粒体并集中在其骨架中,
因此可用于测定 ∃7 m。取阴性对照和分别为 2、15、
10、10 Λmo löL 的 H 219、H 221、H 225、H 228 与两种细
胞共同孵育不同时间的细胞培养液, 离心收集 5×
105细胞, 加入 40 nmo löL D iOC 6 0. 1 mL , 37 ℃ 孵
育 15 m in。加入 1 mL PBS 洗涤 2 次。最后加入
1 mL PBS 使细胞重新混悬, 流式细胞仪检测[6 ]。
D iOC 6的激发波长为 488 nm , 发射波长为 525 nm。
117　统计学方法: 样本均数间比较采用方差分析方
法, 组间比较采用 L SD 法, 统计学处理均使用
SPSS 软件 (1010) 进行分析。
2　结果
211　对 KB 和 KBv200 细胞生长的影响: 结果表明
4 种化合物对 KB 和 KBv200 细胞生长均有较强的
抑制作用, 且每种化合物分别对 KB 和 KBv200 细
胞的 IC 50进行比较差异均无显著性 (P > 0105) , 表
明M DR 细胞株对这 4 种大黄素蒽醌衍生物均无抗
·0621· 中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 11 期 2004 年 11 月
药性, 即这 4 种大黄素蒽醌衍生物具有抗M DR 肿
瘤细胞的作用。4 种化合物的 IC 50值见表 1。
表 1　4 种大黄素蒽醌衍生物对 KB 和 KBv200
的细胞毒作用 (x±s, n= 4)
Table 1　Cytotox ic ity of four an thraquinone der ivatives of
emodin on KB and KBv200 cells (x±s, n= 4)
组别
IC50ö(Λmo l·L - 1)
KB 细胞 KBv200 细胞
H 219 114±015 114±015
H 221 1310±215 1719±711
H 225 815±112 1117±219
H 228 716±311 816±314
212　对 KB 和 KBv200 细胞内 RO S 的影响: 结果
见表 2。经不同浓度大黄素蒽醌衍生物 (H 219、H 221、
H 225、H 228 浓度分别为 2、15、10、10 Λmo löL ) 处理
KB 和 KBv200 细胞 12 h, 即出现 RO S 明显增加,
表现为平均荧光强度增加, 峰值右移。其中 H 219 表
现最为明显, 峰值出现有意义的向右移动 (图略) , 24
h 后达最大, 至 48 h 几乎不再增加, 甚至个别出现微
弱左移。每种药物分别对 KB 和 KBv200 细胞 RO S
的影响基本一致, 差异无显著性。
213 　对 KB 和 KBv200 细胞 ∃7 m 的影响: 用
D iOC 6作为荧光探针测定 ∃7 m时, 发现 4 种药物均
能不同程度地降低 ∃7 m 的水平, 表现为峰值右移
(图略) , 平均荧光强度增加, 见表 3。而且随着时间
的延长变异逐渐明显。作用于细胞株 12、24 h 后∃7 m有所改变, 但变化不很明显, 作用 48 h 后 ∃7 m
明显降低, 峰值明显右移, 其中 H 219 作用后引起两
种细胞 ∃7 m的变化最明显, 并且每种药物分别对两
种细胞 ∃7 m的影响差异也无显著性。
表 2　4 种大黄素蒽醌衍生物对 KB 和 KBv200 细胞内 ROS 的影响 (x±s, n= 3)
Table 2　Effects of four an thraquinone der ivatives of emodin on ROS level in KB and KBv200 cells (x±s, n= 3)
组别
浓度ö(Λmo l·L - 1) KB 细胞平均荧光强度 (F I )0 h (对照) 12 h 24 h 48 h KBv200 细胞平均荧光强度 (F I )0 h (对照) 12 h 24 h 48 h
H 219 2 518±213 1415±3133 2418±6123 3 2219±5173 3 414±112 1117±2183 2115±4113 3 1911±6103 3
H 221 15 614±111 916±5183 1412±3193 1516±4143 513±113 817±2173 1215±4163 1313±4113
H 225 10 617±214 1111±3113 1711±5113 1616±4173 519±211 1012±2193 1513±4173 1417±3183
H 228 10 518±113 1217±3153 1917±4153 1711±4133 511±111 1016±3133 1713±5113 1612±5143
　　　与同种细胞 0h (对照) 比较: 3 P < 0105　3 3 P < 0101
　　　3 P < 0105　3 3 P < 0101 vs sam e k ind of cells fo r 0 h (con tro l)
表 3　4 种大黄素蒽醌衍生物对 KB 和 KBv200 细胞 ∃7 m 的影响 (x±s, n= 3)
Table 3　Effects of four an thraquinone der ivatives of emodin on ∃7 m in KB and KBv200 cells (x±s, n= 3)
组别
浓度ö(Λmo l·L - 1) KB 细胞平均荧光强度 (F I )0 h (对照) 12 h 24 h 48 h KBv200 细胞平均荧光强度 (F I )0 h (对照) 12 h 24 h 48 h
H 219 2 1317±311 1514±318 1711±4133 2418±6173 3 1115±212 1313±316 1518±3183 2111±5163 3
H 221 15 1512±412 1617±419 1712±613 1913±6113 1313±319 1413±412 1616±510 1911±5173
