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18个早熟禾品种SSR指纹图谱的构建



全 文 :18个早熟禾品种SSR指纹图谱的构建
赵闫闫,喻 凤,李 媛,窦全文
(中国科学院西北高原生物研究所,青海 西宁 810000)
  摘要:利用从草地早熟禾(Poa pratensis)基因组中开发出来的3对多态性SSR引物,对18个早熟
禾品种进行分子指纹图谱鉴别研究。结果表明:3对引物在18个品种中共检测出16个多态性片段,每
对引物可以检测到4至6个数目不等的片段,平均为5.33个,片段大小介于152至227bp。利用单一
引物可将18个品种区分为5~11种类型,平均为8.33个类型。利用这3对SSR多态性引物指纹图谱
可以将18个品种完全区分开。研究构建的指纹图谱可作为对文中18个早熟禾品种进行区分的重要参
考依据,同时筛选出的对核心引物也可以用来构建其他早熟禾品种的指纹图谱。
  关键词:早熟禾;SSR标记;指纹图谱;品种鉴别
  中图分类号:Q 789  文献标识码:A  文章编号:1009-5500(2016)01-0031-05
  收稿日期:2015-05-28;修回日期:2015-12-03
  基金项目:青海省科技厅科技促进新农村建设计划项目
(2013-N-515)资助
  作者简介:赵闫闫(1990-),女,安徽蚌埠人,在读硕士生。
E-mail:yanyanziji@126.com
窦全文为通讯作者。
  早熟禾属(Poa)为禾本科早熟禾亚科,全世界约
有500多种,我国早熟禾资源丰富,约有100多种,广
泛分布于西北、华北、东北等地区。早熟禾属内多数植
物再生能力强、繁殖力强、耐寒、耐旱,而且营养丰富、
绿色周期长,不少种是天然和人工种植利用的优质牧
草,也是草坪绿化常用植物[1,2]。我国的早熟禾育种起
步较晚,一些早熟禾品种都是在我国本土遗传资源基
础上选育出的,其具有良好的环境适应特性,在牧草生
产以及生态环境恢复中起着不可替代的作用,如在青
藏高原地区人工种植利用青海草地早熟禾(P.praten-
sis)、青海扁茎早熟禾(P.pratensis var.anceps)、以及
青海冷地早熟禾(P.crymophila)等[3-6]。
在对早熟禾实际应用中,需要针对不同生态环境
和不同利用目的选择性地利用不同的品种,但早熟禾
的表型性状区别不明显,通过形态很难鉴别这些品
种[7]。20世纪90年代DNA指纹图谱技术就是有效
的分子手段,克服了易受环境影响、周期长、工作量大
等传统鉴定手段的缺点,可以对品种真实性和纯度进
行快速、准确的鉴定[8]。在早熟禾早期的指纹图谱的
研究中,研究者利用RAPD、AFLP、ISSR等分子标记
技术对早熟禾进行品种分类和多样性鉴定[1,2,9-12],但
是有研究结果表明,利用某些分子标记的品种鉴定结
果与形态鉴定结果不一致[9]。Honig等[13]于2010年
首次从草地早熟禾基因组DNA中分离得到了88个
多态性SSR分子标记,进一步利用其中22个标记对
247个品种和材料进行分类研究,结果表明SSR分子
标记分类结果与形态学分类、以及系谱分析等具有很
好的一致性[14]。
笔者在试验室开发出的15对多态性SSR分子标
记基础上[15],筛选可用于品种指纹图谱构建的多态性
核心引物,并进一步利用这些核心引物对15个国外引
进的草地早熟禾品种和3个青海本土早熟禾品种构建
指纹图谱。
1 材料和方法
1.1 供试材料
3个青海本土早熟禾品种种子由青海省牧草良种
繁殖场提供,其他15个进口草地早熟禾品种购自相关
牧草或草坪草种子供应公司(表1)。
1.2 草地早熟禾叶片DNA提取
将所有试验材料发芽,单粒种植于小钵中,待试验
需要时取其叶片提取 DNA。采用文献 [16]改良
CTAB法提取基因组DNA。每个品种随机选取10株
13第36卷 第1期           草 原 与 草 坪2016年
DOI:10.13817/j.cnki.cyycp.2016.01.006
苗的叶片混合提取DNA。
1.3 SSR-PCR扩增及检测
SSR-PCR反应体系:总体系25μL,DNA 1μL
(50ng/μL),10×PCR Buffer 2.5μL (含 Mg
2+),
dNTP 2.0μL(2.5mmol/μL),Taq DNA聚合酶0.3
μL(5U/μL),上下游引物均为0.5μL(10μmol/μL),
ddH2O 18.2μL。扩增程序95℃预变性5min;94℃
变性30s,55~50℃退火30s,72℃延伸30s,共30
个循环;最后72℃延伸10min,4℃保存。所有反应
在Applied Biosystems PCR仪上进行。PCR扩增产
物在8%聚丙烯酰胺凝胶上用1×TBE缓冲液进行电
泳分离,经EB稀释液染色后,用Bio-Rad自动成像系
统照相,后将所得的SSR谱带和数据进行分析。
表1 18个早熟禾品种
Table 1 Tested 18 Poacultivars
序号 品种 英文名称
1 青海草地早熟禾 P.pratensis cv.Qinghai
2 骑士 Knight
3 帝国 Kingdom
4 爱美 Amilyblue
5 布鲁克 Brooklawn
6 水晶 Crystal
7 肯塔基 Kentucky
8 午夜 Midnight
9 黑珍珠 Rhythm
10 勇士 Warrior
11 世外桃源 Arcadia
12 奖品 Award
13 武士 Geronimo
14 百斯特 Barrister
15 优异 Merit
16 公园 Park
17 青海扁茎早熟禾 P.pratensis var.anceps cv.Qinghai
18 青海冷地早熟禾 P.crymophilacv.Qinghai
  注:1,17,18序号的品种原于青海,2~16序号的品种来源
于美国
2 结果与分析
2.1 多态性引物筛选
在草地早熟禾中开发出的15对多态性SSR标记
引物中,有13对引物在扁茎早熟禾中有扩增产物,同
时在这13对中有7对SSR引物在青海冷地早熟禾中
有扩增产物[15]。利用这15对SSR引物进一步对18
个早熟禾品种进行多态性分析,筛选出多态性丰富、扩
增条带稳定、清晰的引物3对(表2)。
