全 文 ：［收稿日期］ 20150825(016)
［基金项目］ 佳木斯大学科技创新团队项目(CXTD-2013-05)
［第一作者］ 肖潮勇，在读硕士，从事天然药物有效成分提取研究，E-mail:huanggh2010@ 163． com
［通讯作者］ * 张宇，教授，硕士生导师，从事天然药物有效成分的分离及结构研究，Tel:13845475665，E-mail:zhangyu_1964@ 163. com
蒲公英总多糖的提取、纯化及其体外抗炎活性分析
肖潮勇，张宇* ，王宇亮
(佳木斯大学 药学院，黑龙江 佳木斯 154007)
［摘要］ 目的:研究蒲公英总多糖组分及其体外抗炎活性作用，筛选得到蒲公英总多糖的抗炎活性成分。方法:采用水
提醇沉法提取得到蒲公英总多糖，通过二乙氨基乙基纤维素 52(DEAE-52)柱层析进行纯化，得到蒲公英总多糖的 3 个洗脱部
位(水，0. 1 mol·L －1氯化钠和 0. 2 mol·L －1氯化钠洗脱部位分别记为 TMP-0，TMP-1，TMP-2)。在体外以脂多糖诱导的
ＲAW264. 7 细胞模型对蒲公英总多糖的体外抗炎活性进行研究。结果:蒲公英总多糖能够降低 ＲAW264. 7 细胞中炎症因子
(环氧合酶-2，肿瘤坏死因子-α，白细胞介素-6 和白细胞介素-1β)mＲNA 的表达，且呈一定的剂量依赖性。TMP-0 和 TMP-1 能
够抑制上述炎症因子 mＲNA的表达，具有较好的体外抗炎活性，而 TMP-2 在中、低剂量下抗炎作用不明显。结论:通过体外细
胞模型筛选，发现蒲公英总多糖具有较强的抗炎活性，其活性部位主要为 TMP-0 和 TMP-1，为获得具有抗炎活性的均一多糖
类成分提供参考。
［关键词］ 蒲公英;总多糖;二乙基氨乙基;抗炎活性;ＲAW264. 7 细胞;洗脱部位
［中图分类号］ Ｒ283. 6;Ｒ284. 2;Ｒ284. 1;Ｒ285. 5 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2016)11-0025-04
［doi］ 10. 13422 / j． cnki． syfjx． 2016110025
Extraction and Purification of Total Polysaccharides in Taraxaci Herba and
Its Anti-inflammatory Activity
XIAO Chao-yong，ZHANG Yu* ，WANG Yu-liang
(College of Pharmacy，Jiamusi University，Jiamusi 154007，China)
［Abstract］ Objective:To study on total polysaccharides in Taraxaci Herba and its in vitro anti-
inflammatory activity for screening active ingredient of anti-inflammatory． Method:Water extract-alcohol
precipitation method was adopted to gain total polysaccharides in Taraxaci Herba (TMP)，and then it was purified
by DEAE cellulose column to get three parts of TMP (TMP-0，TMP-1，TMP-2)． Anti-inflammatory activity of
TMP on ＲAW264. 7 cells induced by LPS was investigated． Ｒesult:TMP can significantly reduce the mＲNA
expression of inflammatory factors ［cyclooxygenase-2 (COX-2) ，tumor necrosis factor-α (TNF-α) ，interleukin-6
(IL-6)and interleukin-1β (IL-1β) ］in ＲAW264. 7 cells with a dose-dependent manner． The two fractions，TMP-0
and TMP-1，can significantly reduce the mＲNA of these above inflammatory factors，they showed a good in vitro
anti-inflammatory activity，while the anti-inflammatory effect of TMP-2 at low and middle doses was not obvious．
Conclusion:TMP has a strong anti-inflammatory activity，and its main active fractions are TMP-0 and TMP-1.
