全 文 ：22卷 10期 草　业　科　学 31　
Vol. 22 , No. 10 PRAT ACULT URA L SCIENCE 10 /2005
披碱草和野大麦及其杂种 F1 与
BC1 代的 RAPD分析
李造哲1 ,云锦凤1 ,尹 俊2
(1. 内蒙古农业大学生态环境学院 ,内蒙古呼和浩特 010019;2. 内蒙古农业大学生物工程学院 ,内蒙古呼和浩特 010019)
摘要:应用 RAPD技术对披碱草 Elymus dahuricus和野大麦 Hordeum brev isubulatum 及其杂种 F1 与 BC1
代的遗传差异性进行了研究。结果表明 ,各供试材料基因组 DNA 具有很高的多态性;依据遗传相似系数 ,
亲本披碱草和野大麦之间的遗传差异较大 ,正 、反交杂种 F1 均偏向披碱草遗传 , 正 、反交 F 1 间的遗传差异
不显著 , BC1 代偏向轮回亲本野大麦遗传 , 不同株系间存在遗传差异。 RAPD技术可用于禾草远缘杂种鉴
定及目标性状植株检测的遗传标记。
关键词:披碱草;野大麦;杂种 F 1 ;BC1 代;基因组 DNA;RAPD
中图分类号:S543+. 903. 51　　　文献标识码:A　　　文章编号:1001-0629(2005)10-0031-05
　披碱草 E lymus dahuricus 和野大麦 Hor-
deum brevisubulatum 是具有重要经济和生态价
值的国产小麦族多年生优良牧草。披碱草具有产
草量高 、抗旱能力强的特性 ,野大麦具有分蘖能力
强 、草质好 、耐盐碱等特性 。为了使二者的优良特
性综合在一起 ,培育出适合干旱 、盐渍生境的牧草
新品种(新类型),将披碱草和野大麦组合进行了
远缘杂交 ,成功地获得了高度不育的披碱草和野
大麦的正 、反交 F1 代 。杂种 F 1 代表现出很强的
杂种优势 ,具有很高的育种价值 。但由于杂种 F1
高度不育 ,限制了其遗传潜力的进一步发挥 。为
此 ,用回交法成功地获得了(披碱草×野大麦)×
野大麦和(野大麦×披碱草)×野大麦的回交一代
(BC1), BC1 的育性得到了恢复和提高[ 1] 。
RAPD (Random Amplif ied Polymorphic
DNAs 随机扩增多态性 DNA)是继 PCR 和
RFLP 技术之后发展起来的一种新的分子标记技
术[ 2] 。它能快速 、有效地检测 DNA 核酸序列的
多态性。RAPD技术具有简单易行 ,需要的 DNA
量极少 ,无放射性 ,实验设备简单 , 周期短的优
点[ 3] 。该技术已广泛用于植物种质资源鉴定与分
类 、遗传作图 、目标性状基因的标记和辅助选择等
方面的研究[ 4-11] 。对披碱草和野大麦及其杂种 F1
和 BC1进行 RAPD 分析研究 , 旨在从基因组
DNA 分子水平分析亲本及杂交后代间的遗传差
异性和相似性 ,为品种培育提供依据。
1　材料与方法
1. 1 材料　供试材料种植在内蒙古农业大学牧
草试验站内 ,详见表 1 。
表 1　供试材料
编号 材料名称 编号 材料名称
1 披碱草 12 P-BC1 - 8
2 野大麦 13 P-BC1 - 9
3 披碱草×野大麦(F 1) 14 Y-BC1 - 1
4 野大麦×披碱草(F 1) 15 Y-BC1 - 2
5 P-BC1 - 1 16 Y-BC1 - 3
6 P-BC1 - 2 17 Y-BC1 - 4
7 P-BC1 - 3 18 Y-BC1 - 5
8 P-BC1 - 4 19 Y-BC1 - 6
9 P-BC1 - 5 20 Y-BC1 - 7
10 P-BC1 - 6 21 Y-BC1 - 8
11 P-BC1 - 7 22 Y-BC1 - 9
　注:“ P-BC1”表示(披碱草×野大麦)×野大麦回交一
代 , “ Y-BC1”表示(野大麦×披碱草)×野大麦回交
一代;数字表示株系 ,如“ P-BC1 - 2”表示(披碱草×
野大麦)×野大麦的第 2 个株系。
1. 2 方法
1. 2. 1基因组 DNA 的提取　基因组 DNA 的提
取参照 Clark[ 12]的 CTAB法 ,稍作改进 。
