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作物学报，2004，30(5) :481-486．
收稿日期:2016-07-13
基金项目:国家自然科学基金项目(编号:31302021)及内蒙古自然科学基金项目(编号:2010 MS 0502)资助。
作者简介:李小雷 (1980—) ，男，黑龙江绥化市人;博士，讲师，主要从事饲用作物遗传育种研究。
通讯作者:于 卓(1958—) ，男，博士，教授，博导，主要从事饲用作物及马铃薯育种研究。
老芒麦和紫芒披碱草及其杂种 F1 代与 BC1 代的 ISSＲ分析
李小雷1， 鲍红春2， 于 卓1
(1．内蒙古农业大学农学院， 呼和浩特 010019; 2．内蒙古自治区园艺研究院， 呼和浩特 010010)
摘 要:利用 ISSＲ技术对老芒麦(Elymus sibiricus L．)和紫芒披碱草(Elymus purpuraristatus C． P)及其杂种 F1 代与 BC1 代
的遗传差异性进行研究。结果表明，从 90 个 ISSＲ引物中筛选出 8 个适宜引物，共扩增出 71 个 ISSＲ位点，多态性位点比
率为 36． 6%。供试材料的遗传距离变幅为 0． 230 8 ～ 0． 659 1，老芒麦与紫芒披碱草的遗传距离较大(0． 712 2) ，以 GD值
0． 50 为基准，分为两类，母本老芒麦、正交 F1 代、L-BC1、Z-BC1 为一类。父本紫芒披碱草、反交 F1 代为一类，BC1 代偏向
轮回亲本老芒麦遗传。
关键词: 老芒麦;紫芒披碱草;杂种 F1 代;BC1 代;ISSＲ
DOI编码: 10． 16590 / j． cnki． 1001-4705． 2016． 12． 017
中图分类号: S 543 + ． 9 文献标志码: A 文章编号: 1001-4705(2016)12-0017-04
ISSＲ Analysis of Elymus sibiricus，Elymus purpuraristatus and
Their Hybrid F1 代 and BC1
LI Xiaolei1，BAO Hongchun2，YU Zhuo1
(1． College of Agronomy，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot 010019，China;
2． Institute of Horticulture，Inner Mongolia Academy of Agriculture
and Husbandary Sciences，Huhhot 010010，China)
Abstract:The genetic differences among Elymus sibiricus L．，Elymus purpuraristatus C． P，their hybrid F1 and
BC1 were investigated by using ISSＲ technique． The results showed that 71 loci were amplified from 8 primers
out of 90 ISSＲ primers，the polymorphic loci percentage were 36． 6% ． The genetic distance (GD)of tested
plants were ranged from 0． 230 8 to 0． 659 1，and the genetic distance of E． sibiricus and E． purpuraristatus was
ulterior(0． 712 2) ，using the GD value of 0． 5 as threshold，6 tested plants could be clustered into 2 groups:
