全 文 ：收稿日期:1999-06-17;修回日期:2000-02-24
基金项目:国家“八六三”高技术基金项目(101-04-03-03)
作者介简:李连城(1956-),女 ,汉族 ,高级实验师 ,专业方向:生物实验技术。
自Scalenghe等[ 1]首次将染色体显微切割与微克
隆技术在果蝇唾腺染色体上取得成功 , 这项技术很
快被应用到动物及人类的染色体研究上 , 并取得了
很大的进展[ 2 ,3] 。该技术被移植到植物上 ,目前 ,已在
甜菜[ 4] 、大麦[ 5] 、小麦[ 6] 、黑麦[7] 、燕麦[8]的遗传图谱
的绘制 、特异性探针的筛选 、染色体原位杂交等方面
取得许多很有价值的成果。
小麦黄矮病是由大麦黄矮病毒 (barley yellow
dwarf vi rus BYDV)引起的小麦主要病害之一 。防治小
麦黄矮病的有效措施是选育耐病抗病品种。异附加
系 Z2 (2n=44)是通过普通小麦与小麦-中间偃麦
草(Thinopyrum intermedium , 2n=42 ,E1E1E2E2XX)部
分双二倍体无芒中 4 (2 n=56)杂交 、回交选育而
成[ 9] ,高抗黄矮病。由于 Z2的小麦亲本宛 7 107不抗
BYDV , 说明 Z2的抗 BYDV基因来自附加的中间偃
麦草染色体 。同工酶及 RFLP分析证实 Z2的外源染
色体属第二部分同源群的 2Ai-2染色体[ 10] 。因此 ,
分离 2Ai-2染色体 , 建立其染色体 DNA文库 , 将为
筛选与 BYDV抗性基因紧密连锁的分子标记和为进
一步分离抗黄矮病基因奠定基础。
1 材 料 和方 法
1.1 材料
选用中间偃麦草染色体附加系 Z2(2n=44)与
遗 传 HEREDITAS(Beijing)22(4):197 ～ 200 2000 研究报告
中间偃麦草单条染色体分离及体外扩增
李连城 1 ,何聪芬 1 , 2 ,徐琼芳 1 ,马有志 1 ,辛志勇 1
(1.中国农业科学院作物育种栽培研究所农业部作物遗传育种重点开放实验室, 北京 100081;
2.河北师范大学生物系 , 石家庄 050016)
摘 要:本研究利用微细玻璃针法从减数分裂中期 I的花粉母细胞中分离回收了携带小麦抗黄矮病基因的中间偃麦
草染色体 2Ai-2。将目标染色体放入装有蛋白酶 K消化液的 0.5ml小离心管中 ,用 Sau3AI酶切 ,在 DNA片段的末端
连接接头后 ,进行 PCR扩增。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析 ,DNA片段的大小在 150 ～ 3000bp之间 ,而大部分集中在
200 ～ 1500bp之间 。
关键词:染色体;微分离;LA-PCR;中间偃麦草
中图分类号:Q813.4 文献标识码:A 文章编号:0253-9772(2000)04-0197-04
Microisolation and Amplification in vitro of Single
Th.intermedium Chromosome
LI Lian-cheng ,HE Cong-fen ,XU Qiong-fang , MA You-zhi ,XIN Zhi-yong
(1.Institute of CropBreeding and Culture , CAAS , Bejing 100081 , China;
2.Biology Department of Hebei Normal University , Sijiazhuang050016 , Chian)
Abstract:A simple method was used to adapt refined needles for the collection of Th.intermedium 2Ai-2 chromo-
some carrying BYDV (barley yellow dwarf virus)resistance gene from meiosis-metaphase spreads .The aimed
chromosome was put into a 0.5ml Eppendorf tube , deproteinized with proteinase K , digested wi th Sau3AI , and
link-adaptors were ligated to the ends of the DNA fragments.After amplification by PCR , size distributions of
the PCR products were analyzed by agarose gel electrophoresis and smears of DNA were revealed that the size
ranged from 150bp to 3000bp with predominant fragments at about 200 ～ 1500bp.