收稿日期:2004-10-09　修回日期:2005-01-25
基金项目:国家自然科学基金资助(30260074)
作者简介:李造哲(1962-), 男 ,内蒙古包头人 , 副教授 ,
博士。
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a. 取 0. 5 g幼叶切碎放在预冷的研钵中 ,加液
氮 ,迅速研磨成粉末 ,装入 5 mL 离心管中;b. 加入
2 mL 预热至 90 ℃的 CTAB 提取液 , 65 ℃保温
90 min ,不时颠倒混匀;c. 加 2 mL 氯仿异戊醇
(24∶1),4 ℃,5 000 g 离心 10 min ,取上相;d. 加
入0. 6 倍体积的异丙醇( - 20 ℃), 颠倒混匀 ,
5 000 g离心5 min;e. 弃上清液 ,加 1 mL 65 ℃的
CTAB 提取液 ,温浴 30 min;f. 等体积氯仿 - 异戊
醇抽提 1次 , 5 000 g 离心 5 min;g. 取上清液到
Eppendorf管中 ,加 2 /3 体积异丙醇 ,颠倒混匀 ,室
温下静置 10 min ,挑出絮状沉淀 DNA。h. 加 70%
乙醇 500 μL 洗 2次;i. 超净台风干;j. 200 μL TE
回溶 ,4 ℃冰相保存备用;k. 取少量 DNA样品 ,用
0.7%Agarose凝胶电泳检测DNA纯度及含量。
1. 2. 2引物筛选　采用美国 Operon公司和上海
生物工程公司(Sangon)的引物 ,从 20 个引物中
筛选出重复性好 , 适宜于各供试植物的引物 10
个 ,见表 2。
表 2　引物及序列和扩增结果 条
引物 序列 总扩增带数
多态性
扩增带数
E02 5CCCAAGGTCC3 7 6
F06 5GGGAATTCGG3 9 6
F07 5CCGATATCCC3 9 7
F13 5GGCTGCAGAA3 11 9
S52 5CACCGTATCC3 9 8
S67 5GTCCCGACGA3 7 6
S71 5CAAGCTGCGG3 6 5
S75 5GACGGATCAG3 11 10
O01 5GGCACGTAAG3 9 9
O05 5CCCAGTCACT3 7 5
总计 85 71
1. 2. 3 RAPD反应体系　 RAPD-PCR扩增反应
总体积为 25 μL , 10 ×Buffer 为 2. 5 μL , dNTPs
(10 mmol /L)为 0.25 μL , Mg2+(25 mmol /L)为
2μL , Taq 酶 (5 u /μL )为 0. 24 μL ,引物为 1 μL ,
模板 DNA(20 ng /μL)为 1μL ,ddH2O补足 25μL。
1. 2. 4反应程序　94 ℃预变性 3 min , 再以94 ℃
1 min , 37 ℃复性 1 min , 72 ℃延伸 1. 5 min进行
45个循环 ,最后72 ℃补平5 min , 4 ℃停止。扩增
反应在美国 MJ公司生产的 PTC-100MT 热循环
仪上进行 。
1. 2. 5扩增产物的分离和检测　DNA 扩增产物
在0. 5×TBE(40 mM tris-硼酸 ,2 mM EDTA ,pH
值 8. 0)缓冲介质中 ,用 1. 5%Agaro se 凝胶电泳
分离 ,以λDNA /H ind Ⅲ酶切片段作分子量标记
(Marker)。用 ddH 2O 代替模板 DNA 同时电泳
作负对照。稳压 100V ,电泳约 2 h左右。在紫外
线检测仪上观察并照相记录。
1. 2. 6数据处理　每个样品的扩增条带按有或无
记录 ,有带赋值为 1 ,无带赋值为 0 ,按 Nei[ 13] 的方
法计算材料间的相似系数(Genetic Similarity):
GS(i , j) =2N(i , j) /[ N(i)+N(j)]
其中 ,GS(i , j)是遗传相似系数 , N(i , j)是材料 i
和材料 j 共同具有的带数;N(i)是材料 i的带数 ,
N(j)是材料 j 的带数 。
2　结果与分析
用筛选出的 10个引物扩增出带谱清晰并呈
多态的 RAPD带型 ,共产生 85条扩增产物(表 2 、
