全 文 ： 资源开发
收稿日期:2009-09-18;　修订日期:2009-12-15
基金项目:河南省重点科技攻关资助项目(No.082102310033)
作者简介:李喜凤(1952-),女(汉族), 河南郑州人 ,现任河南中医学院药
学院教授 ,硕士研究生导师 ,学士学位 ,主要从事中药新药及质量标准的
研究工作.
＊通讯作者简介:张红梅(1971-),女(汉族),河南郑州人 ,现任河南省医
药科学研究院副研究员 ,博士学位 ,主要从事分子生物学研究工作.
蒲公英总 DNA的提取及其
RAPD-PCR反应条件的优化
李喜凤 1 ,杜云锋1 ,张红梅 2＊ ,郝　哲 1 ,许　闽1 ,白　雁 1
(1.河南中医学院 ,河南 郑州　450008;　2.河南省医药科学研究院 ,河南 郑州　450052)
摘要:目的 建立并优化蒲公英样品总 DNA提取方法及其 RAPD-PCR反应体系。方法 采用改良的 CTAB法提取基因
组 DNA,对蒲公英 RAPD-PCR反应体系中各个主要影响因子进行了优化和筛选 。结果 建立了多态性高 、重复性好 、可
用于蒲公英 RAPD分析的最佳反应体系。 25 μl反应体系中含有:1×TaqMixbufer, 50 ngDNA模板 , 0.4 μmol/L引物 ,
1.5mmol/LMg2+, 0.25mmol/LdNTPs, 1.25UTaq酶。扩增程序为:94℃预变性 5 min;94℃变性 1 min, 38℃复性 1 min,
72℃延伸 2 min, 共 40个循环;72℃延伸 10 min,反应结束后 , 4℃保存。结论 这一优化体系的建立为今后利用 RAPD标
记技术进行蒲公英鉴定及种质资源遗传多样性分析奠定了基础。
关键词:蒲公英;　基因组 DNA提取;　随机扩增多态性 DNA技术
中图分类号:Q37　　文献标识码:B　　文章编号:1008-0805(2010)06-1501-02
　　蒲公英为菊科植物蒲公英 TaraxacummongolicumHand.-
Mazz.,碱地蒲公英 TaraxacumsinicumKitag.或同属数种植物的
干燥全草 , 具有清热解毒 、消肿散结 、利尿通淋之功效 , 主要用于
乳痈 、肺痈 、肠痈 、痄腮 、咽痛 、湿热黄疸 、热淋涩痛等症 [ 1] 。蒲公
英品种繁多 ,资源丰富且来源复杂 ,目前对其鉴别一直沿用经典
的性状鉴定 、显微鉴定及理化鉴定等方法。而这些方法的鉴定标
识建立在个体形态和客观观测水平上 , 在生物学上为物种的遗传
表现型 , 受到遗传因素 、生物体的生长发育阶段 、环境条件 、人类
活动如引种驯化 、加工炮制等影响 , 具有很大的变异性 , 存在主观
性强 、重复性和稳定性差等缺点。
随机扩增多态性 DNA(randomamplifiedpolymorphismDNA,
RAPD)技术是由美国杜邦公司的科学家 WiliamsJGK和加利福
尼亚生物研究所 WelshJ领导的两个研究小组在 1990年同时推
出的 ,该技术根据 PCR原理 , 以随机设计的寡核苷酸引物扩增
DNA中的一些片段。短短几年 , 此方法已成功地应用于遗传多
样性检测 [ 2] 、基因定位 、品系鉴定 [ 3] 、遗传图谱构建和系统学研
究等诸多领域。 但 RAPD扩增易受多种因素的影响 , 如模板
DNA浓度 、引物浓度及 Taq酶浓度等 , 扩增条件的变化会对
RAPD图谱产生较大的影响 ,从而影响 RAPD分析的准确性和稳
定性 ,因此为了获得重复性和可靠性高的 RAPD图谱 , 对蒲公英
进行 PCR扩增条件的优化和引物退火温度的确定十分必要。本
研究探讨了蒲公英 RAPD-PCR反应的优化条件 , 以期建立可用
于蒲公英 RAPD-PCR分析的最佳反应体系和扩增程序 ,为深入
开展蒲公英鉴定及种质资源遗传多样性分析奠定基础。
1　材料与仪器
1.1 　材料 蒲公英叶片于 2009-04采自河南中牟 、邙山 、济源 、
开封等地 ,经本院生药学科董诚明教授鉴定为菊科植物蒲公英 ,
用变色硅胶将其叶片快速干燥后置于 -20℃冰箱备用。
1.2 　试剂 CTAB(十六烷基三甲基溴化铵):上海山浦化工有
限公司;Tris(三羟甲基氨基甲烷):美国 Sigma公司;EDTA(乙二
胺四乙酸二钠盐):美国 Amresco公司;DL15 000 bp、DL2 000