表2 多态性SSR引物
Table 2 Polymorphic SSR primers
引物
名称
引物序列
片段大
小/bp
Ta
/℃
Poap5
F:GCTTCTTAGAATGGAGGTC
R:ATCAGAGGGAGATTTTGC
220-227 55
Poap9
F:AGAGGAAAACTCTTCTCTCTG
R:GAAAGCAACAAGCACCT
152-170 55
Poap10
F:TCGCTTGAGTTGCTGTAC
R:AAGGTTTCCAAATAGGCT
190-222 50
  利用筛选出的3对引物在18个品种中共检测出
16个多态性片段,每对引物可以检测到4~6个数目
不等的片段,平均为5.33个,片段大小为152~227bp
(表3)。
表3 18个早熟禾品种中检测到的SSR标记片段
Table 3 SSR fragments detected in 18cultivars
引物 片段数量 片段大小/bp
Poap5  4  220,223,225,227
Poap9  6  152,154,160,165,167,170
Poap10  6  190,192,197,202,220,222
2.2 指纹图谱构建
利用筛选到的核心引物对18个早熟禾品种进行
指纹图谱的构建,其中利用引物Poap10的指纹图谱如
图1所示。进一步将3对引物对8个品种指纹图谱加
以数字化制成表格,如表4所示。单独利用SSR引物
图1 SSR引物Poap10在18个早熟禾品种中的电泳图
Fig.1 Electrophoresis of 18cultivars by using SSR marker Poap10
注:M为DNA分子量marker;1~18为不同早熟禾品种,序号与表1一致
23       GRASSLAND AND TURF(2016)            Vol.36No.1
Poap5根据带型组合可以将18个品种分类成5种类
型,利用引物Poap9可以将18个品种分成9种类型,
利用引物Poap10也可以将18个品种分成不同的11
种类型。利用引物组合 Poap5和 Poap9、以及利用
Poap5和Poap10可以将18个品种中12个品种进行
准确区分,利用引物组合Poap9和Poap10可以将18
个品种中14个品种进行区分,联合应用这3对应物可
以将18个品种中每一个品种进行准确区分。
表4 3对引物在18个早熟禾品种的SSR指纹图谱
Table 4 SSR fingerprint in 18cultivars with 3pairs of primers
引物 片段大小/bp
早熟禾品种
1  2  3  4  5  6  7  8  9  10  11  12  13  14  15  16  17  18
poap5  220  0  0  0  1  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0
223  1  0  0  0  0  1  0  0  1  0  0  1  0  0  1  1  0  0
225  0  1  1  0  1  0  0  1  0  1  0  0  0  1  0  0  0  0
227  0  0  0  0  0  0  1  0  0  0  1  0  0  0  0  0  0  0
poap9  152  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  1  0  0  0  0  0  0
154  1  0  0  0  0  0  1  0  0  1  0  0  0  0  0  1  1
160  0  0  0  1  0  0  0  1  0  0  0  0  0  1  0  1  0  0
165  0  0  0  0  0  0  0  0  1  1  0  1  1  0  0  0  0  0
167  0  0  0  0  0  1  0  0  0  0  0  0  0  0  1  0  0  0
170  0  1  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  1
poap10  190  0  0  0  0  0  0  1  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0
192  1  0  0  0  0  0  0  1  1  0  0  0  0  0  0  0  0  0
197  0  0  0  1  1  0  0  0  0  0  1  0  1  0  0  0  0  0
202  0  0  1  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  1  0  1  1  1
220  1  1  0  0  0  0  1  0  0  1  0  1  0  0  0  0  0  0
222  0  0  1  0  0  0  0  0  0  0  1  0  0  0  1  0  0  0
3 讨论与结论
草地早熟禾为早熟禾类植物中利用最为广泛的物
种,由于其兼性无融合生殖特性,草地早熟禾在染色体
数目上呈现较高的变异性,在群体中有不同倍性以及
非整倍体个体的存在[17,18,19],这种复合多倍体使得草
地早熟禾种内具有很高的遗传多样性[20]。从草地早
熟禾基因组中开发的基因组SSR标记在草地早熟禾
不同材料间呈现很高的多态性,检测到的SSR标记等
位基因平均数量随着检测材料数量和标记数量的增多
呈显著上升趋势,试验中利用3个SSR标记对18个
品种进行检测,检测到多态性平均为5.33个,Honig
等利用25个SSR标记对247个品种(材料)进行多态
性分析,检测到的多态性位点平均为16.04个[11],利
用88个SSR标记对265个品种(材料)进行多态性分
析,88个SSR标记能够检测到的等位基因位点平均为
38.83个[12]。同时,由于草地早熟禾群体遗传结构组
成的特殊性,利用同一引物在不同个体或同一个体中
