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披碱草×野大麦杂种F_1幼穗培养再生体系的建立



全 文 :*通讯作者,E-mail:zaozheli@hotmail.com
收稿日期:2016-01-29;修回日期:2016-04-18
基金项目:国家自然科学基金项目(31260575)
作者简介:云玲格(1989-),女(蒙古族),呼和浩特市人,在读硕
士,研究方向为植物资源保护与利用,E-mail:490459398@qq.com.
Doi:10.16742/j.zgcdxb.2016-03-03
披碱草×野大麦杂种F1幼穗培养再生体系的建立
云玲格1,李造哲1,*,马青枝2,谢 菲3,李月强4
(1.内蒙古农业大学生态环境学院,内蒙古 呼和浩特 010019;2.内蒙古农业大学生命科学学院,内蒙古 呼和浩特 010019;
3.内蒙古阿拉善盟林木种苗站,内蒙古 巴彦浩特 750306;4.内蒙古包头市达茂旗林业局,内蒙古 百灵庙 014500)
摘要:以披碱草×野大麦杂种F1 幼穗为外植体,诱导出胚性愈伤组织,建立了植株再生体系,对影响愈伤组织
诱导、分化、生根的基本培养基、激素种类及质量浓度等进行筛选。结果表明:愈伤组织诱导以 MS为基本培养基+
3mg/L 2,4-D较好;外植体在 MS+3mg/L 2,4-D+30g/L蔗糖+7g/L琼脂的诱导培养基上经过20d培养,小穗愈
伤组织诱导率达28.3%;愈伤组织的分化培养基为 MS+1mg/L 6-BA+1mg/L NAA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂,愈
伤组织分化率达78%;生根培养基以1/2MS+0.5mg/L IBA+0.5mg/L NAA+蔗糖+7g/L琼脂为最佳,生根率可
达86.7%,移栽后成活率可达100%。
关键词:披碱草;野大麦;属间杂种F1;幼穗 ;组织培养;再生体系
中图分类号:S543   文献标识码:A   文章编号:1673-5021(2016)03-0014-05
  披碱草(Elymus dahuricus)与野大麦(Hor-
deum brevisubulatum)均是国产小麦族多年生优良
牧草。披碱草亦即直穗大麦草,也有人称其为青穗
大麦草,是披碱草属(Elymus L.)一种疏丛型多年
生旱中生牧草,为我国东北、华北以及西南地区草甸
草原、典型草原以及高山草原的伴生种,具有抗旱、
抗寒、耐盐碱、耐瘠薄、抗风沙的特点,是我国披碱草
属中分布最广、最为常见的种[1]。野大麦又名短芒
大麦草,从土耳其西部到中国东北部均有分布,为禾
本科大麦属多年生牧草,其牧草产量高、品质好,具
有耐盐碱、耐贫瘠、耐践踏和抗寒耐旱等优良性状,
具有良好的生产性能和较高的经济价值[2],常作为
建植人工草地和天然低湿盐碱化草地改良的理想草
种,同时也是耐盐碱牧草品质改良和选育工作中常
用的牧草材料[3]。将披碱草与野大麦作为亲本进行
远缘杂交,从而成功获得了正交F1 代和反交F1 代。
杂种F1 代同时具备了双亲的优良特性,但由于杂种
F1 代开放授粉不结实而高度不育,严重限制了其遗
传潜力的进一步发挥[4]。本研究以披碱草×野大麦
杂种F1 幼穗为外植体,建立其组织培养再生体系,
以期为该属间杂种新种质的保存和用秋水仙素诱导
其染色体加倍恢复育性奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试材料为种植于内蒙古农业大学牧草试验站
的披碱草×野大麦杂种 F1(Elymus dahuricus×
Hordeum brevisubulatum Hybrid F1)。试验站位
于呼和浩特市,地处东经111°44′、北纬40°49′,属典
型大陆性气候,年平均气温变化较大,年降水量
400mm左右,无霜期145d,土壤为砂壤质暗栗钙
土,pH为7.8~8.2,肥力适中,具有灌溉条件。
1.2 方法
1.2.1 愈伤组织的诱导
在披碱草×野大麦杂种F1 孕穗期,选择长约10~
30mm左右的幼穗,剥去叶鞘,带一层幼叶的幼穗,在超
净工作台中用解剖镊子剥出幼穗,先用70%乙醇处理外
植体1min,无菌水冲洗3次,再用0.1% HgCl2浸泡2~
4min,无菌水冲洗4~5次,切成2~3mm的小段接种到
愈伤组织诱导培养基上培养。每个组合12瓶,每瓶接5
段。接种的幼穗在25±1℃条件下暗培养,相对湿度
75%,20~30d后统计愈伤诱导率。
愈伤诱导率=形成愈伤块数/接种外植体总块
数×100%
培养基配方为:MS培养基+CH(水解酪蛋白,
0mg/L、300mg/L)+2,4-D(1.0mg/L、2.0mg/L、
3.0mg/L、4.0mg/L、5.0mg/L);培养基含蔗糖
30g/L,琼脂粉7g/L,PH=5.8。
1.2.2 愈伤组织的分化培养
将愈伤组织切割成直径约5mm的小块,将其
转接于幼苗分化培养基上,每组合6瓶,每瓶5块。
—41—
第38卷 第3期
Vol.38 No.3
         
中 国 草 地 学 报
Chinese Journal of Grassland
         
2016年5月
May 2016
愈伤组织分化的培养条件为:光照强度2000~
3000lx,光照时间14~16h/d,温度25±1℃,相对湿