bpDNAMarker:大连 TaKaRa公司;2×TaqPCRMasterMix:北京
TIANGEN公司;10 mer随机引物:上海英骏生物技术有限公司合
成;其余化学试剂均为国产分析纯。
1.3 　仪器 DYY-6C型电泳仪:北京市六一仪器厂;GelDoc
2000TM型凝胶图像分析仪:美国 BIO-RAD公司;梯度 PCR仪:
德国 Biometra公司;GR22G型高速低温离心机:日本日立公司;
微量移液器:德国 eppendorf公司。
2　方法
2.1 　蒲公英叶基因组总 DNA的提取和检测 在经典的 CTAB
法的基础上加以改良:称取 0.5g样品加入 10%的 PVP一起在冰
上用玻璃砂在研钵中研磨 , 磨碎后转移至 10 ml离心管中 , 加入
10倍体积的冰预冷的洗涤缓冲液(250 mmol/L氯化钠 , 250
mmol/LTris-HClpH=8.0, 50 mmol/LEDTApH=8.0, 5%
PVP),冰浴 10min, 10 000 r/min离心 5 min, 弃上清液 ,再用洗涤
缓冲液洗涤沉淀 1次。加入 1 ml2 ×CTAB提取缓冲液(100
mmol/lTris-HClpH=8.0, 20 mmol/LEDTApH=8.0, 1.4 mol/
L氯化钠 , 2%CTAB, 5%PVP), 100 μlβ -巯基乙醇 , 65 ℃温育 3
h, 不时振摇。 4℃12 000 r/min离心 10 min, 取上清液于另一离
心管中 ,加入适量的 RNaseA酶 , 37 ℃温育 45 min,加入等体积
氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提 3次 , 4℃ 12 000 r/min离心 10 min。
取上清液分装于 1.5 mlEP中 , 加入等体积预冷的异丙醇 , 混匀 ,
于 -20 ℃静置 30 min或过夜 , 4 ℃ 12 000 r/min离心 15 min, 小
心弃去上清液 , 用 75%乙醇洗涤沉淀两次 , 4 ℃ 12 000 r/min离
心 5 min,在室温下干燥。将干燥的 DNA沉淀溶解于 100 μlTE
缓冲液(10 mmol/LTris-HClpH=8.0, 1 mmol/LEDTApH=
8.0)中 , 4 ℃保存。 经 1.0%琼脂糖凝胶电泳分析 , GelDoc
2000TM型凝胶图像分析系统拍照 , 于蛋白核酸测定仪上测定其
原始浓度 ,最后统一稀释成终浓度 20ng/μl, 保存 -20℃备用。
2.2 　 RAPD-PCR初始扩增体系 参照常规的 PCR反应中各
组分的量及相关研究论文 , 确定蒲公英 RAPD-PCR初始的反应
体系为:反应总体积 25μl,内含 1.2×TaqMixbuffer(镁离子 1.8
mmol/L、Taq酶 1.5U、dNTPs0.3 mmol/L)、模板 DNA50ng、随机
引物 0.2 mmol/L。 根据预试验的结果 , 以 S36(AGCCA-
GCGAA)为引物 , 对蒲公英 RAPD反应体系中的 5种主要反应成
分分别进行单因素试验 , 每一个合适条件确定后作为后续研究的
一个条件。
扩增程序定为 94℃预变性 5 min;然后进行 40个循环:94℃
变性 1 min, 37℃复性 1 min, 72℃延伸 1.5 min;循环后 72℃延伸
10 min;4℃保存。 PCR扩增产物在 1.2%琼脂糖凝胶中电泳检
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测 ,电压 5 V/cm,电泳结束后 , 在 GelDoc2000TM型凝胶图像分
析仪上观察并照相记录。
2.3 　退火温度的确定 采用梯度 PCR仪 , 设定退火温度最低
31.0℃和最高 43.0℃, 扩增仪自动生成 8个温度梯度 , 分别为:
31.0, 32.1, 34.0, 36.0, 38.0, 40.0, 41.9, 43.0℃。
2.4　随机引物的筛选及 RAPD优化体系的验证 采用优化出的
PCR反应体系对 100条 RAPD随机引物进行初步筛选 , 最终从中
选出能够稳定扩增出条带清晰 、多态性明显的引物。分别采用筛
选出的不同随机引物应用优化好的 PCR体系对其它样品个体进
行 RAPD扩增。