group 1 including female parent E． sibiricus and E． sibiricus × E． purpuraristatus F1、L-BC1、Z-BC1，group 2 in-
cluding male parent E． purpuraristatus、E． purpuraristatus × E． sibiricus F1，BC1 tended to inherit toward recur-
rent parent E． sibiricus．
Key words: Elymus sibiricus;Elymus purpuraristatus;hybrid F1;BC1;ISSＲ
·71·
研究报告 李小雷 等:老芒麦和紫芒披碱草及其杂种 F1 代与 BC1 代的 ISSＲ分析
远缘杂交是不同物种间进行基因交流、创造遗传变
异的有效途径，目前已成为育种者进行种质创新，选育
新品种的重要手段［1-3］。小麦族(Triticeae Dumortier)属
于禾本科(Gramineae) ，与人类关系十分密切，因其含
有栽培小麦所缺乏的抗旱、抗病虫，耐瘠薄、高产、优质
等宝贵基因资源，现已成为麦类作物及牧草遗传改良
的巨大基因库。小麦族中很多种类既为人们提供优质
牧草，又在水土保持、防风固沙等方面发挥重要作用，
如披碱草属(Elymus)、偃麦草属(Elytrigia)、冰草属
(Agropyron)、大麦属(Hordeum)等［4-8］。紫芒披碱草
(Elymus purpuraristatus C． P)与老芒麦(Elymus sibiricus
L．)均为小麦族披碱草属(Elymus)的多年生禾草，紫
芒披碱草为 6 倍体，其主要优点是鲜草产量高、不易倒
伏、抗病虫、抗旱、耐盐碱，但在饲草品质方面逊于老芒
麦;老芒麦为四倍体，具有叶量大、品质优、产籽量高等
特点，但植株容易倒伏、种子落粒性强［9］。为使二者
的优良性状综合到一起，选育具有草质好、产量高、抗
性强等特性的披碱草新种质，近年来笔者将紫芒披碱
草与老芒麦相组配进行远缘杂交，成功地获得了正、反
交杂种 F1 代。观察发现，正、反交杂种 F1 代为五倍
体，杂种优势很强，具有较高的育种利用价值，但杂种
F1 代高度不育，致使其进一步利用受到了限制。为
此，用回交方法成功地获得了(老芒麦 ×紫芒披碱草)
×老芒麦和(紫芒披碱草 ×老芒麦)×老芒麦的回交
一代，BC1 代的育性得到了一定恢复。
ISSＲ是建立在 PCＲ反应基础上的一种新型 DNA
分子标记技术。它能快速、高效地检测出重复序列之
间区域的 DNA多态性，具有 DNA 用量少、稳定性高、
多态性丰富、成本较低、操作简单等优点。目前已在植
物遗传多样性分析、农作物品种鉴定、遗传作图、物种
分类及分子标记辅助选择育种等方面得到了广泛应
用［10-13］。本试验拟对紫芒披碱草、老芒麦及其杂种 F1
代和 BC1 代进行 ISSＲ研究，旨在从分子水平上探讨亲
本与其杂交后代间的相似性和遗传差异程度，以期为
正、反交 F1 代与回交 BC1 代及亲本间的识别和鉴定提
供理论依据，同时也为杂交后代的选育利用奠定基础。
1 材料与方法
1． 1 试验材料
试验材料(表 1)种植在内蒙古农业大学农作物试
验场内、试验地土壤为沙壤质暗栗钙土，肥力适中，具
有灌溉条件，无霜期 145 d，降水量 400 mm左右。
表 1 试验材料
序号 材料名称 序号 材料名称
1 老芒麦 4
反交 F1代
(紫芒披碱草 ×老芒麦)
2 紫芒披碱草 5 L-BC1
3 正交
F1代
(老芒麦 ×紫芒披碱草)
6 Z-BC1
注:“L-BC1”表示［老芒麦 ×紫芒披碱草］×老芒麦回交一代，
“Z-BC1”表示［紫芒披碱草 ×老芒麦］×老芒麦回交一代。
1． 2 研究方法
1． 2． 1 DNA提取与检测
剪取各供试材料的新鲜幼叶 0． 5 g，利用植物基因
组试剂盒对基因组总 DNA 进行提取，然后取 3 μL