［Key words］ Taraxaci Herba; total polysaccharides;DEAE; anti-inflammatory;ＲAW264. 7 cell;
elution fraction
蒲公英别名蒲公草、尿床草、地丁、婆婆丁等，是
药食两用的天然绿色植物［1］，功效清热解毒、利尿
通淋和消肿散结。现代药理研究表明蒲公英具有抗
病原微生物、抗炎、抗肿瘤、抗氧化等药理活性［2-3］，
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其主要有效成分为多糖类、木质素类、有机酸类、黄
酮类和甾醇类等［4-5］。总多糖是蒲公英中非常重要
的一类活性成分，目前蒲公英总多糖的提取方法有
热水浸提法［6］、超声波提取法［7］、微波提取法［8］等，
这类成分具有广泛的药理作用，如抗肿瘤、抗突变、
抗氧化、抗疲劳和提高免疫等［9-11］。关于植物多糖
的抗炎活性研究已有文献报道，而有关蒲公英总多
糖的抗炎活性却未见报道。本实验拟通过以内毒素
或细菌脂多糖诱导的 ＲAW264. 7 炎症模型来考察
蒲公英总多糖的抗炎活性，利用活性进行导向分离，
从蒲公英中提取得到总多糖并进一步分离纯化，对
总多糖洗脱部位进行体外抗炎活性筛选，为该有效
部分的合理开发和利用提供参考。
1 材料
LXJ-II型低速多管离心机(上海安亭科学仪器
厂)，UV-5500PC 型紫外-可见分光光度计(上海第
三分析仪器厂)，FA1004 型电子分析天平(上海精
天电子仪器厂)，BSZ-100 型自动部分收集器(上海
沪西分析仪器厂有限公司)。
蒲公英采于黑龙江省佳木斯市，经第二军医大
学秦 路 平 教 授 鉴 定 为 菊 科 植 物 Taraxacum
mongolicum的干燥地上部分;葡萄糖对照品［生工
生物工程(上海)股份有限公司，批号 3342C086］，
二乙氨基乙基纤维素 52(DEAE-52，英国 Whatman
公司)，DMEM高糖培养基和胎牛血清［赛默尔飞世
尔生物化学制品(北京)有限公司］，脂多糖(LPS，美
国 Sigma公司)，小鼠巨噬细胞系 ＲAW264. 7 细胞和
相关基因引物均从中国科学院上海细胞库获得，试
剂均为分析纯。
2 方法
2. 1 蒲公英总多糖的提取［6］ 称取蒲公英样品
1 kg，粉碎，加 12 倍量水加热回流提取 2 次，每次
3 h，合并滤液，浓缩至 1 L，按三氯乙酸法去蛋白，用
终体积分数 80%的乙醇沉淀 2 次，取沉淀部位干
燥，得蒲公英总多糖(TMP)210 g，按照苯酚-硫酸
法［2］测得其总多糖质量分数 31. 9%。
2. 2 总多糖的含量测定
2. 2. 1 对照品溶液的制备 精密称取适量葡萄糖
对照品置于量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，充分混
匀，得 9. 58 g·L －1葡萄糖对照品溶液。
2. 2. 2 最大吸收波长的确定 取适量葡萄糖对照
品溶液，加入 6%苯酚溶液 1. 0 mL，摇匀后迅速垂直
滴加浓硫酸 5. 0 mL，充分混匀，60 ℃水浴加热显色
15 min，冷却至室温，以水作空白对照，于 200 ～ 600
nm扫描，结果显示对照品溶液在 490 nm 处有最大
吸收。
2. 2. 3 标准曲线的制备 分别精密移取葡萄糖对
照品溶液适量，加水补足至 2. 0 mL，以 2. 0 mL水作
空白对照，分别精密加入 6%苯酚 1. 0 mL，摇匀后立
即加入浓硫酸 5. 0 mL，摇匀，70 ℃ 水浴中加热
20 min，置于冷水中冷却 10 min，在 1 cm 石英吸收
池中于 490 nm处检测吸光度 A。以 A为纵坐标，葡
萄糖质量浓度为横坐标，得回归方程 Y = 15. 309X －
0. 082(r = 0. 998)，线性范围 9. 58 ～ 57. 48 mg·L －1。
2. 2. 4 精密度试验 取同一 TMP 溶液 6 份，按
2. 2. 3 项下方法进行样品分析，结果 A 的 ＲSD