3　结果
3.1　蒲公英叶片基因组 DNA的提取 采用改良的 CTAB法所提
DNA为白色 , 经蛋白核酸测定仪检测 , 其平均 OD260 /280值为
1.832,说明所提 DNA无蛋白质和 RNA污染 , 纯度较高。同时将
所提的 DNA进行琼脂糖凝胶电泳 , 结果显示所得总 DNA均有一
条约 15 kb清晰明亮的主带 , 无拖尾或弥散现象 , 完整性较好。
结果见图 1。
图 1　改良的CTAB法提取的总 DNA电泳图
3.2 　蒲公英叶 RAPD反应体系的优化
3.2.1　模板浓度确定 适宜的模板量是保证特异性扩增的前
提 ,模板量过多会降低特异性效率 , 增加非特异性产物。本实验
设置了 10, 20, 40, 50, 60, 80, 100, 120, 140, 160 ng共 10个模板梯
度 ,结果见图 2,从中可以看出 , DNA模板量在 10 ～ 160 ng,扩增
程度及扩增条带数无明显差异 , 浓度过高扩增条带较少或不稳定
甚至无产物。因此 ,本研究将蒲公英扩增体系中模板加入量定为
50 ng,扩增结果较好。
1 ～ 10分别为:10, 20, 40, 50, 60, 80, 100, 120, 140, 160ng
M为 DL2 000bpDNAMarker
图 2　模板 DNA用量对扩增结果的影响
3.2.2 　引物浓度选择 引物浓度关系到扩增产物的质量 ,浓度
太低不能进行有效的扩增 , 浓度太高会增加引物二聚体的形成 ,
导致条带不稳定及清晰度下降。在优化其反应体系过程中设置
了 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8 , 0.9, 1.0 μmol/L共 10
个浓度水平。结果见图 3, 引物浓度为 0.1 μmol/L时 , 扩增条带
少而弱 , 0.2 ～ 0.5 μmol/L之间扩增条带数和亮度基本一致 , 引
物浓度高于 0.6μmol/L时非特异性扩增条带增加。根据实验结
果 ,本研究选择引物浓度为 0.4 μmol/L。
3.2.3　 2×TaqPCRMasterMixBufer用量选择 所用 PCRbuf-
er内含 Mg2+, TaqDNA聚合酶 , dNTPs三种成分 , 含量分别为:
3.0 mmol/LMg2+, 0.1U/μlTaq酶 、 0.5 mmol/LdNTPs。 Taq酶的
种类以及使用量直接影响扩增反应的成功与否 , dNTPs是 PCR
反应的原料 ,其用量与 PCR产物产量直接相关。 底物 dNTPs浓
度过高 ,会导致 DNA聚合酶错误插入 ,背景模糊 , 浓度过低 , 又会
影响合成效率 ,甚至会因 dNTPs过早消耗而使产物单链化 , 影响
扩增结果。为此 ,本研究对 2×TaqPCRMasterMixBufer用量共
设置了 5.0, 7.5, 10.0, 12.5, 15.0, 17.5, 20.0μl共 7个梯度。结
果见图 4。结果显示 ,加入量过少或过多都会造成扩增条带少而
弱。本研究选择加入量为 12.5 μl, 即在 25 μl反应体系中 , Mg2+
浓度为 1.5mmol/L, dNTPs浓度为 0.25 mmol/L, Taq酶 1.25 U。
1～ 10分别为:0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0μmol/L
M为 DL2 000bpDNAMarker
图 3　随机引物浓度对扩增结果的影响
1～ 7分别为:5.0, 7.5, 10.0, 12.5, 15.0, 17.5, 20.0μl
M为DL2000bpDNAMarker
图 4　 2×TaqPCRMasterMixBufer用量对扩增结果的影响
3.3　引物退火温度的考察 PCR反应中 , 退火温度的高低直接影
响到引物与模板 DNA的特异性结合。利用上面优化的最佳条
件 ,针对引物的 Tm值进行梯度退火实验。 结果见图 5。 在 36 ～
40℃范围内 ,都能扩增出主要条带 , 但比较看出 , 在 38℃扩增的
条带清晰且稳定性高 , 为此 , 本研究选择 38℃作为蒲公英 RAPD
反应的最适退火温度。
1～ 8分别为:31.0℃, 32.1℃, 34.0℃, 36.0℃,
38.0℃, 40.0℃, 41.9℃, 43.0℃
