全 文 ：普通小麦-中间偃麦草 TAI-27中附加染色体
的显微切割及特异性探针的筛选＊
田　 ＊＊①　卢一凡②　邓继先②　李　滨③　张学勇④　刘广田①
(①中国农业大学植物科学技术学院 ,北京 100094;②军事医学科学院生物工程研究所 ,北京 100071;
③中国科学院遗传研究所 ,北京 100101;④中国农业科学院品种资源研究所 ,北京 100081)
摘要　　试验以长穗偃麦草基因组 DNA为探针 ,与普通小麦-中间偃麦草 TAI-27进
行染色体原位杂交 ,表明有4条与长穗偃麦草同源的染色体;以 P .stipifolia (St)基
因组 DNA为探针 ,有 4条与 St同源的染色体.这说明 TAI-27 中有 4条 St染色体.
TAI-27是异代换-附加系.对 TAI-27中附加的中间偃麦草染色体进行显微切割 ,并建
立其微克隆库 ,从中筛选获得了中间偃麦草的特异性探针 ,同源性分析表明该序列为
一新序列.这为进一步筛选抗病 、抗逆和优质基因打下基础.
关键词　　中间偃麦草　染色体　显微切割　特异性探针
中间偃麦草具有抗逆 、抗病和品质优良等重要的经济性状而成为小麦育种的重要材料 ,对
于小麦品种改良有重要价值.众多的育种学家利用各种途径培养了许多普通小麦-中间偃麦
草的异附加系 ,TAI-27是其中一个 ,具有较强的抗黄矮病性能[ 1] .因此筛选中间偃麦草的特异
性探针对于获得抗病 、抗逆和优质基因应用于小麦育种无疑具有重要意义.目前已对其进行
了多方面研究.但迄今未能获得相关基因.我们利用原位杂交方法鉴定了普通小麦-中间偃
麦草 TAI-27中附加的外源的中间偃麦草染色体 ,采用染色体显微切割和微克隆技术切割并建
立此染色体的微克隆库 ,从中筛选获得了中间偃麦草的特异性探针 ,为进一步筛选抗病 、抗逆
和优质基因打下基础.
1　材料和方法
1.1　材料
普通小麦-中间偃麦草异附加系 TAI-27(2n =44),由东北师范大学生物系何孟元先生惠
赠.中间偃麦草为黑龙江省农业科学院祁适雨所赠.克隆载体 pGEM 及“T”载体由军事医学
科学院生物工程研究所细胞工程室提供.
1.1.1　化学试剂和酶　　冰醋酸 、氢氧化钡等为国产分析纯或 AR级试剂.Wrights染色剂 、
　　　1998-01-24收稿 , 1998-08-14收修改稿
　　＊国家“九五”攻关项目基金资助项目(批准号:96-002-02-03-02)
　 ＊＊现工作单位:中国医学科学院心血管病研究所 ,北京 100037
中　国　科　学 (C　辑)　　　　　　 　
第 29 卷　第 2期 SCIENCE IN CHINA(Series C)　 1999 年 4月
醋酸洋红染色剂为 Sigma产品.限制性内切酶 ,T4DNA连接酶 , 4×dNTP , T4 多核苷酸激酶 ,蛋
白酶K ,TaqDNA聚合酶等购自华美生物公司和Promega公司.(α-32P)dATP 购自中国亚辉生物
技术公司.其他主要生化试剂为美国 Promega公司产品或国产 AR级试剂.
1.1.2　仪器　　细胞显微操作仪 ,日本岛津公司产品.PCR扩增仪(MiniCyclerTM),美国 MJ
Research公司产品.DNA序列分析仪 ,美国 HOEFER公司产品.
1.2　方法
1.2.1　染色体原位杂交　　参照 Chen 等人[ 2]的方法.制备好的染色体样本加 10 μL RNA
酶.37℃消化1 h ,用 50mL 70%甲酰胺变性 ,乙醇脱水 ,室温干燥.提取基因组DNA用生物素
标记 ,加入封阻 DNA后放于变性好的染色体片子上 ,于湿盒中 37 ～ 42℃杂交过夜 , FITC-A-
VIDIN检测后 ,荧光显微镜下镜检.
1.2.2　染色体显微切割　　在倒置显微镜下找到欲切割染色体 ,通过显微操作仪使微细玻璃
针对准所切割的区段进行切割.卸下玻璃针 ,折断于装有收集液的小离心管中 ,共切割染色体
30 ～ 40条左右.
1.2.3　微克隆库的建立　　切割染色体置于蛋白酶 K消化液中 60℃消化 2 h后 , 90℃煮
20 min , 灭活蛋白酶 K ,加入Sau3A5U , 37℃酶解4 h.加等量的酚∶氯仿抽提 ,乙醇沉淀.