度75%,每25~30d继代培养一次。统计有芽形成
的愈伤组织块,计算愈伤分化率。
愈伤分化率=有芽形成的愈伤组织块数/接种
的总愈伤组织块数×100%
分化培养基为:MS培养基+6-BA(1.0mg/L、
2.0mg/L、3.0mg/L,4mg/L、5mg/L)+NAA
(0.5mg/L、1.0mg/L)。
培养基含蔗糖30g/L,琼脂粉7g/L,PH=5.8。
1.2.3 生根培养
当幼苗长到5cm以上时转到生根培养基上培
养,统计生根率。
生根率=有根形成的愈伤组织块数/接种的总
愈伤组织块数×100%
生根培养基为:1/2MS培养基+ NAA(0、0.5
mg/L)+IBA(0、0.5mg/L);蔗糖20g/L,琼脂粉
7g/L,pH=5.8。
1.2.4 炼苗与移栽
生根培养后,当长出一定数量、比较粗壮的须根
时打开封口膜,4~5d后取出试验苗,将根部的培养
基清洗干净,移栽到土壤与蛭石(2∶1)的花盆中培
养。移栽早期,剪掉植株部分叶子,以保持水分平
衡,提高成活率。
2 结果与分析
2.1 愈伤组织的诱导
披碱草×野大麦杂种F1 幼穗在含有不同激素浓
度的诱导培养基上培养,暗培养3d后开始在切口处产
生微量乳白色愈伤组织,7d后表面开始干燥(图1-A)。
根据表1所示:在不同激素浓度的配比下,外植体F1
代幼穗均能够诱导出愈伤组织,但是愈伤组织的生长
状况存在一定的差异,在添加了CH的激素浓度配比
组合与没有添加CH的组合中发现,添加了CH组合
的诱导率明显低于只添加了激素2,4-D的诱导率。当
2,4-D的浓度逐渐增加时,愈伤组织的诱导率也随之逐
渐增加;当2,4-D浓度为3.0mg/L时,愈伤组织的诱导
率达到最高;随着2,4-D浓度的继续增加诱导率反而
下降,成正态分布。当2,4-D浓度为3.0mg/L时,愈伤
组织的诱导率达到28.3%,愈伤组织的质量较好,产生
淡黄色、疏松、易碎的颗粒状愈伤组织,这表明2,4-D
浓度为3.0mg/L诱导的效果最好,且激素2,4-D对愈
伤组织的诱导起主导作用。
A:愈伤组织;B:愈伤组织分化;C:生根培养;D:再生小植株移栽
A:calus;B:calus differentiation;C:rooting culture;D:regenerated plant
图1 愈伤组织诱导及植株再生过程
Fig.1 Calus induction and plant regeneration
2.2 愈伤组织分化
从表2可以看出:当NAA浓度为0.5mg/L时,
随着6-BA浓度的增大分化率呈降低趋势,但在6-BA
浓度为1.0mg/L时分化率较高,达到63%;当NAA
浓度为1.0mg/L时,随着6-BA浓度的增加分化率呈
先升高后降低趋势,当6-BA浓度为1.0mg/L时分化
率最高,达到78%,有微量根出现,且生长良好(图1-
B)。由此可以看出,本研究 MS+6-BA 1.0mg/L+
NAA 1.0mg/L为最佳分化培养基。
2.3 生根培养及炼苗移栽
由表3可知:不同的激素浓度配比下均能诱导无
根苗生根,3d左右开始长出颜色较白的细根,7d后开
始从侧面逐渐长出须根,25d左右根系较发达可以移
栽。当IBA浓度为0.5mg/L、NAA浓度为0.5mg/L
时,生根率最高,达到86.7%,根粗壮、须根较多,生根
快(图1-C)。所以,本研究最佳生根培养基为 MS+
IBA 0.5mg/L+NAA 0.5mg/L。生根培养25~30d
后,经炼苗,移栽成活率达100%(图1-D)。
—51—
云玲格 李造哲 马青枝等   披碱草×野大麦杂种F1 幼穗培养再生体系的建立
表1 不同激素浓度配比对愈伤组织诱导的影响
Table 1 Effect of hormones in different ratio on calus induction
编号
No
2,4-D(mg/L)
2,4-D
concen tration
CH(mg/L)
CH concen
tration
接种数
No of explants
出愈伤数
No of calus
produced
诱导率(%)
Rate of calus
induction
愈伤组织状况
Calus state
1  1  300  60  5  8.3 乳白色,疏松,团状
2  2  300  60  5  8.3 乳白色,疏松,团状
3  3  300  60  7  11.7 乳白色,疏松,团状
4  4  300  60  6  10.0 乳白色,疏松,团状
5  5  300  60  5  8.3 乳白色,疏松,团状
6  1  0  60  9  15.0 乳白色,团状,致密
7  2  0  60  12  20.0 乳白色,稍硬,团状
8  3  0  60  17  28.3 淡黄色,疏松,颗粒状
9  4  0  60  14  23.3 淡黄色,较硬,颗粒状
10  5  0  60  12  20.0 乳白色,稍硬,团状
表2 不同激素浓度配比对愈伤组织分化培养的影响
Table 2 Effect of hormones in different ratio on calus differentiation
编号
No
6-BA(mg/L)
6-BA concentration
NAA(mg/L)
NAA concentration
接种数(块)
