全 文 ：收稿日期:2015-03-14
基金项目:2011 年度温岭市第一批科技计划项目(2011WLCA0053)
作者简介:郭君宾(1973-) ，男，副主任医师，主要从事血液病及恶性肿瘤治疗研究;Tel:0576-86206618，E-mail:gjb_1973@ 163. com。
蒲公英提取物抗人肝癌细胞 HepG2 增殖的作用及机制研究
郭君宾，叶海虹，陈剑峰
(温岭市第一人民医院血液肿瘤内科，浙江 温岭 317500)
摘要 目的:研究蒲公英提取物抗人肝癌细胞 HepG2 增殖的作用及机制。方法:采用体外培养的人肝癌细胞
HepG2 为研究对象，HepG2 细胞经蒲公英提取物处理后，通过 MTT 比色法研究蒲公英提取物抗 HepG2 细胞增殖的
作用;通过Western Blot检测线粒体介导癌细胞凋亡相关蛋白(Survivin、Mcl-1、BCL-xL、BCL-2、Smac、BAX、Bad、Cyto-
chrome c及 Caspase-3 /7 /9)的表达，对其抗 HepG2 细胞增殖的机制进行研究。结果:蒲公英提取物能明显抑制
HepG2 细胞增殖;能显著抑制 HepG2 细胞中抗凋亡蛋白(Survivin、BCL-xL和 BCL-2)的表达，促进促凋亡蛋白(Smac
和 Caspase-3 /7 /9)的表达，促进 Cytochrome c从线粒体释放到细胞质中。其作用呈浓度依赖性。结论:蒲公英提取
物能明显抑制 HepG2 细胞增殖，其机制与线粒体介导的癌细胞凋亡相关。
关键词 蒲公英;线粒体凋亡途径;MTT;蛋白质印迹;HepG2
中图分类号:Ｒ285. 5 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2015)10-2129-05
DOI:10. 13863 / j. issn1001-4454. 2015. 10. 028
Anti-proliferation Effect of Taraxacum mongolicum Extract in HepG2 Cells and Its Mechanism
GUO Jun-bin，YE Hai-hong，CHEN Jian-feng
(Department of Blood and Oncology，The First Peoples Hospital of Wenling，Wenling 317500，China)
Abstract Objective:To study the anti-proliferation effect of Taraxacum mongolicum extract in HepG2 cells and its mechanism．
Methods:The total proteins of HepG2 cells treated with Taraxacum mongolicum extract were extracted and mitochondria-mediated apop-
tosis-related proteins(Survivin，Mcl-1，BCL-xL，BCL-2，Smac，BAX，Bad，Cytochrome c and Caspase-3 /7 /9)were detected by Western
blot. Ｒesults:Taraxacum mongolicum extract obviously inhibited the proliferation of HepG2 cells and the expression of anti-apoptotic
proteins(Survivin，BCL-xL and BCL-2) ，increased the expression of pro-apoptotic proteins(Smac and Caspase-3 /7 /9) ，and promoted
the release of Cytochrome c from mitochondria to cytoplasm in HepG2 cells. The effects were in a dose-independent mode. Conclusion:
Taraxacum mongolicum extract can inhibit the proliferation of HepG2 cells and the anti-proliferation mechanism is related to mitochon-
dria-mediated apoptosis.
