全 文 ：线粒体膜电位在三氧化二砷诱导 K562 细胞凋亡中的作用
韩义香,章圣辉,吴建波,叶爱芳,尹丽慧,谭映霞
(温州医学院附属第一医院 内科实验室,浙江 温州 325000)
摘 要:目的 探讨三氧化二砷 ( A s2O 3 ) 诱导 K562 细胞凋亡的发生机制。方法 分别以 1、2、4、8、16 mol/ L
As2O3诱导 K562 细胞凋亡, MTT 法检测不同时间点细胞增殖抑制率, DNA Ladder 法检测细胞凋亡, Annexin V/
PI 染色结合流式细胞术检测细胞凋亡率, Rhodamine 123 染色流式细胞术检测线粒体膜电位 ( m) 变化, EL ISA
法检测胞浆细胞色素 C ( CYT C) 水平, 分光光度法检测 Caspase3 活性,流式细胞术检测 Bcl2 和 Bax 表达。结果
MTT 结果显示 As2O3能抑制 K562 细胞生长, 且呈现时间剂量依赖性; 4~ 16 mo l/ L 的 As2O 3作用 24 h 均可诱
导 K562 细胞凋亡,同时伴有 m 下降 ,胞浆内 CYT C 蛋白浓度及 Caspase3 活性增高,胞浆 Bcl2/ Bax 值下降,
且均呈剂量依赖性。结论 As2O3诱导 K562 细胞凋亡可能是通过降低 m,激活线粒体凋亡途径实现的, Bcl2/
Bax 值下降可能与其有关。
关键词:三氧化二砷; 人慢粒细胞系 K562; 细胞凋亡; 线粒体跨膜电位
中图分类号: R737 9 文献标识码: A 文章编号: 02532670( 2010) 03045204
近十几年来,三氧化二砷 ( As 2O 3 ) 被成功用于
治疗常规化疗或维甲酸治疗后复发的急性早幼粒白
血病[ 1] ,其作为一种古老的矿物药成为国际血液、肿
瘤学界的研究热点。近年来研究证实, As 2O 3对多
种恶性血液病细胞和实体瘤细胞具有明显的抑制生
长及促进凋亡作用 [ 2, 3]。慢性粒细胞白 血病
( CML) 是发生在早期多能干细胞上的恶性骨髓增
殖性疾病,其进入急变期往往对化疗药物作用不敏
感。伊马替尼 ( ST I571) 的研制成功为急变期的患
者带来了新的希望,但是由于价格昂贵和耐药问题
使其应用受到一定的局限 [ 4] , 因此许多临床血液学
家开始关注 A s2O 3治疗 CML 的研究。本实验研究
了 As2O 3对 CML 细胞株 K562 体外诱导凋亡作用
及对线粒体跨膜电位 ( m) 和 Bcl2/ Bax 值的影
响,探讨 m 和 Bcl2/ Bax 值在 As2O 3诱导 K562
细胞凋亡中的作用, 以期阐明 As 2O 3诱导 K562 细
胞凋亡的分子机制。
1 材料
K562 细胞购于中国科学院上海细胞生物研究
所。As2O 3、MT T 试剂、Rhodam ine 123 ( Sigma 公
司) ; 胎牛血清、RPM I 1640 培养基 ( Gibco 公司) ;
DNA Ladder 抽提试剂盒、Caspase3活性检测试剂
盒 (碧云天生物技术有限公司) ; F IX & PERM kit、
Annexin V/ PI kit ( Caltag 公司) ; 细胞色素 C
( CYTC) ELISA kit ( R& D 公司) ; Bcl2FIT C 及
同型对照 ( A ncell 公司) ; BaxPE 及同型对照
( Santa Cr uz 公司)。Elx800 酶标仪 ( BIOTEK 公
司) ; FACS Calibur 流式细胞仪 ( BD 公司)。
2 方法
2 1 细胞培养及实验分组: 采用含 10% 胎牛血清
的 RPM I 1640 培养液常规培养 K562 细胞,药物处
理时均选用对数生长期细胞。实验分成 6组:对照
组, 1、2、4、8、16 mol/ L As2O3组。
2 2 MTT 法评价细胞增殖抑制: 细胞生长培养液
调整每组细胞浓度均为 5 104 / mL。取 96 孔板,