No of explants
分化芽愈伤数(块)
No of calus
differentiated
分化率(%)
Rate of
differentiation
分化状况
Differentiation status
1  1  0.5  40  25  63.0 生长较快,少量芽产生
2  2  0.5  40  25  63.0 生长较快,少量芽产生
3  3  0.5  40  22  55.0 生长缓慢,少量芽产生
4  4  0.5  40  19  48.0 生长缓慢,少量芽产生
5  5  0.5  40  15  38.0 生长缓慢,少量芽产生
6  1  1.0  40  31  78.0 生长较快,大量芽、微量根产生
7  2  1.0  40  19  48.0 生长缓慢,少量芽产生
8  3  1.0  40  19  48.0 生长缓慢,少量芽产生
9  4  1.0  40  16  40.0 生长缓慢,少量芽产生
10  5  1.0  40  13  33.0c 生长缓慢,少量芽产生
表3 不同激素浓度配比对生根培养的影响
Table 3 Effect of hormones in different ratio on rooting culture
编号
No
IBA(mg/L) NAA(mg/L)
接种数(块)
No of explants
生根数
Rooting number
生根率(%)
Rate of rooting
生长状况
Growth state
1  0.0  0.0  45  27  60.0 根粗壮,须根较少,生根较快
2  0.0  0.5  45  21  36.7 根较细,须根较少,生根缓慢
3  0.5  0.0  45  24  53.3 根粗壮,须根较少,生根缓慢
4  0.5  0.5  45  39  86.7 根粗壮,须根较多,生根较快
3 讨论
3.1 影响幼穗愈伤组织诱导率的因素
试验研究发现,在添加了3mg/L 2,4-D的激素
浓度配比中,愈伤组织的诱导率达到最佳,在短芒大
麦草、加拿大披碱草与两种国产披碱草杂种F1、大
麦、朝鲜碱茅和星星草、加拿大披碱草×老芒麦杂种
F1 均得到了相类似的结果[5~8],这表明在愈伤组织
的诱导过程中生长素类激素2,4-D起主要作用。温
度、湿度、光照条件也是决定愈伤组织诱导率的因
素,通常情况下暗培养的诱导率要大于光照培养的
诱导率,这在杨晓玲的研究中得到了相似的结果[9]。
幼穗的长度会影响愈伤组织的诱导率,这与钟小仙
在象草幼穗的研究中得出的结果相似[10];而在新麦
草、绒毛狼尾草幼穗的研究中提到取1cm左右的幼
穗长度最佳[11]。本研究发现,取3cm左右的幼穗诱
导的愈伤组织为最适长度,且愈伤组织诱导率达到
最高,可能是由于材料的不同导致取材的长度不同,
这在以后的试验研究中需要进一步探索,以期有效
提高幼穗愈伤组织的诱导率。
3.2 水解酪蛋白对组织培养的影响
在愈伤组织的诱导培养过程中发现,水解酪蛋
—61—
中国草地学报 2016年 第38卷 第3期
白有促进愈伤组织诱导的作用,在短芒大麦草及新
麦草的研究中也提到了类似的研究[12]。本研究发
现,在添加了水解酪蛋白的激素浓度配比中并没有
显著的影响,且有抑制组织培养的诱导作用,可能是
由于材料的不同导致水解酪蛋白的影响也不同。
4 结论
诱导愈伤组织的最适培养基为 MS+3mg/L
2,4-D+30g/L蔗糖+7g/L琼脂粉;愈伤组织的最
佳分化培养基为MS+1mg/L 6-BA+1mg/L NAA
+30g/L蔗糖+7g/L琼脂粉;最佳生根培养基为
1/2MS+0.5mg/L IBA+0.5mg/L NAA+30g/L
蔗糖+7g/L琼脂粉。
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云玲格 李造哲 马青枝等   披碱草×野大麦杂种F1 幼穗培养再生体系的建立
Establishment of Plant Regeneration System by Culture
of Yong Spike of Elymus dahuricus×Hordeum
brevisubulatumHybrid F1
YUN Ling-ge1,LI Zao-zhe1,MA Qing-zhi 2,Xie Fei 3,LI Yue-qiang4
(1.College of Ecology and Environmental Science,Inner Mongolia Agricultural University,Hohhot
010019,China;2.College of Life Science,Inner Mongolia Agricultural University,Hohhot 010019,
China;3.Forest Tree Seedlings Standing of Alashan League,Bayanhaote 750306,China;
4.Forestry Bureau of Damao Banner,Bailingmiao 014500,China;)
Abstract:Yong spikes of Elymus dahuricus× Hordeum brevisubulatum F1 were used as explants,