Key words Taraxacum mongolicum Hand. -Mazz.;Mitochondrial apoptosis pathway;MTT;Western blot;HepG2 cells
蒲公英 Taraxacum mongolicum Hand. -Mazz. 为
菊科蒲公英属植物，其味苦、甘，性寒;归肝、胃
经〔1〕。根据中医药归经理论，蒲公英可能主要对
肝、胃等脏器起作用。
癌症严重危害着人类健康，目前世界上因病死
亡的总死亡率中，癌症仅次于心血管疾病，位居第
2;而肝癌在癌症中又是具有较高死亡率的一种，居
癌症致死率的第 3 位〔2〕。清热解毒是中药治疗肿瘤
的常用治法之一〔3〕。蒲公英属于清热解毒药，加上
其具有消肿散结的功效，近年来有许多学者对蒲公
英的抗肿瘤作用进行了研究，发现蒲公英提取物在
体内外均具有抗肿瘤作用〔4-7〕。蒲公英主要归肝经，
但对其抗肝癌作用的研究报道较少，且已有报道大
多集中在表浅的研究，未能对其作用机制进行阐述。
故本研究将以蒲公英全草提取物为研究材料，以人
肝癌细胞 HepG2 为研究对象;通过四甲基偶氮唑蓝
(MTT)比色法研究蒲公英全草提取物对 HepG2 细
胞增殖的影响;通过蛋白质印迹法(Western Blot) ，
研究蒲公英全草提取物对线粒体介导癌细胞凋亡的
相关蛋白表达的影响，从线粒体介导癌细胞凋亡角
度来探讨蒲公英提取物的抗肝癌机制。
1 材料与仪器
1. 1 细胞株 人肝癌细胞 HepG2，购自美国模式培
养物保藏所。
1. 2 药物与试剂 蒲公英购自中药材天地网，经
温岭市第一人民医院药剂科孔凤利副主任药师鉴定
为菊科蒲公英属植物蒲公英 Taraxacum mongolicum
Hand. -Mazz. 的干燥全草;ＲPMI-1640 培养基和胎牛
血清购自美国 Invitrogen;MTT购自北京索莱宝科技
有限公司(索莱宝，中国) ;Mcl-1、BCL-xL 及 Bad 的
一抗和二抗(山羊抗兔)购自美国 Cell Signaling
Technology;Smac、BAX 及 Cytochrome c 的一抗和二
·9212·Journal of Chinese Medicinal Materials 第 38 卷第 10 期 2015 年 10 月
抗(山羊抗兔)购自英国 Abcam;Survivin、BCL-2、
Caspase-3 /7 /9 和 β-actin 蛋白检测的一抗和二抗
(山羊抗兔)购自英国 Jackson Immuno Ｒesearch La-
boratories。
1. 3 主要仪器 3110 型细胞培养箱(美国 Thermo
Scientific) ;多孔酶标仪(美国 Bio-tech) ;165-8001 电
泳槽、Chemi Doc XＲS 凝胶成像系统(美国 Biorad)。
2 方法
2. 1 蒲公英提取物的制备 蒲公英药材加 4 倍量
水煎煮 3 次，合并水煎液，减压浓缩后喷雾干燥制成
粉末，得率为 85%。
2. 2 细胞培养 HepG2 细胞置于含 10%胎牛血
清、100 U /mL 链霉素、100 U /mL 青霉素的 ＲPMI-
1640 培养基中，置于饱和湿度，37 ℃、5% CO2 恒温
培养箱中进行培养。待 HepG2 细胞到达对数期时
进行继代培养，然后进行相应的处理，开始实验。
2. 3 实验分组与药物处理 将 HepG2 细胞分为对
照组和不同浓度蒲公英提取物处理组。不同浓度蒲
公英提取物处理组分别向培养基中加入用 0. 5%
DMSO溶解的蒲公英提取物，使其浓度分别为 1、2、4
μg /μL。对照组加入相同体积的 0. 5 % DMSO。
2. 4 MTT比色法 MTT比色法用来研究蒲公英提
取物对 HepG2 细胞增殖的影响。将 5 × 10
3 个
HepG2 细胞接种于 96 孔培养板上，培养 24 h。然后
采用蒲公英提取物处理培养的 HepG2 细胞 24 h。
随后，20 μL的 5 mg /mL MTT 分别加入每一个培养