每孔加入 100 L 细胞悬液, 每组设 8 个平行培养
孔。分别于 24、48、72 h 取各组培养板, 每孔加入
20 L MT T ( 5 g/ L ) 继续培养 4 h, 经洗涤离心弃
去上清,加入 100 L 二甲亚砜, 震荡 10 min, 在酶
标仪上读取波长为 570 nm 的吸光度 ( A ) 值,计算
K562细胞的生长抑制率 [抑制率= ( 1- A加药组 /
A 对照组 ) 100%]。
2 3 DNA 片段化分析: 各组细胞药物作用 24 h
后,取 3 106个细胞用于总 DNA 提取。提取方法
根据 DNA Ladder 抽提试剂盒提供的操作手册进
行。1 5% 琼脂糖凝胶电泳 30 m in, 凝胶成像分析
仪观察并记录结果。
2 4 Annexin V/ PI 双染色法检测细胞凋亡: 24 h 时
收集各组 K562细胞, PBS 洗涤 2次, 按 Annexin V/
PI 试剂盒说明书操作。1 h 内用流式细胞仪检测细
胞凋亡率,获取和分析均采用 Cell Quest V3. 2软件。
2 5 m 检测:各组细胞药物作用 24 h 后,收获
!452! 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 3 期 2010 年 3 月
收稿日期: 20090707 作者简介:韩义香( 1979 ∀ ) ,女,山东惠民人,助理研究员,硕士,研究方向:免疫学及分子生物学。
T el : ( 0577) 86550276 Email: yxhan2001@ 163. com
细胞用 Dhanks 液洗涤 2 次, 将细胞悬浮于 5 g/
mL Rhodamine 123 染液中, 置于 37 # 、5% CO2孵
箱 30 min, Dhanks液洗涤 3次后重悬细胞, 流式细
胞仪测定 Rhodamine123 荧光强度。
2 6 胞浆 CYT C 浓度及 Caspase3 活性测定: 分
别按 CYT C 浓度检测试剂盒和 Caspase3 活性检
测试剂盒说明书要求进行, 各组样品及标准品均采
用复孔。
2 7 Bcl2 和 Bax 蛋白检测:离心收集各组 24 h 后
的 K562 细胞各约 1 0 106个, PBS 洗涤 2次,细胞
沉淀用 FIX & PERM A 液 100 L 固定 20 min, 加
入 2 mL PBS 洗涤后加入 200 L B 液,重悬后均分
成 2管, 1 管加入鼠抗 IgG1FITC/鼠抗 IgG1PE,
另 1管加入 Bcl2 FIT C/ Bax PE,每种抗体均加 10
L, 混匀,室温避光孵育 20 min, PBS 洗涤 1次后用
300 L 1% 多聚甲醛 PBS 重悬,流式细胞仪获取和
分析均采用 Cell Quest V3. 2 软件。
28 统计学方法:全部数据以 x ∃ s 表示,采用 LSD
方差分析作组间数据比较,以 P< 0 05 为差异有统
计学意义,数据统计分析采用 SPSS 13 0软件。
3 结果
3 1 A s2O 3对 K562 细胞增殖的影响: 各组处理
K562细胞 24~ 72 h,绘制生长曲线,发现 2 mol/ L
As2O 3处理的细胞即出现明显的细胞增殖抑制效
应,细胞增殖抑制效应表现为剂量效应和时间效
应依赖关系, 见图 1。表明一定浓度的 A s2O 3对
K562 细胞有明显的细胞增殖抑制作用。
32 DNA 琼脂糖凝胶电泳分析: DNA 琼脂糖凝胶
电泳分析表明, 4、8、16 mol/ L As2O3分别作用于
K562细胞 24 h 后, DNA 降解为相差 180~ 200 bp大
小的片段,电泳均出现典型的梯状条带。对照组、1、2
mol/ L As2O3组均未出现梯状条带 (图 2)。
33 细胞凋亡改变: Annexin V/ PI 双染色后流式细
图 1 不同浓度的 As2O3处理 K562 细胞不同时间后的
生长曲线