M为 DL2 000bpDNAMarker
图 5　退火温度对扩增结果的影响
通过对上述条件的优化 , 筛选出适合于蒲公英 RAPD-PCR
的反应体系 , 25μl的体系中含有:1 ×TaqPCRMasterMixBuffer
(1.5 mmol/LMg2+, 0.25 mmol/LdNTPs, 1.25 UTaq酶), 50 ng
模板 DNA和 0.4μmol/L引物。扩增程序为:94℃预变性 5 min;
94℃变性 1min, 38℃复性 1 min, 72℃延伸 2 min, 共 40个循环;
72℃延伸 10 min,反应结束后 , 4℃保存。
3.4　随机引物的初步筛选及 RAPD优化反应体系的验证 经过
大量的试验 ,最终选出了 10条扩增出条带清晰 、多态性明显的引
物。引物及其序列见表 2。利用筛选出的随机引物 S36及优化
的 PCR反应体系对不同居群蒲公英样品 DNA进行扩增 ,结果均
获得了背景清晰 、多态性高 、稳定性好的 DNA扩增片段 , 可用于
蒲公英品种鉴别及遗传多样性分析 , PCR扩增结果见图 6。
表 2　筛选出的部分引物
引物编号 序列(5′※ 3′) 引物编号 序列(5′※3′)
OPC-06 GAACG-GACTC S36 AGCCA-GCGAA
OPD-05 TGAGC-GGACA S308 CAGGG-GTGAA
SJ4 CCGCT-ACCGA S358 TGGTC-GCAGA
OPA-19 CAAAC-GTCGG OPC-11 ACGAT-GAGCC
OPG-06 GTGCC-TAACC OPB-12 CCTTG-ACGCA
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时珍国医国药 2010年第 21卷第 6期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2010VOL.21NO.6
A～ X为不同居群蒲公英样品:M为 DL2000bpDNAMarker
图 6　不同居群蒲公英样品 RAPD扩增结果
4　讨论
从蒲公英叶片中提取总 DNA的关键是如何有效地去除多
糖 、生物碱及其它次生代谢产物。叶片在液氮中研磨是为了降低
DNA酶的活性 ,防止 DNA在溶出时发生降解。 CTAB是一种去
污剂 , 既能裂解细胞 ,又能有效沉淀多糖。在提取缓冲液中加入
5%PVP和 100μlβ -巯基乙醇也是为了防止多酚类物质的氧
化 、褐变。用氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提能较好的除去蛋白质 ,
经反复试验 , 抽提 2 ～ 3次即可达到要求。同时为了除去可能残
留在 DNA沉淀中的无机盐及有机溶剂 , 采用 75%的乙醇洗涤沉
淀两次。结果表明 ,采用改良的 CTAB法进行蒲公英叶基因组总
DNA的提取 ,获得了高质量的 DNA。
Taq酶依赖于 Mg2+,而 Mg2+又受到 dNTPs影响 , dNTPs浓度
过高则会与 Taq酶竞争 Mg2+, 从而影响到 Taq酶的活性。 为了
获得重复性和稳定性较好的 RAPD谱带 , 提高分析的准确度 , 本
研究对影响 PCR的主要 5种反应组分进行了反复试验 , 探索出
了一套适合蒲公英 RAPD扩增的优化条件 , 确定了蒲公英 RAPD
最佳反应体系 , 为进一步进行蒲公英遗传多样性 RAPD分析研究
奠定了坚实的基础。
参考文献:
[ 1 ] 　国家药典委员会.中国药典 , Ⅰ部 [ S] .北京:化学工业出版社 ,
2005:244.
[ 2 ] 　张春平 ,何　平 ,胡世俊 ,等.药用金荞麦遗传多样性的 RAPD分析
[ J].中国中药杂志 , 2009, 34(6):660.
[ 3 ] 　于艳丽 ,石俊英.RAPD技术在金银花品种鉴定中的应用 [ J] .中药
材 , 2000, 23(11):678.
资源开发
收稿日期:2009-09-27;　修订日期:2010-01-10
基金项目:贵阳中医学院博士基金(No.200611);
国家中医药管理局 “西部 ”重点学科建设资助项目
(No.200414)
作者简介:王祥培(1975-),男(侗族), 贵州天柱人 ,现为贵阳中医学院副
教授 ,博士学位 ,主要从事中药及民族药品种品质与资源开发研究工作.