孔中，培养 3 h;每孔加入 200 μL 的 DMSO，充分摇
匀;多孔酶标仪 490 nm处测定各孔的光密度 D(λ)
值。
抑制率(%)=
D(λ)对照组 － D(λ)实验组
D(λ)对照组
× 100%
2. 5 Western Blot HepG2 细胞经不同浓度蒲公英
提取物处理后，培养 24 h。用裂解液处理细胞，并收
集蛋白质，用增强 BCA 蛋白检测试剂盒(Beyotime，
China)检测蛋白质含量。然后，不同处理组的 40 μg
蛋白通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转移到 PVDF
膜上，PVDF 膜通过脱脂奶粉封闭 1 h。PVDF 膜用
TBST缓冲液漂洗 3 次后，利用相关蛋白的一抗 4 ℃
进行孵育过夜，TBST 缓冲液漂洗 3 次，加入相关蛋
白二抗，进行孵育 2 h。曝光成像，凝胶成像系统扫
描分析。分别计算各组各蛋白与 β-actin(内参)的
灰度比值，代表各组各蛋白的表达水平。
2. 6 统计学处理 数据以 珋x ± s 表示，利用 SPSS
21. 0 软件对数据进行单因素方差分析。以 P ＜ 0. 05
为差异有统计学意义。
3 结果
3. 1 蒲公英提取物对 HepG2 细胞增殖的影响 结
果如图 1 所示，蒲公英提取物能明显抑制 HepG2 细
胞增殖。蒲公英提取物 1、2、4 μg /μL 对 HepG2 细
胞的抑制率分别为 20. 28%、31. 17% 和 42. 87%。
其作用呈量效关系。
图 1 蒲公英提取物对 HepG2 细胞增殖的影响
A. 对照组 B. 蒲公英提取物 1 μg /μL 组 C. 蒲公英提取
物 2 μg /μL组 D. 蒲公英提取物 4 μg /μL组
3. 2 蒲公英提取物对 HepG2 细胞抗凋亡蛋白 Sur-
vivin、Mcl-1、BCL-xL和 BCL-2 表达的影响 结果如
图 2 所示，各浓度蒲公英提取物对 HepG2 细胞中的
抗凋亡蛋白 Mcl-1 的表达无明显影响。与对照组比
较，2、4 μg /μL 蒲公英提取物组 Survivin、BCL-xL、
BCL-2 蛋白表达显著降低(P ＜ 0. 05 或 P ＜ 0. 01) ，1
μg /μL蒲公英提取物组 Survivin、BCL-2 蛋白表达显
著降低(P ＜ 0. 05)。其作用呈量效关系。
3. 3 蒲公英提取物对 HepG2 细胞促凋亡蛋白
Smac、BAX、Bad表达的影响 结果如图 3 所示，各
浓度蒲公英提取物对 HepG2 细胞 BAX 和 Bad 表达
无明显影响。与对照组比较，蒲公英提取物各浓度
组 Smac蛋白表达显著升高(P ＜ 0. 01)。其作用呈
量效关系。
3. 4 蒲公英提取物对 HepG2 细胞促凋亡蛋白
Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9 表达的影响 结果
如图 4 所示，与对照组比较，蒲公英提取物各浓度组
Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9 蛋白表达显著升高
(P ＜ 0. 05 或 P ＜ 0. 01)。其作用呈量效关系。
3. 5 蒲公英提取物对 HepG2 细胞 Cytochrome c 释
放的影响 结果如图 5 所示，与对照组比较，蒲公英
提取物各浓度组 Cytochrome c(C)水平显著升高(P
＜ 0. 01) ，Cytochrome c(M)水平显著降低(P ＜
0. 01)。其作用呈量效关系。
4 讨论
MTT比色法是一种用于检测药物抗肿瘤细胞
增殖的常用方法〔8〕。检测原理是:活细胞线粒体中
·0312· Journal of Chinese Medicinal Materials 第 38 卷第 10 期 2015 年 10 月
图 2 蒲公英提取物对 HepG2 细胞抗凋亡蛋白 Survivin、Mcl-1、BCL-xL和 BCL-2 表达的影响