H 225 10 1218±413 1411±618 1617±5123 2011±7113 1317±316 1416±419 1513±6103 1917±6153
H 228 10 1511±319 1517±415 1717±612 2113±6183 1418±415 1416±511 1713±711 2012±5143
　　　与同种细胞 0 h (对照) 比较: 3 P < 0105　3 3 P < 0101
　　　3 P < 0105　3 3 P < 0101 vs sam e k ind of cells fo r 0 h (con tro l)
3　讨论
　　大黄素是一种蒽醌类物质, 主要存在于蓼科植
物如大黄、虎杖的根茎中, 具有多种生物活性, 可以
抑制病毒复制、炎症反应, 可以抑制多种肿瘤细胞的
增殖, 如 HL 260 细胞、K562 细胞、H ela 细胞, 抑制
蛋白激酶 C、c2src、p 56lck和 H ER 22 蛋白酪氨酸激酶
等的活性[7 ] , 促进内质网 Ca2+ 释放入细胞浆[8 ]。但
是, 大黄素由于抗癌活性不高且具有心脏毒性等副
作用而限制了其临床应用。因此, 在其蒽醌母核的基
础上进行相应的结构改造, 以期找到疗效更强且毒
性更低的大黄蒽醌类衍生物。本实验所采用的 4 种
大黄素蒽醌衍生物即是对大黄素进行了相应结构改
造而合成的, 前期研究已证实它们具有较大黄素更
强的抑瘤活性, 因此有必要对它们的体内外抗肿瘤
活性及作用机制进行深入探讨。本实验结果表明它
们能不同程度地抑制 KB 和 KBv200 细胞的增殖,
均显示较强的体外抗肿瘤作用, 其中 H 219 >
H 228> H 225、H 221, 并且它们各自对两种细胞生长
抑制的 IC 50值都很接近 (P > 0105) , 显示它们对敏
感株和耐药株的作用差别不大, 即表明它们对
M DR 肿瘤细胞仍然有效; 结合构效关系分析认为
它们的抗癌活性与其母体结构中 1、6、8 位引入的基
团有关, 并且 6 位甲氧基取代大黄素 6 位的羟基可
能是它们抑瘤作用强于大黄素的条件之一, 其次 1、
·1621·中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 11 期 2004 年 11 月
8 位被脂肪氨基对称地取代, 显示细胞毒作用最强,
抗癌活性明显提高, 至于它们抗M DR 肿瘤细胞作
用是否也与它们的这种结构有关还有待继续研究。
RO S 是指氧的某些代谢产物和一些反应的含
氧产物。生理状态下, 机体产生的自由基与抗氧化防
御系统处于相对平衡。在各种病理因子作用下, 机体
产生大量自由基, 或机体抗氧化防御系统受到破坏,
造成细胞结构和功能的破坏。本实验结果表明 4 种
药物分别与两种细胞共同培养 12、24、48 h, 12 h 即
能引起细胞内 RO S 明显增加, 24 h 时细胞内 RO S
的增加达到最大, 曲线明显右移, 48 h 细胞内 RO S
不再显著性增加, 甚至个别出现曲线微弱左移 (图
略)。同时, 用D iOC 6检测到 4 种药物分别作用两种
细胞 12、24 h 后, 线粒体跨膜电位 (∃7 m ) 稍有降
低, 至 48 h 后出现 ∃7 m 明显降低, 这与Co rtassa [9 ]
等的实验结果相吻合, 表明 RO S 的增加可直接或
间接损伤线粒体膜, 造成膜电位下降, 一些学者的研
究结果也支持这一结论[9, 10 ]。
研究发现 RO S 可能作为信号分子介导了细胞
对促凋亡信号的反应。因此, 推测这 4 种大黄素蒽醌
衍生物抑制 KB 和 KBv200 细胞的增殖, 可能与其
通过线粒体途径诱导细胞凋亡有关。因为它们均能
增加细胞内 RO S, 当 RO S 增加到一定程度, 即引起
细胞脂质过氧化, 从而干扰细胞线粒体的功能使得
线粒体M PT P 开放, 不仅导致跨膜电位崩溃, 也使
细胞色素 C 外漏, 最终启动 Caspase 的级联活化从
而引起细胞凋亡, 这就是所谓的线粒体依赖性凋亡
通路。这 4 种大黄素蒽醌衍生物是否通过该通路发
挥抗肿瘤作用, 相关的研究正在进行中。此外, 它们
是在大黄素母核结构基础上经过不同基团修饰合成
的, 它们对M DR 细胞无抗药性, 因此对它们构效关
系及作用机制关系的进一步研究, 有可能为开发较
大黄素作用更强的抗M DR 肿瘤的药物提供线索。
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ZH EN G W ei2fa1, W AN G L i2, SH I Feng1Ξ
(1. Key L abo rato ry fo r B io techno logy on M edicinal P lan ts of J iangsu P rovince, Xuzhou N o rm al U niversity, Xuzhou
221116, Ch ina; 2. Schoo l of L ife Science, Yangzhou U niversity, Yangzhou 225009, Ch ina)
　　Abstract: Object　To elucidate the an t i2inf lamm ato ry act ivity of the ethano l ex tracts from roo ts of
·2621· 中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 11 期 2004 年 11 月
Ξ 收稿日期: 2004202206
基金项目: 教育部科学技术研究重点项目 (03049) ; 江苏省教育厅自然科学基金重点项目 (02KJA 360002) ; 江苏省药用植物生物技术
重点实验室开放基金 (KJS02114)
作者简介: 郑维发 (1962—) , 男, 安徽南陵人, 理学博士, 教授, 研究方向为天然产物化学及其药理毒理学。
T elöFax: (0516) 3403179　E2m ail: yyzw @xznu. edu. cn