参照Albani等人[ 3]设计 2条引物 P1:5′-GATCCTGAGCTCGAATTCGACCC-3′;P2:5′-GGGTC-
GAATTCGAGCTCAG-3′.引物 1磷酸化后 ,加入引物 2 ,90℃变性 2 min , 55℃退火 20 min.冷却
至室温成接头.
取染色体 DNA 2μL;接头2 μL;T4×buffer 2 μL;T4 ligase 2U;H2O 12 μL , 总体积 20μL ,
16℃连接过夜以制备连接子-接合体.
使用 P2为引物 ,以连接子-接合体作模板进行 PCR扩增.扩增程序:94℃变性 5 min.置
于冰上5 min ,加入 Taq酶(3 ～ 5U)0.5μL ,离心 ,94℃变性 1 min;45℃退火 3 min;72℃DNA延
伸2 min.35次循环 ,72℃延伸 10 min.取前一轮 PCR扩增产物 2 μL 为模板进行扩增 ,循环条
件如前.取10 μL PCR扩增产物进行 1.5%琼脂糖凝胶电泳 ,溴化乙锭染色 ,紫外灯下观察.
将所得PCR产物连接于 pGEM-T 载体上 ,建立微克隆库.
1.2.4　序列分析　　利用 pGEM载体两侧通用引物在 373A型 DNA自动序列分析仪上进行.
2　结果
2.1　原位杂交检测普通小麦-中间偃麦草异代换-附加系 TAI-27中的外源染色体
普通小麦-中间偃麦草 TAI-27根尖有 44条 ,见图 1.以长穗偃麦草基因组 DNA为探针 ,
“中国春”小麦(CS)DNA为封阻 DNA ,比例为 1∶35 ,与普通小麦-中间偃麦草 TAI-27的体细胞
中期染色体进行杂交 ,后用PI显色处理 ,结果见图 2.染色体间的颜色明显不同:呈现红色的
是小麦染色体 ,未与探针杂交而只经 PI染色;黄绿色的染色体是同探针杂交的外源染色体 ,其
中共有4条可与长穗偃麦草 DNA杂交 ,说明这 4条染色体与长穗偃麦草的某些染色体同源.
同时又以 Pseudoroegnoria stipifolia(St)基因组 DNA为探针 ,同样用 35倍的“中国春”小麦
DNA为封阻 ,与 TAI-27体细胞染色体杂交 ,如图 3.结果表明 ,在 TAI-27中同样有 4条外源染
色体 ,1对短的和 1对长的.因此在 TAI-27异附加系包括 40条小麦染色体外 ,还有 4条 St染
色体.
第 2 期 田　 等:　普通小麦-中间偃麦草 TAI-27中附加染色体的显微切割及特异性探针的筛选 175　
图1　普通小麦-中间偃麦草 TAI-27 的
根尖染色体图
图 2　标记长穗偃麦草基因组 DNA与
TAI-27 染色体原位杂交图
图 3　标记 P stipifolia 基因组 DNA与 TAI-27
染色体原位杂交
图 4　TAI-27 中外源染色体的显
微切割
由此看来 ,普通小麦-中间偃麦草 TAI-27 不仅是
附加了中间偃麦草的 St 染色体 ,而且存在 2条代换
的St染色体 ,TAI-27除了是异附加系外 ,同时也是代
换系.
2.2　普通小麦-中间偃麦草 TAI-27中附加染色体的
显微切割
染色体原位杂交方法确证了普通小麦-中间偃麦
草TAI-27中1 对附加的小的中间偃麦草的染色体 ,
从细胞水平证实附加染色体存在 ,这为利用显微切
割这一方法获得特异性探针打下基础.
附加在TAI-27中的中间偃麦草染色体较普通小
麦染色体小 ,在相差显微镜下不经显带即可认出.
因此省略分带过程 ,固定后不经染色直接制片 ,用以
作染色体显微切割 ,
如图 4.
　　这条附加在小麦中的小染色体极大可能有优质基因存在 ,
我们切割整条染色体 ,用以建立微克隆库.对 20个具有良好
分裂相的细胞进行了操作 ,共切割 40条染色体 ,蛋白酶K消化
后进行PCR扩增.
2.3　切割中间偃麦草染色体 PCR扩增
利用切割的 TAI-27中附加的中间偃麦草染色体作 PCR扩
增的模板 ,采用接头引物的方法进行 PCR扩增.切割下的染
色体经蛋白酶 K的消化后 ,加入限制性内切酶 Sau3A Ⅰ ,使切
割的染色体变成粘性末端的染色体片段.在 T4DNA连接酶的
作用下 ,使连接子与染色体片段相连接 ,成为连接子-接合体 ,
176　 中　　国　　科　　学　　(C　辑) 第 29卷
将其作为 PCR模板.经 3轮扩增后获得了较好的PCR产物 ,如图5.所得到的扩增产物 ,片段
长度大约在0.2 ～ 0.8 kb以内 ,分布均匀.