A. 对照组 B. 蒲公英提取物 1 μg /μL组 C. 蒲公英提取物 2 μg /μL组 D. 蒲公英提取物 4 μg /μL组
注:与对照组比较，* P ＜ 0. 05，＊＊P ＜ 0. 01
图 3 蒲公英提取物对 HepG2 细胞促凋亡蛋白 Smac、BAX和 Bad表达的影响
A. 对照组 B. 蒲公英提取物 1 μg /μL组 C. 蒲公英提取物 2 μg /μL组 D. 蒲公英提取物 4 μg /μL组
注:与对照组比较，＊＊P ＜ 0. 01
的琥珀酸脱氢酶能使 MTT还原为甲瓒，但死细胞无
此功能;然后采用 DMSO 溶解甲瓒，利用酶标仪在
490 nm处测定其光密度值，根据光密度值来计算药
物对细胞增殖的抑制率。
在癌细胞中其癌基因已经被激活，癌细胞的代
谢和生长速度已失去控制，为了控制癌细胞对身体
的消耗，诱导其凋亡是目前治疗癌症的一个主要途
径。线粒体诱导的癌细胞凋亡是一个重要的细胞凋
亡信号通路〔9〕，其大致过程为〔10-12〕:线粒体受到凋
亡信号刺激后，会释放促凋亡蛋白 Smac 和 Cyto-
chrome c进入细胞质中，Cytochrome c在细胞质中与
凋亡蛋白酶活化因子 1(Apaf-1)和 procaspase-9、
ATP作用形成多蛋白复合体(凋亡体) ，在凋亡体内
procaspase-9 与 Apaf-1 作用被活化，继而激活效应
Caspase-3 /6 /7。然而这些过程会被一些蛋白所抑
制，BCL-2、BCL-xL和 Mcl-1 等蛋白能抑制线粒体向
细胞质内释放促凋亡蛋白 Smac 和 Cytochrome c，而
Bid、Bad和 BAX 能抑制 BCL-2、BCL-xL 和 Mcl-1 等
蛋白的功能。Survivin 蛋白属于凋亡抑制因子
(IAPs)中的一种，能抑制活化的Caspase-9去激活
·1312·Journal of Chinese Medicinal Materials 第 38 卷第 10 期 2015 年 10 月
图 4 蒲公英提取物对 HepG2 细胞促凋亡蛋白 Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9 表达的影响
A. 对照组 B. 蒲公英提取物 1 μg /μL组 C. 蒲公英提取物 2 μg /μL组 D. 蒲公英提取物 4 μg /μL组
注:与对照组比较，* P ＜ 0. 05，＊＊P ＜ 0. 01
图 5 蒲公英提取物对 HepG2 细胞 Cytochrome c释放的影响
A. 对照组 B. 蒲公英提取物 1 μg /μL组 C. 蒲公英提取物 2 μg /μL组 D. 蒲公英提取物 4 μg /μL组
注:与对照组比较，＊＊P ＜ 0. 01
效应 Caspase-3 /6 /7，但 Smac 蛋白又能抑制 IAPs 的
功能。因此，通过测定线粒体介导癌细胞凋亡的相
关蛋白(Survivin、Mcl-1、BCL-xL、BCL-2、Smac、BAX、
Bad、Cytochrome c 和 Caspase-3 /7 /9)对阐述线粒体
诱导癌细胞凋亡机制具有重要意义。
本实验结果显示，蒲公英提取物能明显抑制人
肝癌细胞 HepG2 的增殖，显著抑制抗凋亡蛋白(Sur-
vivin、BCL-xL 和 BCL-2)的表达，促进促凋亡蛋白
(Smac和 Caspase-3 /7 /9)的表达，促进 Cytochrome c
从线粒体释放到细胞质中。且其对 Survivin、BCL-
xL、BCL-2、Smac和 Caspase-3 /7 /9 蛋白表达及 Cyto-
chrome c释放情况的影响存在着浓度依赖性。
综上所述，蒲公英提取物抗人肝癌细胞 HepG2
增殖的作用与线粒体诱导细胞凋亡机制相关，但与
其他细胞凋亡的信号通路(死亡受体通路、细胞核
通路、颗粒酶 B通路、内质网通路等)是否相关需要
进一步的研究。此外，本研究为蒲公英治疗肝癌提
供了实验依据。
参 考 文 献
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