全 文 ：麦类作物学报　2008 , 28(3):364-371
Journal o f T riticeae Crops
披碱草(Elymus dahuricus)焦磷酸化酶
基因 EdHP1的克隆及功能鉴定＊
董建辉1 , 2 , 陈　明2 , 徐兆师2 , 张晓科1 ,李连城2 ,马有志2
(1.西北农林科技大学农学院 ,陕西杨陵 712100;2.国家农作物基因资源与基因改良重大科学工程 ,
农业部作物遗传育种重点开放实验室 ,中国农业科学院作物科学研究所 ,北京 100081)
　　摘　要:为了从抗逆性优良的牧草中挖掘新的耐盐 、抗旱基因 , 进而为作物分子育种提供优良的基因资
源 ,采用 RACE(Rapid-Amplifica tion of cDNA Ends)方法 , 克隆了披碱草的焦磷酸化酶基因 EdHP1 , 其全长
序列包含 2 310 bp , 编码 770 个氨基酸 , 含有 14 个跨膜区 , 是一个典型的膜蛋白 ,同时包含三个保守区(CS1、
CS2 和 CS3)。氨基酸同源性比较发现 , EdHP1与来自大麦等 10 种高等植物的焦磷酸化酶基因的同源性大
于 86%。EdHP1基因的表达受干旱 、高盐和低温等非生物胁迫的诱导。功能分析证明 , EdHP1 基因能够显
著提高转基因烟草对干旱 、高盐胁迫的抗性 , 可用于作物的抗逆遗传改良。
　　关键词:披碱草;焦磷酸化酶基因;抗旱性;耐盐性
　　中图分类号:S543+9;S336　　　　文献标识码:A　　　　文章编号:1009-1041(2008)03-0364-08
Isolation and Functional Analyses of a H+-Pyrophosphatase
Gene , EdHP1 , from Pasture (Elymus dahuricus)
DONGJian-hui1 , 2 , CHEN Ming2 , XU Zhao-shi2 , ZHANG Xiao-ke1 ,
LI Lian-cheng2 , MA You-zhi2 ,
(1.C ollege of Agronomy , Northw es t A&F Universi ty , Yangling , Shanxi 712100 , China ;2.National Key Faci lit y for C rop Gen e
Resources an d Genet ic Improvement (NFCRI), Key Laboratory of Crop Genetics and Breeding of M inis t ry of Agriculture ,
Inst itute of Crop Science , Chinese Academy of Agricultural S ciences(CAAS), Bei jing 100081 , China)
Abstract:The E.dahuricus belonging to Elymus o f Gramineae , i s a perennial pasture and has remark-
able tolerance to drought and high sal t stresses.The expression o f H +-Py ropho sphatase(H +-PPase)
as pro ton pump leads to H
+
elect rochemical g radient on cel l membrane , which provide energ y fo r
t ranspo rt of various ions.In addi tion , the H +-PPase is able to transport Na+ into v acuo le , which alle-
viates Na
+
tox icity to cells and keep osmo tic potential , and enhance plants tolerance to drought and
high salt st resses .In this research , to isolate novel st ress-relative genes f rom pasture fo r improving
crop tolerance to high salt and drought st resses in the furture , a novel H +-PPase gene(EdHP1)was
isolated f rom E.dahuricus using RACE me thod (Rapid-Amplification of cDNA Ends).Sequence a-
nalysis rev ealed that the full leng th cDN A of the EdHP1 gene w as 2 310 bp , encoding a protein of 770
amino acid residues , and w as a typical membrane pro tein w ith 14 trans-membrane domains and three
conserv ative domains (CS1 , CS2 and CS3), and designated as EdHP1 .Homo logy analy ses indicated
that EdHP1 had high similarity wi th H
+-PPases of o ther plant species including barley e tc (minimal
homolo gy w as 86%).The expression analyses indicated that the expression of EdHP1 w ere induced
＊　收稿日期:2007-12-20　　　修回日期:2008-02-10
基金项目:国家“ 863”项目(2006AA10A111);国家自然科学基金项目(30700508);“中央级公益性科研院所基本科研业务费专项”
课题。
作者简介:董建辉(1980-),男 ,硕士研究生 ,主要从事作物遗传育种研究。 E-mai l:djianhui01@163.com.