Key words:chromosome;microisolation;LA-PCR;Th.intermedium
DOI :10.16288/j .yczz.2000.04.001
198 22卷遗 传 HEREDITAS (Beijing)2000
72℃ 5min↑
96℃ 1min↑
94℃ 1min
62℃2min 72℃2min 30个循环后 , 72℃延
伸 5min
普通小麦品种宛 7107的杂种 F1为实验材料。
1.2 方法
1.2.1 染色体标本的制作
取供试材料于减数分裂中期 Ⅰ或后期 Ⅰ的小
穗 , 用新配制的卡诺固定液 (95%酒精∶冰醋酸=
3∶1)固定 15 min后 ,70%酒精 4 ℃保存 。剥离出花
药放入酶解液中 (2.0%纤维素酶和 2.5%果胶酶)
37℃酶解 0.5 ～ 1 h , 在蒸馏水中低渗 10 ～ 30 min , 置
于载片上直接压片 , 在相差显微镜(Olympus BH)下
镜检 , 取合适分裂相的染色体标本用液氮迅速冷冻
揭片 , 立即用于染色体分离或置于-20℃冰箱内短
期保存。
1.2.2 微细玻璃针的制作
医用采耳血的毛细玻璃管在竖式拉针仪
(NARISHIGE MODEL PB-7)上 , 拉成 1μm左右的微
细玻璃针 , 在微弱的酒精灯上将针尖端部分弯成约
120度角;或用手工拉制玻璃针 , 在微弱的酒精灯上
将毛细玻璃管加热迅速拉成微细玻璃针 。
1.2.3 染色体显微分离
将显微操作系统(NARISHIGH MO202)安装在倒
置显微镜(Olympus IMT2)上 , 微细玻璃针固定于显
微操作臂上。取已制好的染色体标本在 20倍物镜 、
20倍目镜下选取所需分裂相。找到目标染色体 , 用
自制的微细玻璃针挑取目标染色体 , 将粘在微细玻
璃针上的染色体连同针尖一同折断于装有蛋白酶 K
的小离心管中 ,放入 4℃冰箱备用 。
1.2.4 染色体 DNA消化
向内含单条染色体的 0.5ml离心管内加入 10μl
蛋白酶 K反应液 ,蛋白酶 K反应液包括下列成分:
1%detergent(10μl Tween20+990μl H2O) 4.5μl
MgCl2 (2.5mmol/ L) 1μl
10×Buffer(100mmol/ L Tris-HCl pH=8.3 , 50mmol/ L KCl) 1μl
蛋白酶K(10mg/ L) 1μl
灭菌超纯水 2.5μl
合计 10μl
55℃保温 3h, 95℃10min蛋白酶 K灭活。
1.2.5 分离的染色体 DNA酶切
向上述 DNA混合液中加入 2～ 4U的 Sau3AI ,
DNA混合液 10μl
10×Buffer 1μl
Sau3AI(4U/μl) 1μl
合计 12μl
37℃保温 6小时左右 , 70℃30分钟 Sau3AI酶灭活。
1.2.6 连接接头
引物设计:染色体 DNA经 Sau3AI酶切后 ,每个
DNA片段都带有 GATC末端。为了从切割的染色体
中较为全面的扩增出 DNA片段 , 设计的两个引物配
对后形成的末端必须能与染色体 DNA的末端配对 ,
我们根据引物合成的原则 ,合成了两个引物
引物 I:5CGGGAA TTCTGG CTCTGCGACATG 3
引物 II:3CTGTACCTAG 5
制备接头:将引物 I ,引物 II等浓度(约 30pmol/
μl)等体积混合 , 58℃保温 3小时 ,形成接头 。
连接接头:在上述酶切的染色体 DNA混合液
中 ,加入接头和 T4 DNA连接酶 , 15℃下连接 2 h。
酶切后的DNA混合液 12μl
引物I(29.5pmol/μl) 8μl
接头(29.5pmol/μl) 4μl
10×Buffer 3μl
T4DNA连接酶(2U/μl) 3μl
合计 30μl
1.2.7 PCR扩增
(1)第一轮 PCR扩增
在上述连接好的染色体 DNA混合液中 ,加入下
列成分
DNA混合液 30μl
dNTP(2.5mmol/ L) 8μl
10×Buffer 5.5μl
MgCl2(15mmol/ L) 10μl
Taq酶(1U/μl) 1μl
合计 54.5μl
按下列程序进行第一轮 PCR扩增:
(2)第二轮 PCR扩增
反应体系:
引物I(29.5pmol/μl) 2μl
dNTPs(2.5mmol/ L) 2μl
MgCl2(25mmol/ L) 3μl
10×B缓冲液 5μl
第一次PCR扩增产物 2μl
Taq酶(1U/μl) 1μl
加水至 50μl
1994期
94℃ 1min↑
94℃ 1min
55℃2min 72℃2min 35个循环后 , 72℃延
伸 5min
李连城等:中偃麦草单条染色体分离及体外扩增
反应程序:
PCR扩增产物的检测:取 5μl PCR扩增产物在
1.2%琼脂糖凝胶电泳 , 溴化乙锭染色 , 紫外成像系
统观察。
1.2.8 基因组 DNA的提取及 Southern杂交分析
取中间偃麦草新鲜幼嫩的叶片提取基因组
DNA ,用 EcoRI酶切与第二轮 PCR产物一起电泳 ,经
EB染色 ,紫外观察 。电泳后的 DNA经 Southern转移