Fig. 1 Growth curve of K562 cells treated by As2O3
at different concentration for 24, 48, and 72 h
A对照组 B~ F1、2、4、8、
16 m ol! L- 1 As2O 3组
Acon tr ol group
B∀ F1, 2, 4, 8, 16
mol! L- 1As2O3 group
图 2 不同浓度 As2O3作用 24 h 后 K562 细胞 DNA
琼脂糖凝胶电泳图
Fig. 2 DNA Agarose electrophoresis analysis of K562 cells
treated by As2O3 at dif ferent concentration for 24 h
胞仪检测结果显示, 对照组及 1、2、4、8、16 mol/ L
As 2O3作用 24 h 后早期细胞凋亡率分别为 ( 2 09 ∃
1 42) %、( 2 13 ∃ 1 57 ) %、( 2 41 ∃ 1 48 ) %、
( 5 61 ∃ 2 03) %、( 11 84 ∃ 2 69) %、( 30 98 ∃
4 16) %。与对照组相比, 1、2 mol/ L As 2O 3组差
异均没有统计学意义 ( P> 0 05) , 4、8、16 mo l/ L
As 2O3组凋亡率均增加 ( P< 0 01) (图 3)。
A对照组 B~ F1、2、4、8、16 m ol ! L- 1 As 2O 3组
Acont rol group B ∀ F1, 2, 4, 8, 16 mol! L- 1 As2O 3 group
图 3 不同浓度 As2O3作用 24 h后 K562 细胞流式凋亡分析图
Fig. 3 Changes in apoptosis percentage of K562 cells treated by As2O3 at diff erent concentration for 24 h
!453!中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 3 期 2010 年 3 月
3 4 As2O 3对 m 影响: 不同浓度 As 2O 3作用
K562 细胞 24 h后,除 1 mol/ L As 2O3外其他浓度
组 Rhodam ine123 染色细胞均增多 ( P< 0 05) , 且
呈剂量依赖性 (表 1和图 4)。
3 5 As2O3诱导 K562 细胞凋亡时胞浆 CYT C 浓
度和 Caspase3 活性的变化:结果见表 2。与对照组
相比, 1 mol/ L As2O3组 K562 细胞 CYTC 浓度和
Caspase3活性没有明显变化,其他处理组 K562细胞
CYTC 浓度和 Caspase3 活性均升高 ( P< 0 05) , 8
mol/ L 和 16 mol/ L As2O3 组 CTYC 浓度 和
Caspase3活性差别没有统计学意义 ( P> 0 05)。
表 1 不同浓度 As2O3作用 24 h 后对 K562 细胞 m的
影响 ( x∃ s, n= 6)
Table 1 Effects of As2O3 at different concentration
on m in K562 cells for 24 h (x ∃ s, n= 6)
组 别 剂量/ (m ol ! L- 1) Rh odamine123染色细胞/ %
对照 - 5 52 ∃ 331
As2O 3 1 7 17 ∃ 415
2 11 90 ∃ 506*
4 15 09 ∃ 598* *
8 44 47 ∃ 1023* *
16 91 80 ∃ 643* *
与对照组比较: * P< 005 * * P< 0 01
* P< 0 05 * * P < 0 01 v s cont rol group
A对照组 B16 mol! L- 1 As2O 3组