通讯作者:陈　明(1972-),男 ,博士 ,副研究员 ,主要从事抗逆基因工程研究。
马有志(1963-),男 ,研究员 ,博士生导师 ,主要从事抗逆分子生物学研究。 E-mail:mayouzhi@yahoo.com.cn
by drought , high sal t and low tempe rature st resses in E.dahuricus.The functional analy ses indicated
that the over-expression of EdHP1 enhanced tolerance tolerance of t ransgenic tobacco plants to
drought and high sal t st resses , suggest ing that EdHP1 might be useful fo r improving tolerance to en-
vi ronmental st re sses in crop plants.
Key words:E.dahuricus;H +-PPase;Drought tolerance;Salt tolerance
　　焦磷酸化酶(H+-PPase)是一类 H +转运
酶[ 1] ,同时也是以焦磷酸(Py ropho sphate , PPi)
为底物的水解酶 。该酶普遍存在于植物和少数光
合细菌中 ,是植物液泡膜上普遍存在的组分 ,约占
膜蛋白的 1%～ 10%[ 2] ,可以参与合成糖类 、核酸
和蛋白质等多种代谢途径中所形成的焦磷酸的水
解[ 3] 。H +-PPase 水解 PPi 产生的自由能与 H+
跨膜转运相耦联 , 形成质子驱动力 ,和 H +-A T-
Pase一起将细胞质中的 H+泵入液泡中 ,为离子
和其它溶质的次级转运提供动力[ 4] ;另一方面 ,可
以建立跨液泡膜电化学梯度 ,为无机离子及其他
溶质进出液泡提供驱动力[ 5 , 6] ,既能维持细胞离
子平衡和渗透平衡 ,又能减轻一些无机离子(如
Na
+和 Cl-)对细胞质的毒害;同时 ,还可以使液
泡酸化和细胞质碱化 ,有利于细胞质中生理生化
反应的顺利进行 。Davies[ 7] 和 Obermeyer[ 8] 等发
现 H +-PPase 还参与 K +向液泡内的运输 ,这种
运输是否是主动运输目前还存在争议。因为另外
一些学者在H +-PPase蛋白重组和42K+示踪实验
中没有发现K +的这一运输过程[ 9] ,Ros[ 10]等用荧
光探针法也没有检测到 H +-PPase 对 K +的主动
运输过程。目前 ,人们最感兴趣的是 H+-PPase
对植物生长素运输的影响 。Li等[ 11]人发现 ,拟南
芥(Arabidopsis thaliana)H+-PPase(AVP1)除
了酸化液泡外 ,还控制植物生长素的运输 ,从而影
响着依赖生长素的各种发育过程。目前人们已经
从绿藻 、拟南芥 、大麦[ 12] 等植物中克隆到了多个
H
+-PPase 的基因 , 基因功能分析表明 , H +-
PPase基因的过量表达可以增强转基因植物的耐
盐及抗旱性[ 13] ,但是目前还没有从抗逆性较好的
牧草中克隆 H +-PPase 基因的报道。
披碱草是禾本科披碱草属多年生优质牧草 ,
须根发达 ,多而稠密 ,根深可达 100 cm ,具有极强
的抗旱 、耐盐碱能力 。本研究从披碱草中克隆了
H
+-PPase 基因 EdHP1 ,构建了植物表达载体转
化烟草 ,并鉴定其生物学功能 ,旨在为作物抗逆遗
传改良提供新的基因资源 。
1　材料与方法
1.1　植物材料
披碱草(E.dahuricus)种子由内蒙古农业大
学于卓教授提供。将披碱草种子在 4℃春化 3 d ,
然后播种在花盆中 ,取生长 3周后的苗分别进行
高盐(200 mmol · L -1 NaCl)、干旱 、ABA(200
μmol· L-1)和 4℃处理 , 在处理时间段 1 、2 、5 、
12 、24 h 中分别取叶片样品 , 液氮中冷冻后
-70 ℃保存。
1.2　方法
1.2.1　EdHP1基因的克隆及序列分析　取生
长 3周的披碱草的叶片按照 TIANGEN TriZOL
总 RNA 提取说明书提取总 RNA 。以总 RNA 为
模板 ,用 AP 引物(表 1)反转录合成 cDNA 第一
链(方法参照 TaKaRa 反转录试剂盒说明书),用
嵌套式兼并引物 HP1-1 、HP1-2 和 AUAP(表 1)
以 cDN A 第一链为模板进行 PCR扩增 ,反应体