至 Hybond+尼龙膜上 , 然后用 [ 32P] 标记的基因组
DNA探针杂交 。
2 结 果与 讨论
为了便于识别和分离 2Ai-2染色体 , 以 Z2作
母本与其普通小麦亲本宛 7107杂交 , F1在减数分裂
过程中期 I 呈单价体状态或在后期 I 落后的染色
体 , 即为目标染色体(图 1)。 因此 , 我们选用花药
为材料准备染色体显微分离的标本 , 这样即可准确
判断出目标染色体 。分离回收染色体的先决条件是
目标染色体游离于其他染色体之外 , 细胞质背景干
扰少 。本实验采用压片法 ,容易使染色体分散 ,但在
分离目标染色体时仍易受到细胞质的干扰 , 往往会
连带下细胞质及其他染色体 。为此 , 我们采用酶解
法去壁低渗 ,使细胞壁完全溶解掉 ,细胞质减少到最
低程度 , 以确保分离的目标染色体不被污染 。另外
由于压片需垂直用力 ,使盖片和载片紧密相贴 ,而使
得染色体紧贴载片 , 太细的玻璃针推不动染色体 。
因此在制备玻璃针的方法上我们采用手工拉针 , 控
制针尖的长短和粗细。切割前 , 在显微镜下根据染
色体所处的方位和大小 , 将微细玻璃针的尖端部分
在适当位置截断 , 然后对准目标染色体将其完整的
分离下来 。这样就解决了针尖太细推不动染色体或
只能刮取部分染色体的问题(图 3)。
由于制作的染色体标本不是用于染色体行为分
析 ,而是显微分离某一染色体 ,所以必须保证所分离
染色体处于 “完整” 状态。预处理过程中材料的固
定 、 标本制作过程中酸水解或纤维素酶和果胶酶的
去壁以及染色体染色 , 都会不同程度地导致 DNA化
学结构的变化而影响所建文库的完整性和准确性。
为此 , 我们将花药固定时间从原来的 1 ～ 2 h缩短为
15 min以内;标本制作采用纤维素酶和果胶酶轻度
酶解 、不染色等措施以尽量减少对染色体 DNA的损
伤 , 使染色体标本适宜于染色体显微分离和随后的
DNA扩增。
2Ai-2染色体 DNA及阳性对照经 LA-PCR的第
一次扩增后得到了微弱的扩增信号(未显示), 阴性
对照无任何信号 。第二次扩增产物显示为 0.5 ～ 3kb
的较强连续带 , 其中有些区域要明显亮于其他部
分 。阳性对照也有信号较强的连续带 , 但亮度比较
均匀 , 长度范围也较前者为大 。阴性对照仍无扩增
信号(未显示)(图 4)。以中间偃麦草基因组 DNA为
探针进行 Southern 杂交表明 , 杂交所得带型与电泳
结果完全相符 , 证明上述 PCR扩增产物来自中间偃
麦草基因组 , 以单个染色体为底物进行 LA-PCR是
可行的 。
本实验室已利用紫外激光扫描共聚焦系统对染
色体进行切割 、分离 , 并通过 PCR DNA扩增建立了
相应的 DNA文库 , 方法简单易行[11 ,12] 。但需要紫外
激光扫描共聚焦系统及特制的培养皿 , 在目前的研
究水平很难普及应用 。本实验结果显示(图 4)利用
激光切割的产物与微细玻璃针分离的产物扩增结果
基本一致。微细玻璃针对单条染色体分离和扩增的
成功为我们将两种方法结合起来分离小的目标染色
体片段奠定了工作基础。
Wang 等(1992)利用流式细胞分类器来分离染
色体并建立了小麦单条染色体的 DNA文库[ 13] 。但此
项技术有一些不足之处 , 即不能分离大小相似和
DNA含量相近的染色体 ,故建立的染色体 DNA文库
污染率(含其它染色体 DNA)较高。Jung 等(1992)[ 4] 、
Schondelmaier等(1993)[ 5]利用微细玻璃针法 ,分别建
立了甜菜(Beta patellaris)和大麦(Hordeum vulgare)特
定染色体或染色体区域的 DNA文库。但这些文库中
插入片段的平均长度很小 ,仅 250bp左右 ,因此限制
了它们在 RFLP作图上的应用 。在我们的试验中 ,利
用微细玻璃针分离了携带抗黄矮病基因的单条染色
体 ,并通过 LA-PCR(link-adaptor PCR)进行了扩增 ,扩
增片段较大 (图 4 , 100 ～ 3000bp , 多数在 200 ～
1500bp)。大片段的扩增产物有利于构建覆盖率较高
的 DNA文库及建库以后的标记筛选和应用 。利用
LA-PCR扩增有可能构建一个功能性较强的特异性
DNA文库 ,进一步的工作正在进行中 。
200 22卷遗 传 HEREDITAS (Beijing)2000
图 1 Z2×宛 7107 F1 减数分裂中期 I ,染色体构型 21 Ⅱ+1 Ⅰ
图 2 玻璃针指向呈单价体状态的中间偃麦草染色体
图 3 利用微细玻璃针分离回收后 ,箭头所示原中间偃麦草染色体位置(已被分离)
图 4 单条染色体DNA PCR扩增产物 , M:分子量 marker(λDNA/Hind Ⅲ+EcoRI);1.利用微细玻璃针分离回收的 PCR
扩增产物;2.3.利用激光切割回收的 PCR产物;4.空白对照;5.阳性对照 ,酶切的基因组 DNA。
参 考 文 献:
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