2. 2%，表明该方法精密度良好。
2. 2. 5 稳定性试验 精密移取样品溶液 1. 0 mL，
按 2. 2. 3 项下方法处理，分别于制备后 30，45，60，
75，90，105，120 min测定 A，结果 ＲSD 0. 2%，表明同
一样品溶液在 2 h内 A基本稳定。
2. 2. 6 重复性试验 取同批次蒲公英药材 6 份，每
份 10. 0 g，按 2. 1 项下条件提取，合并滤液，浓缩至
100 mL，精密移取 2. 0 mL至 100 mL量瓶中，加水稀
释至刻度。摇匀，精密移取 1. 0 mL，按 2. 2. 3 项下
方法处理，计算 A的 ＲSD 0. 5%。
2. 2. 7 加样回收率试验 精密移取 21. 74 mg·L －1
TMP溶液，在规定的葡萄糖标准曲线范围内，分别
80%，100%，120%按精密加入已知含量的不同质量
浓度的葡萄糖对照品溶液，按 2. 2. 3 项下方法处理，
计算平均回收率 99. 46%，ＲSD 2. 6%。
2. 3 蒲公英总多糖的分离 取 TMP 2. 0 g，加水溶
解，经 DEAE柱层析，分别用水，0. 1 mol·L －1氯化钠
和 0. 2 mol·L －1氯化钠洗脱，流速 10 mL·h －1，分部
收集洗脱液，以苯酚-硫酸法检测总多糖含量，共分
成 3 个部位，0. 1 mol·L －1氯化钠和 0. 2 mol·L －1氯
化钠洗脱部位经透析膜处理后去除其 NaCl，分别记
为 TMP-0，TMP-1，TMP-2。
2. 4 细胞培养与分组 细胞放入含 10%胎牛血清
的 DMEM培养基，放置在 37 ℃，5% CO2 的培养箱中
培养，实验分为正常组，模型组(10 mg·L －1 LPS)，2. 3
项下 3个总多糖洗脱部位(TMP-0，TMP-1，TMP-2)分
别给予 10 mg·L －1 LPS 刺激，每个洗脱部位分成 3
个不同剂量组(25，50，100 mg·L －1)。
2. 5 体外抗炎活性考察 药物干预巨噬细胞 3 h
后，用 Trizol 收集细胞，提取总 ＲNA，用逆转录酶
M-MLV进行逆转录合成 cDNA，按照 cDNA 合成试
剂盒逆转录，将 mＲNA 逆转录为 cDNA，以 cDNA 为
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模板进行环氧合酶-2(COX-2)，肿瘤坏死因子-α
(TNF-α)，白细胞介素-6(IL-6)和 IL-1β mＲNA 的基
因编码片段。引物基因引物序列为 β-肌动蛋白
(β-actin)基 因 引 物 上 游 序 列 5-CCTAAGGCC
AACCGTGAAAAGATG-3，下游序列 5-GTCCCGGCCA
GCCAGGTCCAG-3;TNF-α 基因引物上游序列 5-
GGGGCCACCACGCTCTTCTGTCTA-3，下游序列 5-
CCTCCGCTTGGTGGTTTGCTACG-3;IL-6 基因引物
上游序列 5-AGCCACTGCCTTCCCTACTT-3，下游序
列 5-GCCATTGCACAACTCTTTTCTC-3;IL-1β 基因引
物上游序列 5-CCTCTGTGACTCGTGGGATGATG-3，
下 游 序 列 5-CAGGGATTTTGTCGTTGCTTGTCT-3;
COX-2 基因引物上游序列 5-CTGGTGCCGGGTCT
GATGATGTA-3，下游序列 5-AGCAGGTGTGGGTCG
AACTTGAG-3;IL-6 基因引物上游序列 5-AGCCA
CTGCCTTCCCTACTT-3，下游序列 5-GCCATTGCAC
AACTCTTTTCTC-3。
采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Ｒeal-time-
PCＲ)检测细胞炎症因子 IL-6，TNF-α，COX-2 和 IL-
1β mＲNA的相对表达量。按照扩增试剂盒的程序
95 ℃欲变性 10 min，95 ℃变性 15 s，60 ℃退火 20 s，