系 50 μL:cDNA 2 μL , 10 ×PCR buffer 5 μL ,
dN TP 4 μL , HP1-1(HP1-2)(10 μmol· L-1)1
μL , AUAP(10μmol· L-1)1 μL , Taq DNA 聚
合酶 0.5 μL , ddH 2O 36 .5 μL 。反应条件是:
94℃变性 3 min ;94 ℃50 s , 56 ℃1 min ,72 ℃2
min , 34个循环;72 ℃延伸 10 min ,经过两轮 PCR
得到了 1.6 kb 左右的目的片段 。回收目的片段
(方法参照 TaKaRa 公司小量胶回收试剂盒说明
书),连接到 TaKaRa 公司 pMD18-T Vecto r(方
法参照说明书),转化 E.coli菌株 DH5α(方法参
照 TIANGEN说明书),挑选阳性克隆测序 ,获得
1 600 bp左右的3′序列。根据得到的3′序列按照
TaKaRa公司的 5′-RACE 说明书设计引物 A1 、
A2 、S1 、S2 以及 RT-1(表 1),用 RT-1 引物以总
RNA 为模板反转录合成第一链 cDNA ,通过嵌套
PCR(反应体系和条件参照 TaKaRa 5′-RACE试
剂盒说明书),获得 500 bp左右的序列 ,对该序列
进行分析 , 设计引物 A3 、A4 、S3 、S4 以及 RT-2
(表 1),通过第二次5′-RACE获得 600 bp左右的
序列 ,最终获得全长序列 。利用 NCBI 网站的
·365·第 3 期　　　　　董建辉等:披碱草(Elymus dahuricus)焦磷酸化酶基因 EdH P1 的克隆及功能鉴定
BLAST 工具以及 DNAMAN 软件对其进行生物
信息学分析。
1.2.2　EdHP1基因的表达模式分析　以提取
的不同处理及处理时间段的披碱草总 RNA 为模
板 ,采用锚定引物 Oligo(dT)15进行反转录获得
cDNA 为模板(方法参照 TaKaRa反转录试剂盒
说明书),用 EdHP1-R1 和 EdHP1-L1(表 1)特
异引物进行 PCR扩增 ,以组成性表达的 Act in基
因做为内标 , 其引物为 ActinR1 和 ActinL1(表
1),反应体系25 μL :cDNA 1 μL ,10×PCR buffer
2.5 μL , dN TP 2 μL , ActinR1(10 μmo1 ·L -1)
0.8 μL , ActinL1 (10 μmol·L -1)0 .8 μL , Taq
DNA 聚合酶 0.2 μL , ddH 2O 17.7 μL。使用的
PCR程序是:94 ℃变性 3 min ;94 ℃,30 S , 62 ℃,
45 S , 72 ℃, 50 S , 26 个循环;72℃延伸 10 min。
分析 EdHP1 在不同处理 、不同时间段下的表达
情况 ,用 Quanti ty One 软件对 PCR产物的琼脂
糖(1 %)电泳条带进行量化分析。
1.2.3　植物表达载体的构建　将 pBI121载体用
BamH Ⅰ ,S ac Ⅰ进行双酶切 ,切除 GUS 基因 ,插
入两端引入 BamH Ⅰ , SacⅠ酶切位点的 EdHP1
基因 ,获得植物表达载体 。并将该载体转入农杆
菌(C58C1)。
1.2.4　EdHP1基因的烟草转化　采用叶盘法利用
含有该基因表达载体的农杆菌介导转化烟草 [ 14] 。
表 1　引物序列
Table 1　Sequence of primers
引物
Primer
序列
S equence
AP 5′GGCCACGCGTCGACTAGTAC(17)T′3
AUAP 5′GGCCACGCGTCGACTAGTAC′3
H P1-1 5′GG(A/ T/G/C)CT(T/ C)GG(A/ T/ C)GG(A/ T/
C/G)TC(A/G/ T)TC(A/C)ATGGC′3
H P1-2 5′C(A/ T/G/ C)GA(T/ C)AATGT(T/ C/G)GGTGACAATG′3
RT-1 5′(p)ATGA TGCCTACAGAT′3
RT-2 5′(p)GGCAGGCTCTA TT TG′3
A1 5′AAGCAACAACAAGAGCAGCGCAGAAA′3
A2 5′GCAGCGCAGAAAGA TTCAGCGT ATGA′3
A3 5′CAAGATGACT CGGCGT ATGAACCAA′3
A4 5′CGAACCCAT TCCAGCAAT ATCTCCG′3
S1 5′GA TT TCACTGCGA TGTGCT ACCCA′3
S2 5′TGCGATG TGCTACCCACTGCT TGT′3