图 5　切割染色体 PCR扩增结果
1为λDNA/ HindⅢ+EcoRⅠMarker;2 ,3 , 4为
PCR扩增产物
2.4　中间偃麦草染色体微克隆库的建立
将 PCR 产物经低熔点琼脂糖凝胶电泳回收 , 与
pGEM的“T”载体进行连接 ,经 X-gal蓝白斑选择 ,获得约
500 000转化子.为了鉴定插入片段大小 ,我们随机挑
取60个转化子(达到小样本数量)抽提质粒电泳鉴定 ,
所建立的微克隆库插入片段的大小约为 1 kb 以内(图
略).
2.5　中间偃麦草特异性探针的筛选和鉴定
从所建立的微克隆文库中 ,随机挑选 60个白色菌
落 ,快速抽提质粒.采用核酸杂交的方法进行筛选.
中间偃麦草是麦类属 ,与小麦有一定的同源性.因
此标记了中间偃麦草基因组 DNA ,同时也标记了 3B-2
小麦基因组DNA.以它们为探针同时对挑取的 60个重
组质粒进行杂交鉴定(图略).用标记了中间偃麦草基因组 DNA作探针杂交获得 60个阳性克
隆 ,用标记了 3B-2小麦基因组 DNA做探针杂交有 5个未有阳性信号.结果说明所克隆的这 5
个基因片段在核苷酸序列上与中间偃麦草同源 ,其来源于在 TAI-27中附加的中间偃麦草的基
因片段 ,而与 3B-2小麦无关.我们将这 5个阳性克隆命名为TC-1 ,TC-2 ,TC-3 ,TC-4和TC-5.
2.6　中间偃麦草特异性探针的序列分析
将所获得克隆在 373A自动序列分析仪上进行分析 ,将所获得的序列在核酸序列库中进行
了同源性分析 ,仅TC-2未能获得同源序列 ,表明该序列为一未报道的新序列.
测定的序列如下:
5′-TGG GTG CGA ATT CGA GCT CAG GAT CCA TAT
CGG TGA ATT TGA ATT GTT AAG GTT TTG GTA
GTG GCT ATG TCC AGA TGA ACT CGA TGG TCC
GGG TAG GAA GTA TCG GTG GGG CCG AGT TGG
AAT TTA GGG TTT TGA CGT ATT TGG GAT AGA
GAA AGT GGC TGA GGG TTT TGG AGC AAT ATC
ACT AAG CAC TGT GCA GCA AAC AGA TCA AGG
TGA CTG NAA AGA AAG TTG TTG TCA TCT TGG
TAT CGT GGT ATC CCT CCA TTG TAT ATT CCC
TTG CAA TTG CAT GAT AAT CCC TAG CCT ATT
TGA GTA TTG CTG GCC ACG TTA CTG TGG CAC
ATA ATG ATC CNG AGC TCC AAT TCG ACC CAG
　　　　　　　GTT CGA AAA C-3′
(序列中 N代表 A或G).
我们所获得的中间偃麦草特异性探针 ,是首次从染色体切割并建立微克隆库中筛选出来
第 2 期 田　 等:　普通小麦-中间偃麦草 TAI-27中附加染色体的显微切割及特异性探针的筛选 177　
的.这为利用中间偃麦草改良小麦品质奠定了基础.
3　讨论
3.1　中间偃麦草染色体来源
中间偃麦草(Th .intermedium)原名天兰冰草(Ag.intermedium)是普通小麦的近缘种 ,它是
耐锈病和抗大麦黄叶病毒 、耐旱 、耐寒及耐盐且种子蛋白含量高的珍贵基因资源.从Wrenhues
(1966)就开始利用它对小麦进行品种改良.中间偃麦草是具有 E1 , E2及 X 3种染色体组的六
倍体(2n =6X=42 , E1E1E2E2XX).其中 , E1和 E2染色体与 Th.elongatum 的 E 染色体和 Th .
bessarabicum 的 J染色体相关联.Liu和Wang[ 4]又通过实验证明中间偃麦草中的 X染色体即来
源于 Pseudoroegneria 中的 St 染色体(原来称作 S 染色体).因此中间偃麦草实际上也是
(E1E1E2E2StSt),从而搞清了中间偃麦草染色体的起源.