有可能检测到1个以上的等位基因位点,草地早熟禾
的这种变异特性,极大地提高了SSR标记对不同品种
和材料的分辨能力。
试验研究中18个早熟禾品种中,16个品种为草
地早熟禾品种,其他2个品种分别为扁茎早熟禾和冷
地早熟禾品种,而利用的3个SSR标记是从草地早熟
禾中开发出来的,其中,2个标记在扁茎早熟禾和冷地
早熟禾中有扩增产物,1个标记没有扩增产物,标记
Poap5可以显著地将扁茎早熟禾、冷地早熟禾品种与
其他草地早熟禾品种区分出来,进一步可以利用
Poap9可将扁茎早熟禾品种和冷地早熟禾品种进行区
分。由于迄今只有少量其他早熟禾物种中具有可供利
用的SSR标记[21],因此,在其他早熟禾物种品种鉴别
中借鉴利用从草地早熟禾中开发出来的SSR标记,不
33第36卷 第1期           草 原 与 草 坪2016年
失为一种简便、快速的手段。
SSR分子标记指纹图谱技术已经在小麦、水稻、玉
米等农作物品种中得到广泛应用,由于SSR分子标记
技术在早熟禾研究中起步较晚,利用SSR分子标记对
早熟禾品种进行指纹图谱鉴定鲜见报道,在本研究中
尝试利用SSR分子标记对18个早熟禾品种进行鉴
别,结果表明由于早熟禾的高变异特性,利用少量的
SSR标记就可以实现对不同品种的准确区分。同时,
SSR标记具有检测操作过程简便、结果稳定等优点,相
信SSR指纹图谱构建技术在早熟禾品种鉴别中将会
得到越来越广泛的应用。
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(下转43页)
43       GRASSLAND AND TURF(2016)            Vol.36No.1
cold resistant strains of alfalfa in seedling stage,the response of physiological and biochemical indexes to low
temperature was studied and the screening of sensitive physiological and biochemical indices in seedling was con-
ducted.The results showed that GPX,FP,APX,SOD and MDA were the most sensitive indicators,CAT,SS
and SP were the more sensitive indicators for alfalfa leaves;SP,MDA and FP were the most sensitive indicators,
CAT,SS and SOD were the more sensitive indicators for stems,APX and GPX were not the sensitive indicators
for alfalfa leaves and stems.By using comprehensive evaluation,the cold-resistance order of alfalfa was K2>K3
>K1> Ru.
  Key words:alfalfa;seedling stage;cold-resistance sensibility;physiolog
檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪
icalandbiochemicalindex
(上接34页)
Fingerprint establishment of 18 Poa pratensis
cultivars with SSR markers
ZHAO Yan-yan,YU Feng,LI Yuan,DOU Quan-wen
(Northwest Institute of Plateau Biology,Chinese Academy of Sciences,Xining810000,China)
  Abstract:The fingerprint of 18 Poa pratensis cultivars was established by using 3polymorphic simple se-
quences repeat(SSR)markers developed from genomic DNA of P.pratensis.Totaly 16polymorphic SSR
fragments were detected in al tested cultivars,and 4to 6aleles were detected by each pair of SSR primer with
an average of 5.33.The band size varied from 152bp to 227bp.18cultivars could be divided into 5to 11
groups by single polymorphism primer,with an average of 8.33.18cultivars could be distinguished thoroughly
by the fingerprinting maps constructed by the 3pairs of SSR primers.The constructed fingerprinting maps are
important references to discriminate the 18tested cultivars.Furthermore,the screened 3polymorphic SSR
markers can be useful to establish fingerprint for other cultivars.
  Key words:P.pratensis;SSR marker;fingerprinting;cultivar identification
24       GRASSLAND AND TURF(2016)            Vol.36No.1