图 1 、图 2)。不同引物的扩增带数变幅为 6 ～ 11
条 ,85条扩增产物中 71 条(83. 5%)具有多态性。
各供试材料扩增的 RA PD总带数为 48 ～ 60 ,各引
物带数变化幅度为 2 ～ 9条 ,平均每引物的带数范
围为 4. 7 ～ 6. 0 , 22 种供试材料扩增的带数总计
1 165条 , RAPD 片段长度为 350 ～ 3 600 bp(表
3)。同一材料不同引物扩增的 DNA 片段数目 、
大小 、位置及强弱等均不相同 ,不同材料同一引物
扩增的 DNA 片段数目 、大小及位置亦有明显差
异 ,这表明供试材料基因组 DNA 具有很高的多
态性 ,遗传变异较大 。
由表 4可知 ,亲本披碱草和野大麦的遗传相
似系数为 0. 447 ,表明 2个亲本的遗传差异较大。
披碱草与正交 F1(披碱草×野大麦)和反交 F 1(野
大麦×披碱草)的遗传相似系数分别为 0. 771和
0. 706 ,野大麦与正交 F 1 和反交 F1 的遗传相似系
数分别为 0. 610和 0. 631 ,这表明 F1 代偏向披碱
草遗传。BC1 代与披碱草的遗传相似系数为
0. 484 ～ 0.704 , BC1 代与野大麦的遗传相似系数为
0. 655 ～ 0.827 ,说明 BC1 代偏向轮回亲本野大麦遗
传。BC1 代株系间的遗传相似系数为 0. 627 ～
0. 865 ,表明BC1代的遗传变异较大。
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图 1　引物 001扩增的 PAPD 图谱
　注:M 为 Marker , N 为负对照 , 1 , 2 , 3…为材料编号 ,下同。
图 2　引物 005 扩增的 RAPD图谱
表 3　供试材料基因组 DNA扩增带统计结果
编号 材料 总带数(条) 带数变幅(条) 引物的平均带数(条) DNA 片段长度(bp)
1 披碱草 47 3 ～ 8 4. 7 350～ 3 000
2 野大麦 56 3 ～ 9 5. 6 350～ 3 300
3 披碱草×野大麦 49 3 ～ 7 4. 9 350～ 3 300
4 野大麦×披碱草 55 4 ～ 7 5. 5 350～ 3 300
5 P-BC1 - 1 51 4 ～ 7 5. 1 350～ 3 000
6 P-BC1 - 2 59 4 ～ 8 5. 9 350～ 3 300
7 P-BC1 - 3 52 2 ～ 8 5. 2 350～ 3 000
8 P-BC1 - 4 58 5 ～ 7 5. 8 350～ 3 000
9 P-BC1 - 5 49 3 ～ 6 4. 9 350～ 3 300
10 P-BC1 - 6 48 4 ～ 8 4. 8 350～ 3 000
11 P-BC1 - 7 48 3 ～ 8 4. 8 350～ 3 000
12 P-BC1 - 8 60 3 ～ 8 6. 0 350～ 3 000
13 P-BC1 - 9 51 2 ～ 9 5. 1 350～ 3 500
14 Y-BC1 - 1 51 2 ～ 9 5. 1 350～ 3 500
15 Y-BC1 - 2 53 4 ～ 8 5. 3 350～ 3 000
16 Y-BC1 - 3 53 4 ～ 8 5. 3 350～ 3 000
17 Y-BC1 - 4 50 3 ～ 6 5. 0 350～ 3 000
18 Y-BC1 - 5 54 4 ～ 8 5. 4 350～ 3 300
19 Y-BC1 - 6 54 3 ～ 7 5. 4 350～ 3 000
20 Y-BC1 - 7 58 4 ～ 8 5. 8 350～ 3 600
21 Y-BC1 - 8 54 4 ～ 8 5. 4 350～ 3 600
22 Y-BC1 - 9 55 4 ～ 8 5. 5 360～ 3 600
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3　讨论与结论
3. 1 同一引物对不同材料及不同引物对同一材料
扩增出的产物其数目 、大小及位置等带型特征存
在明显差异 ,各供试材料基因组 DNA 具有很高