embryonic calus was induced and plant regeneration system was successfuly established,the basic culture
mediums,hormones and concentrations for calus induction,differentiation and rooting were screened.
The results showed that the better calus induction medium was MS+3mg/L 2,4-D,the ratio of calus
induction was 28.3%after cultured in the induction medium of MS+3mg/L 2,4-D+30g/L surose+7g/L
agar for 20days;the calus differentiation medium was MS+1mg/L 6-BA+1mg/L NAA+30g/L sucrose
+7g/L agar,the ratio of calus differentiation was 78%;the optimal rooting medium was MS+0.5mg/L
IBA+0.5mg/L NAA+sucrose+7g/L agar,rooting ratio was 86.7%;the survival rate after transplanting
was 100%.
Key words:Elymus dahuricus;Hordeum brevisubulatum;Inter genera hybrids F1;Young spike;Tis-
sue culture;Regeneration sy
櫏櫏櫏櫏櫏櫏櫏櫏櫏櫏櫏櫏櫏櫏櫏櫏櫏櫏櫏櫏櫏櫏櫏櫏櫏櫏櫏櫏櫏櫏櫏櫏櫏櫏櫏櫏櫏櫏櫏櫏櫏櫏櫏櫏櫏櫏櫏櫏櫏
stem
  (上接第6页)
Grassland Problems and Grassland Governance in China
WEI Hui-lan,QI Ying-jun
(Research Center of Community and Biodiversity Conservation/College of
Economics,Lanzhou University,Lanzhou730000,China)
Abstract:Focused on the public goods properties of the grassland resources,the“rent dissipation”
problem in grassland resources with open access property was discussed.After the grassland areas introdu-
cing“The Family Contract System”in China,the grassland contracting business model uniting in the fami-
ly has triggered a new round of grassland degradation and new governance dilemma- “fence traps”,which
not only created a new system cost,but also produced new ecological external problems.These phenomena
were explained:because of rapidly changing external environment and uncertain characteristics of a user,it
could not be simplified to solve the grassland resources“rent dissipation”problem.It was thought that in
China grassland governance should base on perfecting Grassland Family Contract System and ensuring ex-
clusive right of herders’pasture earnings,then herders chose a flexible“combination”and the community
as carrier to operate pasture.The government should promote and encourage the community co-governance
model in the joint household management as the main form.
Key words:Grassland resources;Rent dissipation;Fence traps;Family contract system;Communi-
ties co-governance
(责任编辑 李 平)
—81—
中国草地学报 2016年 第38卷 第3期