DNA溶液稀释后，再用 1． 5%琼脂糖凝胶电泳对其质
量和浓度进行检测，电极缓冲液为 1 × TAE Buffer，电
源电压为 50 V，电泳 20 min 后，凝胶用核酸染料进行
染色，然后用紫外凝胶成像系统仪观察、照相。最后将
模板 DNA浓度调至 20 ng /μL 后，保存在冰箱 － 20 ℃
下备用。
1． 2． 2 ISSＲ-PCＲ扩增反应体系
ISSＲ-PCＲ 扩增反应体系 20 μL:20 ng /μL 模板
DNA 1 μL、10 × Buffer 2． 0 μL，25 mmol /L Mg2 + 1． 6 μL，
10 mmol /L dNTPs 0． 4 μL，10 μmol /L 引物 0． 8 μL，5 U
Taq DNA 聚合酶 0． 2 μL，ddH2O 14 μL。PCＲ扩增程序
为 94 ℃预变性 5 min，1 个循环，然后进行 40 个循环
(94 ℃变性 45 s，50 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 90 s) ，循环
结束后，72 ℃延伸 10 min，最后 4 ℃保存备用。
采用 1． 5%琼脂糖胶电泳对扩增产物进行检测，
电泳缓冲液为 1 × TAE Buffer，电泳时间 1． 5 h。电泳
结束后凝胶用 EB染色，拍照、记录、保存图像。
1． 2． 3 引物筛选
利用上海生工生物工程技术服务公司合成的ISSＲ
引物，选取紫芒披碱草与老芒麦基因组 DNA 为模板，
对 90 条 ISSＲ引物进行筛选，对于带型清晰、重复性好
的引物用于所有个体扩增。
1． 2． 4 数据统计及分析
ISSＲ通常被认为是显性标记，电泳图谱的每条条
带都代表引物的一个特异结合位点，按照点样顺序对
多态性条带进行逐条比对，将清晰的条带赋值为 1，相
同迁移率位置无带或模糊不清的弱带赋值为 0，生成
0，1 组成的数矩阵，运用 DPS 分析软件计算供试材料
间的遗传相似系数 (GS)及遗传距离 (GD) ，并根据
UPGMA方法进行聚类分析［14-15］。
1)多态性条带百分率(%)=(K/N)×100%，式中
K为扩增出多态性条带数目，N为检测到的条带总数。
·81·
第 35 卷 第 12 期 2016 年 12 月 种 子 (Seed) Vol． 35 No． 12 Dec． 2016
2)遗传相似系数(GS)和遗传距离(GD) :遗传
相似系数(GS)= 2 Nij /(Ni + Nj) ，式中 Nij是指第 i材
料和第 j材料共同的条带数目，Ni 为第 i 材料中扩增
的条带数，Nj为第 j材料中扩增的条带数;
遗传距离(GD)= 1 － GS。
2 结果与分析
2． 1 基因组 DNA提取
由图 1 可以看出，紫芒披碱草、老芒麦及其杂种
F1 代和 BC1 代均出现 1 条带型清晰、无拖尾的条带，
表明利用试剂盒提取的基因组 DNA 纯度较高，无降
解，完全符合 ISSＲ试验要求。
图 1 供试材料基因组 DNA电泳检测
2． 2 ISSＲ扩增结果
以老芒麦和紫芒披碱草的基因组 DNA为模板，利
用 90 个 ISSＲ引物对供试材料进行 PCＲ 扩增，最终筛
选出带型清晰、多态性明显、重复性好的引物共 8 个，
占所有引物的 8． 9%。将这 8 个引物用于各供试材料
的 PCＲ扩增，每个引物扩增条带范围在 7 ～ 11 条，其
DNA片段长度介于 250 ～ 2 000 bp之间，8 个引物共扩
增出 71 条条带，平均每个引物扩增出 8． 9 条，其中多
态性条带 26 条，多态性条带比率为 36． 6%(表 2、图
2) ，表明在 DNA分子水平上供试材料间存在着一定的
遗传差异性。从部分引物扩增的 ISSＲ 指纹图谱可以
看出，老芒麦 ×紫芒披碱草杂种 F1 代与回交后代植株
及双亲之间的 ISSＲ谱带差异明显，这些引物可作为回
交后代与亲本及杂种 F1 代相互识别和鉴定的依据。
表 2 引物序列及位点多态性
引物
序列