的多态性 ,多态性位点达 83. 5%。披碱草 、野大
麦及其杂种 F 1 和 BC1 代基因组 DNA 与各引物
结合位点数平均为 5. 3 个 , 10 个引物共扩增出
1 665个 DNA 片段 ,长度范围在 350 ～ 3 600 bp 。
3. 2 依据遗传相似系数 ,亲本披碱草和野大麦之
间的遗传差异相对较大 ,杂种 F 1 偏向披碱草遗
传 ,正反交 F 1 间的遗传差异不显著 , BC1 代偏向
轮回亲本野大麦遗传 ,不同株系间遗传变异较大。
3. 3 研究利用 10个引物共产生 85条 RAPD 扩
增带 ,虽然所用的引物不多 ,但能从 85 个位点对
供试的 22 个材料进行检测 ,这种效率是形态特
征 、细胞学特性及同工酶标记等方法所无法比拟
的。RAPD直接研究控制物种生长发育的遗传物
质 DNA ,抓住了生命最本质的物质基础 ,它标记
的性状数目不受限制 ,不受生长发育时期和环境
的影响 ,因而能更可靠而真实地反应出亲本及杂
交后代的遗传差异 ,在杂种鉴定及其群体中目标
性状植株的检测等方面有重要的实际应用价值。
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RAPD Analysis of Elymus dahuricus , Hordeum brevisubulatum , Their Hybrid F1 and BC1
LI Zao-zhe1 ,YUN Jin-feng1 ,YIN Jun2
(1.College o f Ecolo gy and Environmental Science , Inner Mongolia Ag ricultural University ,
Hohhot 010019 , China;2.Co lleg e of Bio-engineering , Inne r M ongolia Ag ricultural
U niversity , Hohho t 010019 ,China)
Abstract:The genetic dif ferences among E lymus dahuricus , Hordeum brev isubulatum , thei r hybrid F1
and BC1 were invest igated by using RAPD technique. The results show ed that the genomic DNA in
tested materials had plentiful polymorphisms;the genetic dif ferences betw een E. dahuricus and H.
brev isubulatum were rela tively great , both E. dahuricus×H. brevisubulatum F1 and H. brevisubula-
tum ×E. dahuricus F 1 tended to inheri t tow ard E. dahuricus , the genetic differences betw een E.
dahuricus×H. brev isubulatum F 1 and H. brev isubulatum×E. dahuricus F1 were not significant , BC1
tended to inherit tow ard recur rent parent H. brevisubulatum , there w ere dif ferences in gene among
BC1 lines;RA PD technique can be used to identify hybrid and to de tect the plants wi th object t rai ts.
Key words:E lymus dahuricus;Hordeum brevisubulatum ;hybrid F1 ;BC1 ;genomic DNA;RAPD