共进行 40 个循环。以 β-actin 为内参，采用 2ΔΔCt法
计算相对基因的表达量。使用 GraphPad Prism 5 软
件进行炎性因子释放数据的分析，数据以 珋x ± s 表
示，组间采用单因素方差分析，P ＜ 0. 05 为差异具有
统计学意义。
3 结果
3. 1 DEAE对蒲公英多糖洗脱的影响 采用离子
强度逐渐增强的阶段梯度洗脱方式，利用苯酚-浓硫
酸法追踪检测多糖分，至无糖时更换下一梯度溶液洗
脱。蛋白质的去除方法有多种，其中 Sevag 法中使用
了正丁醇和三氯甲烷，毒性较大，每次除蛋白效率较
低，要重复除蛋白 7 次左右，消耗较大。三氯乙酸法
(TCA)法操作方便简单、除蛋白效果显著。三氯乙酸
在总多糖溶液中的质量分数 15%，搅拌 15 min 后离
心(5 000 r·min －1，20 min，下同)除去沉淀，加入氢氧
化钠中和，离心以除去不溶物，透析除去小分子盐。
结果 TMP-0，TMP-1，TMP-2中总多糖质量分数分别为
52. 63%，27. 96%，21. 62%。
3. 2 蒲公英总多糖及其各洗脱部位对 ＲAW264. 7
细胞模型的影响 为了考察 4 组多糖的安全剂量，
每组设计了 4 个不同质量浓度(0，50，100，200
mg·L －1)，用细胞计数台式试剂盒(CCK-8)法检测
细胞经蒲公英总多糖及其各洗脱部位处理后活力。
结果显示当样品 TMP，TMP-0，TMP-1，TMP-2 的质量
浓度为 100 mg·L －1时，与正常组比较，细胞活力有
所下降但并无统计学差异;当 TMP，TMP-0，TMP-1，
TMP-2 的质量浓度均为 200 mg·L －1时，与正常组比
较，细胞活力显著减低(P ＜ 0. 05)，见表 1，因此蒲公
英多糖 TMP，TMP-0，TMP-1，TMP-2 的安全剂量要低
于 200 mg·L －1。
表 1 不同质量浓度的蒲公英总多糖及其各洗脱部位对 ＲAW264. 7
细胞活力的影响 (珋x ± s，n = 3)
Table 1 Effects of total polysaccharides in Taraxaci Herba on
normal ＲAW264. 7 cells (珋x ± s，n = 3) %
质量浓度
/mg·L －1
TMP TMP-0 TMP-1 TMP-2
0 100． 0 ±0． 2 100． 0 ±0． 2 100． 0 ±0． 2 100． 0 ±0． 2
50 95． 2 ±9． 5 94． 3 ±8． 7 92． 1 ±3． 2 93． 7 ±9． 7
100 90． 3 ±5． 1 89． 1 ±10． 1 91． 2 ±9． 4 91． 7 ±11． 6
200 82． 7 ±8． 51) 81． 2 ±12． 11) 80． 7 ±13． 11) 81． 9 ±12． 81)
注:与正常组比较1)P ＜ 0. 05。
3. 3 Ｒeal-time PCＲ 检测细胞 COX-2，TNF-α，IL-6
和 IL-1β mＲNA 的表达 与正常组比较，经过 LPS
处理后，炎症因子 NO，TNF-α 和 IL-1β mＲNA 的表
达量明显提高(P ＜ 0. 01);和 LPS组比较，TMP能抑
制炎症因子 TNF-α，COX-2，IL-6 和 IL-1β mＲNA 的
表达，且呈一定的剂量依赖性;在经过 DEAE 纯化
后，TMP-0 和 TMP-1 均能够抑制炎症因子 TNF-α，
COX-2，IL-6 和 IL-1β mＲNA 的表达，且二者在相同
剂量下作用要优于 TMP;但对于 TMP-2 在高剂量时
能够显著抑制 COX-2 和 IL-1β mＲNA的表达，在中、
低剂量时，其抗炎效果不明显，见表 2。
4 讨论
多糖是普遍存在于生物体内且具有重要生物活
性的一类生物大分子，是很多内源性生物活性分子
的组成成分［12］。近年来，大量具有生物活性的多糖
类成分从不同生物体内提取出来，如增强机体免疫
力活性、抗菌活性、抗病毒活性、抗寄生虫活性、抗肿
瘤及抗衰老等［13-18］。研究发现糖类在蒲公英植物