S3 5′AT TCACCCCTATGA TGTACCCACTC′3
S4 5′GCAACCGACTT CT TTGAGGTGAAGG′3
EdH P1-R1 5′GCAACCGACT TCTT TGAGGTGAAGG′3
EdH P1-L1 5′GGAAAA TACTGAAGGCAATGGCGAAG′3
ActinR1 5′CAGTGGAGGT TCTACCA TGT TTCC′3
ActinL1 5′CATGCAAGGCCATGCCA TTG TG′3
1.2.5　转基因烟草的抗旱 、耐盐性鉴定　选择生
长状态一致的未转基因烟草植株(Wt)和 PCR阳
性 T 0 代转基因株系(EdHP1)进行无性繁殖 ,剪
成带有叶芽没有根的多段茎秆插到 MS +200
mmo l·L -1 NaCl以及 MS +2%PEG 的培养基
上进行胁迫培养 ,培养条件是 25℃,光照培养 16
h ,暗培养 8 h ,培养 4 周后观察未转基因和转基
因植株在高盐和高渗条件下根部及地上部分生长
情况 ,统计根长及地上部分的长度 ,根据长度评价
转基因植株的抗旱性和耐盐性 。
2　结果与分析
2.1　EdHP1基因的克隆和序列分析
采用 RACE 的方法对披碱草中焦磷酸化酶
基因的全长序列进行扩增 ,得到了 2.3 kb左右的
片段 ,对目标片段进行回收 、克隆 、测序 。序列分
析表明 ,所获片段含有 2 310 bp 的开放阅读框 ,
编码 770个氨基酸(图 1A),蛋白分子量是 80.05
kDa ,等电点是 4.89。氨基酸序列在 NCBI 网站
(ht tp ://www .ncbi.nlm.nih .gov )上 进行
BLAST 比对 ,结果显示该序列包含一段完整的
H-PPase保守域(图 1B),并且与大麦 、水稻 、玉米
等植物的 H +-PPase同源性高达 92 %,所以命名
为 EdHP1 。在 TMHMM 网站(ht tp://www.
cbs.dtu.dk)分析蛋白质结构发现 EdHP1 包含
14个跨膜区(图 1C),同时包含三个保守区:CS1
(226-353 aa)、CS2(452-503 aa)和 CS3(659-765
aa),其中 CS1中的 DVGADLVGKVE 氨基酸序
列(图 1A)可能对其催化起关键作用 ,表明它是一
个典型的跨膜蛋白。
　　将 EdHP1与其它高等植物的 H +-PPase 基
因比较发现 ,它们的核苷酸和氨基酸序列都有很
高的同源性 ,跨膜区的保守性更高 。采用 DNA-
MAN 软件对其全长氨基酸序列进行进化树分
析 ,发现 EdHP1与水稻(Oryza sat iva)、拟南芥
(A.thaliana)、玉米(Zea mays)、甜菜(B.vul-
garis)、大麦(Hordeum vulgare)、绿豆(Vigna
radiata)、小麦(Tri ticum aestivum)、西洋梨
(Pyrus communis)、苜蓿(Medicago truncatu-
la)、巴西橡胶树(Hevea brasi liensis)的 H +-
PPase 同源性都在 86 %以上 , 与大麦的 H +-
PPase同源性高达 98%。与原生动物(Protozo-
a)、海藻类(Marine alga)的同源性只有 40 %(文
中未列出),这说明 H +-PPase在高等植物中具有
·366· 麦　类　作　物　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　第 28 卷
很高的同源性(图 2)。
　　A:EdH P1的氨基酸序列 三个保守区 CS1:226-353 aa , CS2:452-503 aa , CS3:659-765 aa;B:氨基酸序列保守域的推测;C:在 TM-
HMM 网站预测 EdH P1跨膜区 ,共有 14个跨膜区。
A:The amin o acid sequence of EdHP1 and th ree con served domains of CS1(226-353 aa), CS2(452-503 aa)and C S3 (659-765 aa);
B:Putative conserved domains of amino acid sequ ence ;C:Trans-mem brane domain of the EdHP1 analy zed on TMHMM websi te and 14
t rans-membrane domains speculated.