威灵仙及柱果铁线莲种子表面特征比较
王祥培 ,吴红梅 ,陈国仁 ,许士娜
(贵阳中医学院 ,贵州 贵阳　550002)
摘要:目的 为准确鉴别威灵仙和柱果铁线莲种子提供依据。方法 采用扫描电镜法对威灵仙及柱果铁线莲的种子表面
特征进行比较观察。结果 威灵仙及柱果铁线莲种子之间在表面结构特征上具有一定的差别。结论 威灵仙及柱果铁线
莲种子的表面特征差异可以作为二者的鉴别依据。
关键词:威灵仙 ;　柱果铁线莲 ;　种子;　扫描电镜
中图分类号:R282.5　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2010)06-1503-02
　　威灵仙为毛茛科铁线莲属植物威灵仙 ClematischinesisOs-
beck, 棉团铁线莲 ClematishexapetalaPall, 东北铁线莲 Clematis
manshuricaRupr.的干燥根及根茎。具有祛风除湿 、通络止痛之
功效 ,主要用于治疗风湿痹痛 ,肢体麻木 , 筋脉拘挛 ,屈伸不利 , 骨
哽咽喉等症状 [ 1] 。文献报道 [ 2] , 柱果铁线莲 Clematisuncinata
Champ.的根及根茎作威灵仙药材销往南方各省。同时 , 柱果铁
线莲也是贵州省作威灵仙用的主流品种 [ 3, 4] 。目前关于威灵仙
与柱果铁线莲药材的紫外鉴别 、主要药效学及体内外化学成分的
比较已有研究报道 [ 5 ～ 7] , 但威灵仙及柱果铁线莲种子的比较研究
未见报道。由于威灵仙及柱果铁线莲药材均多以种子繁殖 , 且是
同科同属的植物 , 其种子在外形上相似 , 易于混淆。为了进一步
明确威灵仙及柱果铁线莲种子间的差异 , 现对威灵仙及柱果铁线
莲的种子表面特征进行观察 , 以期为威灵仙的种子分类鉴别及引
种栽培提供科学依据。
1　材料与仪器
1.1　材料 威灵仙种子采集于成都中医药大学药用植物园 , 经原
植物鉴定为威灵仙 ClematischinesisOsbeck;柱果铁线莲种子采集
于贵阳黔灵山 , 经原植物鉴定为柱果铁线莲 Clematisuacinata
Champ。
1.2　仪器 日立公司 S-3000N型扫描电镜。
2　方法
将样品种子在超声装置上超声清洗 2 min, 除去种子表面的
杂质和灰尘 , 再分别以 50%, 70%, 80%, 90%, 100%浓度乙醇梯
度脱水 ,自然干燥后用导电双面胶布将样品固定在样品台上。真
空喷金镀膜 90 s。取出将样品放入 S-3000N型扫描电镜观察
室 ,以 15kV加速电压进行观察。结果见图 1 ～ 15。
3　结果
3.1　威灵仙种子和柱果铁线莲种子的整体表面观
3.1.1　威灵仙种子的整体表面观 为扁卵圆形 ,表面黑灰色。长
3.7 ～ 5 cm,宽 2.9 ～ 4.1 cm, 厚约 0.9mm。种子两面中间各具一
圆卵形微凹。边缘较宽而厚 , 基部稍尖;种脐在尖头上凹陷 , 圆
形 ,小。花柱和种子表面可见密布的毛 ,黄白色 , 羽状。顶端有羽
状花柱残留 ,花柱长 1.5 ～ 4.0 cm, 花柱毛直径 10 ～ 12.5 μm, 黄
白色羽毛长约 3.0 mm(见图 1 ～ 3)。
3.1.2　柱果铁线莲种子的整体表面观 为圆柱近钻形 ,表面棕褐
色。长 0.6 ～ 0.7 cm,底部直径约 1.0 mm,中部直径约 0.8 mm。
顶部直径约 0.4 mm。 皱缩 , 有纵皱纹。基部钝平 , 稍突 , 种脐在
突起上微凹。种子表面无毛 ,或顶端有稀疏毛。顶端有羽状花柱
残留 ,花柱长 0.9 ～ 1.9 cm,花柱毛直径 10 ～ 30 μm, 黄白色羽毛
长 3 ～ 4 mm(见图 4 ～ 5)。
3.2　威灵仙种子和柱果铁线莲种子表面超微结构
3.2.1　威灵仙种子的表面超微结构 100×时可见侧面皱缩而成
的横皱纹(见图 2), 200 ×时在毛根部之间见到紧密的纵皱纹连
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LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2010VOL.21NO.6 时珍国医国药 2010年第 21卷第 6期