中含量很高［19］，在该植物中已发现的中性糖有葡萄
糖、蔗糖、菊糖和果糖等，占该植物干重 30% ～
50%［20］。采用 DEAE-纤维素柱层析法用不同的洗
脱溶液可将粗多糖分为中性多糖和酸性多糖。研究
结果发现蒲公英总多糖及其各洗脱部位均能够在一
定程度上抑制炎症因子 TNF-α，COX-2，IL-6 和 IL-1β
mＲNA的表达，具有较好的抗炎活性。其中 TMP-0
和 TMP-1 活性最好，提示蒲公英总多糖的抗炎部位
可能集中于这 2 个部位，为下一步从这 2 个活性部
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表 2 蒲公英总多糖及其各洗脱部位对 TNF-α，IL-6，COX-2，IL-1β mＲNA表达的影响 (珋x ± s，n = 3)
Table 2 Effects of total polysaccharides in Taraxaci Herba on levels of mＲNA production of TNF-α，IL-6，COX-2 and IL-1β (珋x ± s，n = 3)
组别 质量浓度 /mg·L －1 TNF-α /β-actin IL-6 /β-actin COX-2 /β-actin IL-1β /β-actin
正常 － 4. 13 ± 0. 78 1. 41 ± 0. 57 1. 58 ± 0. 62 1. 51 ± 0. 77
模型 － 61. 32 ± 5. 73 37. 66 ± 5. 12 68. 19 ± 3. 89 48. 15 ± 6. 18
TMP 25 58. 27 ± 4. 17 32. 69 ± 3. 81 63. 14 ± 1. 87 42. 76 ± 2. 78
50 47. 61 ± 7. 391) 21. 86 ± 4. 391) 58. 41 ± 3. 12 38. 61 ± 4. 17
100 31. 28 ± 8. 832) 12. 74 ± 5. 932) 47. 93 ± 10. 131) 28. 57 ± 8. 121)
TMP-0 25 47. 93 ± 6. 131) 21. 54 ± 4. 141) 48. 13 ± 4. 151) 39. 41 ± 3. 17
50 37. 62 ± 3. 882) 15. 17 ± 3. 122) 37. 16 ± 5. 162) 25. 89 ± 6. 011)
100 21. 89 ± 7. 142) 8. 32 ± 2. 782) 22. 17 ± 4. 762) 23. 16 ± 4. 181)
TMP-1 25 48. 66 ± 7. 111) 23. 16 ± 3. 841) 49. 13 ± 3. 731) 27. 73 ± 5. 281)
50 36. 84 ± 5. 832) 14. 38 ± 4. 162) 35. 36 ± 5. 122) 18. 38 ± 3. 212)
100 31. 69 ± 6. 152) 12. 32 ± 1. 692) 31. 74 ± 3. 872) 15. 17 ± 2. 822)
TMP-2 25 62. 78 ± 9. 79 38. 17 ± 3. 79 62. 43 ± 6. 56 45. 97 ± 3. 87
50 58. 47 ± 7. 19 31. 79 ± 4. 99 52. 37 ± 5. 99 35. 17 ± 6. 08
100 53. 86 ± 6. 47 28. 73 ± 2. 97 47. 62 ± 6. 111) 23. 51 ± 3. 191)
注:与模型组比较1)P ＜ 0. 05，2)P ＜ 0. 01。
位中分离纯化得到具有抗炎活性的均一多糖类成分
提供相关的理论基础。
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［责任编辑 刘德文］
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