图 1　 EdHP1 基因氨基酸序列及预测的跨膜区
Fig.1　Amino acid sequence and putative trans-membrane domains of EdHP1
2.2　EdHP1基因的表达模式分析
已有研究报道 ,大麦 、拟南芥中 H +-PPase基
因表达受高盐胁迫的诱导[ 12] 。本研究中 ,在高盐
胁迫下 , EdHP1从 1 h到 24 h表达逐渐升高;在
干旱条件下 ,表达有微弱的增加;在低温(4℃)条
件下 ,表达先增强后减弱在 5 h达到最大值后逐
渐下降;在 ABA 处理条件下没有响应(图 3)。
2.3　转 EdHP1基因烟草的抗旱 、耐盐性鉴定
转基因烟草抗旱性鉴定 ,在 MS +2%PEG 的
培养基上培养 4周后 ,未转基因烟草(Wt)地上和
地下部分生长受到了严重抑制 ,而转基因株系(
EdHP1 )形成了一定数目的根 ,而且茎和叶的发
育也明显优于Wt(图 4B)。处理之前Wt 和转基
因株系地上部分的平均长度分别为 1.2 cm 和1.1
·367·第 3 期　　　　　董建辉等:披碱草(Elymus dahuricus)焦磷酸化酶基因 EdH P1 的克隆及功能鉴定
cm(图 4D),处理之后转基因株系地上部分的平
均长度(4.5 cm)明显比 Wt(1.5 cm)长(P <
0.01)(图 4E),处理之后转基因株系地下部分的
平均长度(5.5 cm)也明显比 Wt(0.1 cm)长(P<
0.01)(图 4F)。为了进一步确定 EdHP1基因的
表达与转基因烟草抗旱性的关系 ,对转基因植株
中该基因的表达进行了 RT-PCR 分析 ,结果表
明 ,转基因植株中 EdHP1基因表达而在未转基
因烟草中没有 EdHP1 基因的表达 ,这说明由于
EdHP1基因的表达提高了转基因烟草的抗旱性
(图 4C)。同样 ,在 MS +200 mmol ·L-1NaCl的
培养基上进行耐盐性鉴定 ,结果发现转基因株系
生长势明显优于 Wt(图 5B),转基因株系(Ed-
HP1)的地上的长度为 6 cm 明显的比 Wt(1.9
cm)长(P<0.01)(图 5E),转基因株系地下部分
长度为 7.2 cm 同样显著比Wt(0.1 cm)长(P<
0.01)(图 5F), RT-PCR结果表明 ,在转基因植株
中 EdHP1基因表达而在未转基因烟草中没有
EdHP1基因的表达 ,这说明由于 EdHP1基因的
表达提高了转基因烟草的耐盐性(图 5C)。
　　采用 DNAMAN 软件分析 EdHP1与其他植物的 H +-PPase的同源性 ,它们的基因注册号为:大麦 , HbVP1(AY255181);水
稻, OsVP1(AB012765);玉米 , ZmVP1(YP 002219);拟南芥 ,
AVP1(M 81892);甜菜 , BVP1 (AAA61609);橡胶树 , HVP1
(AB032839);西洋梨 , PcVP1 (NM 101437);苜蓿 , MtVP1
(AAS70856);绿豆 , VrVP1 ( VRU31467);小麦 , TaVP1
(L32791)。
Homology analyses of amino acid sequence of EdH P1 and
H+-PPase f rom other plan t species u sing DNAMAN sof tware.
The acces sion num ber of all genes w ere as follow s:Hordeum bre-
visubulatum , HbVP1 (AY255181);Ory za sat iva , OsVP1
(AB012765);Zea mays , ZmVP1 (YP 002219);Arabid opsis
th al iana , AVP1 (M81892 ); Beta vu lg ari s , BVP1
(AAA61609);Hevea brasi li ensi s , HVP1 (AB032839);P yrus
communis , PcVP1(NM 101437);Med icago trunca tu la , MtVP1(AAS70856);Vig na rad iate , VrVP1(VRU31467);Tr it icum
aest ivum , TaVP1(L32791).