Acon tr ol group B ∀ F16 mol! L- 1 As2O 3 group
图 4 As2O3作用 24 h 后对 K562 细胞 m 的影响
Fig. 4 Effects of As2O3 on m in K562 cells for 24 h
表 2 不同浓度 As2O3作用 24 h后对 K562 细胞胞浆 CYTC
浓度和 Caspase3 活性的影响 ( x∃ s, n= 6)
Table 2 Effects of As2O3 at different concentration
on cytochromeC concentration and Caspase3
activity in K562 cells for 24 h ( x∃ s, n= 6)
组 别 剂量/ (mol! L- 1) CYTC/ (g! L- 1 ) Caspase3 活性
对照 - 0 41 ∃ 0 14 0 12∃ 0 05
As2O3 1 0 55 ∃ 0 14 0 21∃ 0 06
2 0 70 ∃ 0 17* 0 36∃ 0 15*
4 1 12 ∃ 0 21* * 0 60∃ 0 19* *
8 1 46 ∃ 0 30* * 0 86∃ 0 24* *
16 1 60 ∃ 0 32* * 0 98∃ 0 24* *
与对照组比较: * P< 005 * * P< 0 01
* P< 0 05 * * P < 0 01 v s cont rol group
3 6 As 2O 3对 K562 细胞内 Bcl2/ Bax 的影响: 结
果见表 3。K562 细胞内 Bcl2 高表达, Bax 表达率
极低。各浓度 A s2O 3处理 K562 细胞 24 h 后, 与对
照组相比, K562 细胞内 Bcl2 均表达降低 ( P <
0 01) ; 1 和 2 mo l/ L As2O 3组与对照组比较 Bax
表达差异均无统计学意义 ( P> 0 05) , 其他浓度组
Bax 表达均升高 ( P< 0 05)。与对照组相比,各浓
度 As2O 3组 K562 细胞内 Bcl2/ Bax 值均降低
( P< 0 05)。
表 3 不同浓度 As2O3作用 24 h后对 K562 细胞内 Bcl2
和 Bax 蛋白表达的影响 (x ∃ s, n= 6)
Table 3 Ef fects of As2O3 at different concentration
on expression of Bcl2 and Bax protein
in K562 cells f or 24 h (x ∃ s, n= 6)
组 别 剂量/
(mo l! L- 1 )
Bcl2 表达率/
%
Bax 表达率/
%
(Bcl2/
Bax) /%
对照 - 98 10∃ 1 19 1 56 ∃ 0 78 76 47∃ 34 56
As2O3 1 85 31∃ 4 57* * 2 12 ∃ 1 05 51 54∃ 31 21*
2 81 70∃ 5 23* * 3 44 ∃ 1 41 30 28∃ 21 13*
4 75 41∃ 5 47* * 5 68 ∃ 2 06* 15 03∃ 6 05* *
8 34 57∃ 9 85* * 10 16 ∃ 3 82* * 3 75∃ 1 45* *
16 14 41∃ 8 62* * 15 51 ∃ 4 42* * 1 11∃ 0 86* *
与对照组比较: * P < 0 05 * * P < 0 01
* P < 0 05 * * P< 0 01 v s cont rol g rou p
4 讨论
As2O3在祖国医药中被称为砒霜, 其能抑制多
种肿瘤增殖, 但不同细胞株对其敏感性不同。本研
究中用 As2O3 (浓度%4 mol/ L ) 作用 K562 细胞
24 h 后, DNA 片段化分析呈现典型的梯状条带, 1
和 2 mo l/ L 浓度组没有发现凋亡变化。MT T 实