3.2　TAI-27中外源染色体的鉴定
本试验中曾应用中间偃麦草作为探针进行检测但未获得成功 ,因此应用了与中间偃麦草
同源关系很近的另外 2 个种 Pseudoroegneria stipifolia 和长穗偃麦草.其中 , Pseudoroegner-
iastipifolia(2n=14)为 St染色体 ,与中间偃麦草(E1E2St)中的 St 同源[ 5] ,而长穗偃麦草 R431
(E1E1E2E2E1E2StSt2n=56)则完全具有 E染色体和 St染色体[ 6] .因此用 Pseudoroegneriastipifolia
和长穗偃麦草基因组 DNA作探针完全可以鉴定普通小麦-中间偃麦草的附加系 ,并且可鉴定
外源染色体的来源.
我们应用生物素标记长穗偃麦草基因组 DNA同时混合未标记的“中国春”小麦 DNA 作遮
盖 ,与 TAI-27根尖细胞染色体杂交时很明显地检测出 2对外源染色体 ,而用只有 St染色体的
Pseudoroegneria stipifolia 作探针得到同样的结果。中间偃麦草含有与长穗偃麦草同源的 St染
色体.TAI-27曾有异附加系的报道[ 7] ,TAI-27的体细胞染色体数为 44.本文通过原位杂交的
试验 ,结果则表明TAI-27具有 40条小麦的染色体和 2对St染色体 ,因此可以推论它不仅是添
加了 1对中间偃麦草的 St染色体 ,而且原有的 42条小麦染色体(ABD)中有 1对为中间偃麦草
St染色体所代换.但究竟是哪 1对小麦的染色体被代换还有必要做深入研究.
3.3　染色体显微切割及微克隆
染色体显微切割和微克隆技术中 DNA 的损失是一个主要问题.在实验中 ,我们参照 Al-
bani等人[ 8]的方法并加以改进 ,把吸附的染色体片段的针尖直接折断于一 0.5 mL 已装有染色
体收集液的小离心管中 ,蛋白酶 K消化后 ,用酚∶氯仿∶异戊醇去蛋白 ,以此作为模板进行 PCR
扩增 ,取得较为理想的效果.
利用 PCR扩增建立微克隆库具有极大的优越性 ,然而扩增未知序列却存在困难.利用染
色体中的特定位点 ,设计特定的连接子 ,将 PCR技术引入未知序列的扩增中.在本试验中我
们对切割的染色体拼加接头 ,以接头序列作引物进行扩增.所使用的接头是几个酶切位点的
组合 ,其中 1条19mer , 另1条 23mer , 19mer刚好与23mer匹配 ,而23mer较19mer 多-GATC4个
碱基 ,因此 2条引物退火后为一具有粘端-GATC 的连接子.限制内切酶 Sau3A可识别 4个碱
基序列GATC ,酶切片段为粘端.用 Sau3A酶解染色体会产生大量的具有-GATC粘末端的小片
段DNA.酶切后的染色体 DNA与连接子可粘端相连 ,利用接头的已知序列进行 PCR扩增.
在人类 、哺乳动物及植物上都获得了成功[ 7] .
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3.4　普通小麦-中间偃麦草 TAI-27中附加的中间偃麦草小染色体特异性探针的获得及在品
种改良中的意义
中间偃麦草为小麦育种的重要材料 ,对于小麦品种改良有重要价值.众多的育种学家利
用各种途径培养了许多普通小麦-中间偃麦草的异附加系 ,TAI-27是其中 1个 ,具有较强的抗
黄矮病性能.
Zhang 等人[ 9]报道 ,TAI-27和TAI-22(与 TAI-27属一套异附加系 ,亲本为中 4)都有 1对小
的染色体.八倍体小冰麦中3 、中4是普通小麦的染色体附加了中间偃麦草的1个染色体组而
且不同于中 1 、中 2[ 10] .有证明中 3 、中 4抗病性较强[ 11] ,因此认为中 3 、中 4中携带的中间偃
麦草的 1组染色体具有较强的抗性[ 9] .Zhang 等人[ 1]通过原位杂交证实中 4 1对小染色体属
于St染色体.这对小的染色体在中 1 、中 2 、中3 、中5中不存在.通过BYDV抗性试验 ,确定中
间偃麦草的抗 BYDV基因定位于 St染色体上[ 1] .TAI-27这一材料经鉴定其抗病性极强 ,而亲
本普通小麦3B-2则易感病[ 10] .
可以看出 ,附加在TAI-27中的 1对小的St染色体可能含有抗大麦黄叶病毒的基因.我们
在原位杂交的基础上 ,通过染色体切割方法获得了中间偃麦草的 St染色体.采用 PCR扩增方
法建立了微克隆库.以基因组 DNA为探针 ,从所建立的文库中筛选 1个中间偃麦草的特异性
探针.在酶切鉴定的基础上 ,进行了序列分析.这是首次从染色体切割并建立微克隆库中筛
选出来的 ,这一探针的获得使今后利用中间偃麦草的优质基因 ,进行连锁标记 、建立中间偃麦
草的基因组文库 、筛选出优良基因成为可能 ,为未来小麦分子育种奠定了基础.
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