图 2　 EdHP1 与其他植物 H+-PPase的氨基酸同源性分析
Fig.2　Homology analyses of EdHP1 and H+-PPase
from other plant species
　　 EdH P1基因在高盐条件下从 1 h到 24 h表达逐渐升高 , 在干旱条件下表达有微弱的增加 ,在 4℃条件下表达先增强后减弱 , 在
ABA 处理条件下没有响应。
Expression of EdHP1 increased gradually f rom 1 to 24 h under high sal t st ress , increased faint ly under drough t st ress , declined fol-
l ow ed w ith increasing exp res sion u nder cold st ress , an d had no respon se to ABA treatm ent.
图 3　 EdHP1 基因的表达分析
Fig.3　Expression analysis of EdHP1
·368· 麦　类　作　物　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　第 28 卷
　　A:2%PEG 处理之前的情况;B:2%PEG 处理 4周之后的情况;C:EdH P1基因在转基因烟草中的表达情况;D:2%PEG 处理之前
未转基因植株(Wt)和转基因株系(EdH P1)地上部分平均长度比较;E:2%PEG 处理 4周之后未转基因植株(Wt)和转基因株系(E d-
HP1)地上部分平均长度比较;F:2%PEG 处理 4周之后未转基因植株(Wt)和转基因株系(EdHP1)地下部分平均长度比较。
A:T he g row th status b efore 2%PEG treatment;B:T he g row th status af ter 2%PEG treatment for 4 week s;C:T he exp ression an-
alyses of EdH P1 ;D:T he average length comparing of segment above ground of w ild type(Wt)w ith t ran sgenic tobacco (EdH P1)be-
f ore 2%PEG treatment;E:Th e average length com parin g of segm en t above ground of w ild ty pe(Wt)w ith t ransgenic tobacco(EdH P1
)af ter 2%PEG treatment fo r 4 w eeks;F:The average leng th comparing of segment under ground of w ild type(Wt)w ith t rans genic to-
bacco(EdH P1)af ter 2% PEG treatment.
图 4　转 EdHP1 基因烟草抗旱性鉴定结果
Fig.4　Drought tolerance analyses of EdHP1 transgenic tobacco plants
　　A:高盐处理之前的情况;B:200 mmol· L -1NaC l处理 4周之后的情况;C:EdH P1基因在转基因烟草中的表达情况分析;D:高盐
处理之前未转基因植株(Wt)和转基因株系(EdHP1)地上部分平均长度比较;E:200 mmol· L -1NaCl 处理 4周之后未转基因植株
(Wt)和转基因株系(EdH P1)地上部分平均长度比较;F:200 mm ol· L -1NaCl处理 4周之后未转基因植株(Wt)和转基因株系(E d-
HP1)地下部分平均长度比较。
A:T he grow th status before hig h s al t t reatm en t;B:T he grow th status af ter 200 mmol· L -1NaCl t reatm en t for 4 w eek s;C:The
exp ression analyses of EdHP1 ;D:Th e average length comparing of segm ent above ground of w ild type (Wt)w ith t ran sgenic tobacco (
EdHP1)before high salt t reatment;E:The average length comparing of segmen t above ground of w ild type(Wt)w ith t rans genic tob ac-
co(EdH P1)af ter 200 mmol· L -1NaC l t reatment for 4 w eeks;F:The average length comparing of segmen t under ground of w ild type
(Wt)w ith t ransgenic tobacco(EdHP1)af ter 200 mmol· L -1NaCl t reatment.