验结果显示在 24~ 72 h 内 1~ 16 mol/ L As2O 3对
K562细胞生长增殖抑制率呈递增趋势, 16 mo l/ L
As 2O3组处理 72 h 时增殖抑制率已达 ( 96 82 ∃
2 35) %。Annex in V/ PI 双染法检测 24 h 各组的
早期细胞凋亡率显示, As2O 3浓度%4 mo l/ L 时
K562细胞早期凋亡增多, 16 mol/ L A s2O 3作用 24
h 早期细胞凋亡率为 ( 30 98 ∃ 4 16) %, 其增殖抑
制率为 ( 50 29 ∃ 7 82) %, 说明 As2O 3主要通过诱
导细胞凋亡来抑制 K562 细胞增殖。
激活细胞凋亡途径是细胞毒性药物杀伤肿瘤细
胞的一个主要机制。不同的外因素启动凋亡的方式
不同,所引起的信号转导也不相同,目前比较清楚的
主要有两条通路: 一条是线粒体通路; 另一条是以
Fas 和 T NFR 为代表的死亡受体通路。两条通路
最终都激活 Caspase 酶, 细胞凋亡的过程实际上是
Caspase 不可逆有限水解底物的级联放大反应过
!454! 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 3 期 2010 年 3 月
程[ 5]。随着对细胞凋亡机制研究的进一步深入, 线
粒体在凋亡中的作用越来越受重视。线粒体膜通透
性转运孔道 ( MPT) 主要由位于内膜的腺苷转位因
子 ( ANT) 和位于外膜的电压依赖性阴离子通道
( VDAC) 等蛋白所组成。在致凋亡因子的刺激下,
MPT 开放,导致 m 降低或丧失, 线粒体基质中
释放出致凋亡活性物质, 如细胞凋亡诱导因子和
CYT C 等,这些物质进入胞质, 可激活 Caspase级联
反应,最终导致细胞凋亡 [ 6]。
本实验主要研究线粒体跨膜电位在 As 2O 3促
K562 细胞凋亡中的作用。通过流式细胞仪检测
m 的变化,结果表明 As2O3浓度%2 mo l/ L 时
作用于 K562 细胞 24 h 后, Rhodamine123 染色细
胞的量逐渐增加,胞浆 CYTC 浓度和 Caspase3 活
性增加,具有剂量依赖性, 与细胞凋亡趋势变化相
同。本研究表明 As2O 3在不影响细胞膜完整性的
情况下可以使线粒体膜电位去极化, m 下降, 意
味着线粒体内膜结构改变, 通透性增加, M PT 开
放,导致 CYTC 等促凋亡因子自线粒体释放至胞
浆,诱导线粒体下游的凋亡相关 Caspase 家族活化。
Caspase 家族以级联活化形式逐级活化家族成员,
其中 Caspase3 是重要的下游效应分子, 它识别并
水解相应的底物, 致使细胞骨架蛋白降解、核膜破
裂、DNA 降解等,从而导致细胞凋亡。
Bcl2 家族成员在线粒体凋亡途径中扮演了关
键的调控作用[ 7] 。Bcl2 家族蛋白对 MPT 孔的开
放和关闭起关键的调节作用, 促凋亡蛋白 Bax、Bak
等可以通过与 ANT 或 VDA C 的结合介导 MPT
孔的开放,而抗凋亡类蛋白如 Bcl2、BclxL 等则可
通过与 Bax 竞争性地与 AN T 结合, 或者直接阻止
Bax 与 ANT、VDAC 的结合来发挥其抗凋亡效
应[ 8, 9]。本研究结果显示 As2O3 (浓度%1 mo l/ L )
作用 24 h 即可下调 K562 细胞 Bcl2 蛋白的表达,
上调 Bax 蛋白表达, 导致 Bcl2/ Bax 值下降, 可能
加重 K562 细胞对 As2O 3诱导凋亡的敏感性[ 10]。
综上所述, As2O3具有诱导 K562 细胞产生凋
亡的活性, 通过使线粒体 m 下降, 导致 CYT C
释放及胞浆 Caspse3 活性增加, 使 Bcl2/ Bax 值降
低,从而导致细胞凋亡发生,其确切的机制有待于进
一步研究。
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