(5’－ 3’) 扩增条带数 多态性条带数
多态性条带率
(%)
A 05 (AG)8 C 9 4 44． 4
A 07 (TG)8ＲA 8 3 37． 5
A 11 (AG)8 TA 10 4 40
A 49 (AC)8ＲT 8 2 25
A 57 (AG)8 CC 7 2 28． 6
A 99 (TC)8 C 9 4 44． 4
A 123 (CT)8ＲC 11 5 45． 5
A 127 (GAA)6 9 2 22． 2
Total 71 26 36． 6
注:1 为老芒麦;2 为紫芒披碱草;3 为正交 F1 代;4 为反交 F1 代;
5 为 L-BC1;6 为 Z-BC1。
图 2 供试材料部分引物 ISSＲ 扩增结果
2． 3 材料间亲缘关系聚类分析
遗传距离(GD)表示 2 个材料间的遗传差异程度，
GD值愈大表明遗传背景差异性越强，亲缘关系越远。
供试材料的遗传距离范围在 0． 230 8 ～ 0． 659 1 之间，
平均距离为 0． 36，说明供试材料间遗传基础较宽(表
3)。其中 Z-BC1 与老芒麦之间遗传距离仅为 0． 230 8，
亲缘关系最近;老芒麦与紫芒披碱草之间遗传距离达
到0． 659 1，亲缘关系最远，表明亲本间遗传背景具有
较强的差异性。
表 3 供试材料的遗传距离矩阵
试验材料 A B C D E
B 0． 659 1
C 0． 410 3 0． 568 2
D 0． 545 5 0． 387 8 0． 454 5
E 0． 314 3 0． 625 0 0． 514 3 0． 625 0
F 0． 230 8 0． 568 2 0． 538 5 0． 431 8 0． 428 6
注:A为老芒麦;B为紫芒披碱草;C为正交 F1 代;D为反交 F1 代;
E为 L-BC1;F为 Z-BC1。
注:A为老芒麦;B为紫芒披碱草;C为正交 F1 代;
D为反交 F1 代;E为 L-BC1;F为 Z-BC1。
图 3 供试材料的 ISSＲ聚类图
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研究报告 李小雷 等:老芒麦和紫芒披碱草及其杂种 F1 代与 BC1 代的 ISSＲ分析
从图 3 可知，当遗传距离为 0． 50 时，供试的 6 个
材料明显地划分为 2 个类群，一类群含有老芒麦、正交
F1 代、L-BC1、Z-BC1。另一类群含有紫芒披碱草、反交
F1 代，各类群内供试材料亲缘关系较近，类群之间遗
传关系较远，回交 BC1 代偏向四倍体老芒麦遗传，表
明回交后代与轮回亲本老芒麦有较近的遗传关系。
3 讨论与小结
ISSＲ分子标记具有很好的多态性、可重复性和稳
定性，且不受样品生长发育时期、基因是否表达及环境
的影响。能从 DNA 水平上检测个体间的遗传差异性
和相似性，被认为是研究物种亲缘关系及种质资源鉴
别的有力工具［16-21］。本试验从 90 条 ISSＲ 引物中筛选
出 8 条适宜引物对 6 份材料进行扩增和检测，共扩增
出位点 71 个，其中多态性位点为 26 个，多态性位点百
分率为 36． 60%，结果表明，亲本与杂交后代间的 ISSＲ
位点多态性较丰富，不同引物得到的多态性位点比率
不同，且同一引物对 6 份供试材料扩增出的谱带其数
目、大小及位置等存在明显差异，ISSＲ 可作为遗传标
记用于杂种鉴定和回交后代目标性状植株选择。
各供试材料的遗传距离分布范围在 0． 230 8 ～
0． 659 1之间，遗传距离最大为亲本老芒麦与紫芒披碱
草，最小为 Z-BC1 与老芒麦;以遗传距离(GD)0． 50 为
基准，将供试材料划分为两类:第一类为老芒麦、正交
F1 代、L-BC1、Z-BC1。第二类为紫芒披碱草、反交 F1
代。利用 ISSＲ 标记技术从分子水平上揭示 6 份供试
材料的亲缘关系，这将为杂种后代的选育提供理论
依据。
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