图 5　转 EdHP1 基因烟草耐盐性鉴定结果
Fig.5　High salt tolerance analyses of EdHP1 transgenic tobacco plants
·369·第 3 期　　　　　董建辉等:披碱草(Elymus dahuricus)焦磷酸化酶基因 EdH P1 的克隆及功能鉴定
3　讨论
H
+-PPase作为一个典型的膜蛋白 , 其氨基
酸序列在高等植物中具有很高的同源性 。Mae-
shima等[ 15] 通过比较来源于不同有机体的液泡型
焦磷酸酶的氨基酸序列 ,发现其中存在几个高度
保守区域:CS1 、CS2和 CS3。其中 CS1是焦磷酸
水解和质子转运所必需的 。而其内部的 DV-
GADLVGKVE 氨基酸序列对焦磷酸酶催化反应
起重要作用。在 EdHP1中同样存在该序列(257
～ 266 aa),同源性分析结果显示在该位置上氨基
酸序列是可变的 , 在大麦中为 DVGADLVG-
KEE ,红叶藻和拟南芥中该位置均改变为 DV-
GADLVGKIE ,这说明该位置个别氨基酸序列的
变异不影响焦磷酸酶的活性。
H+-PPase具有质子泵的功能 ,能够分解 PPi
为离子的运输和一些次级代谢提供能量 ,在这方
面和 A TP 具有类似的功能。在逆境下 H +-
PPase还能提高 ATP 的活性。目前 , H+-PPase
基因对盐胁迫响应方式有两种观点:一是 Na+抑
制它的活性 , Matsumo to 等[ 16] 报道 ,200 mmo1·
L-1NaCl处理的大麦根 H+-PPase活性是对照的
50 %,类似现象也在 400 mmo1 · L-1NaCl处理
的冰叶日中花和 100 mmo1· L-1N aCl处理的绿
豆[ 17]中观察到;另一观点是 NaCl诱导 H+-PPase
活性上升。50 mmo1 · L-1 NaCl 处理的胡萝卜
H +-PPase 基因的活性在 l0 d 内较对照增加 1
倍[ 18] 。赵利辉等[ 19] 比较了耐盐性不同的两个大
麦品种鉴 4 和科品 7 号 H +-PPase 对不同浓度
NaCl(0 mmol · L -1 , 100 mmol · L -1 和 200
mmo l·L-1)的反应 ,发现耐盐的鉴 4在两种盐
浓度下 ,根系 、叶片 H+-PPase 的水解活性均上
升 ,而不耐盐的科品 7号根系 、叶片 H +-PPase水
解活性均下降 ,显示了 H +-PPase 的基因型差异。
由此可见 , H +-PPase 的活性似乎可以作为衡量
作物耐盐性的一个指标。在本实验中基因表达分
析显示 EdHP1受 200 mmo1 ·L-1N aCl处理诱
导表达 ,同时基因功能分析证明 EdHP1 可以显
著提高转基因植物的耐盐性 ,这些结果证明 Ed-
HP1基因参与了植物的高盐胁迫反应 。同时 ,目
前 H +-PPase 基因对低温胁迫的响应方式也有不
同看法 , Yoshida 等[ 20] 报道绿豆苗在低于 10℃的
温度下 H +-PPase 质子转运速率降低。 Barkla
等[ 18]则发现冷诱导使得 H +-PPase 活性大幅度
上升 。在本实验中 EdHP1对 4℃处理的响应是
先升高后降低 ,这证明 EdHP1基因参与了植物
对低温的响应 。
Brini [ 21] 等将 H +-PPase 转入拟南芥 ,发现能
够明显的提高转基因植物的耐旱性 Gao[ 22] 等人
将盐芥中的 H +-PPase 转入拟南芥发现能够明显
的提高转基因植物的耐盐性。笔者的研究中证明
EdHP1能够显著提高转基因烟草抗旱性和耐盐
性(图 4 和图 5),推测可能的作用机制是 EdHP1
影响了生长素的运输 , 促进了根系(图 4F 和图
5F)和地上部分的生长(图 4E 和图 5E),从而提
高了植物的抗逆性 ,由此可见 EdHP1 可以作为
优良的基因资源用于改良作物的抗逆性 。
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(下转第 386页)
·370· 麦　类　作　物　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　第 28 卷
因此建议育种工作者首先应摸清育种材料的
1BL/1RS遗传背景 ,这样在亲本选配时才能做到
有的放矢 。在选育专用强筋小麦品种时 ,一般不
宜采用 1BL/1RS材料作亲本 ,或至少其中一个亲
本应是非 1BL/1RS 材料 ,而且要有较好的高 、低
分子量谷蛋白亚基的遗传背景 。在选育优质饼干
小麦品种时 ,可以考虑使用 1BL/1RS 材料做亲
本。
致谢:实验过程得到国家甘薯改良中心唐君
研究员和赵冬兰助理研究员的热心帮助 ,在此深
表感谢。
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