全 文 ：山西大学学报 (自然科学版 ) 31( 2): 244～ 247, 2008
Journal of Shanxi Univ ersity( Na t. Sci. Ed. )
　　文章编号: 0253-2395( 2008) 02-0244-04
基于 ISSR标记技术的金钱豹遗传多样性分析
朱　军1 ,王立斌2 ,郭东龙2 ,马恩波2 ,任竹梅2*
(山西省林业厅 ,山西 太原 030012; 2.山西大学 生命科学与技术学院 ,山西 太原 030006)
摘　要: 采用 ISSR-PCR技术为分子标记 ,对不同地区金钱豹的分子遗传多态性进行研究 .采用非损伤性取样方法
采集血样或从死亡的样本中取内脏组织 ,提取基因组 DN A,筛选合适的 I SSR引物进行随机扩增 ,用 PopGen、 Ntsys
等软件进行数据分析 ,检测其遗传分化程度 . N ei’ s指数计算的遗传一致度和遗传距离以及聚类关系显示 ,金钱豹 9
个个体遗传一致度为 0. 517 5～ 0. 886 0,遗传距离为 0. 121 1～ 0. 593 1,金钱豹不同个体之间存在一定程度的差异 ,
其中宁武的两兄妹个体关系密切 ,个体之间的遗传关系同性别和地理位置没有明显的对应关系 .
关键词: 金钱豹 ; ISSR标记技术 ;遗传多态性
中图分类号: Q75　　　文献标识码: A
豹 ( Panthera pardus ) ,又名金钱豹、土豹子、花豹 ,隶属于猫科、豹属 ,是我国一级保护动物 .金钱豹身体
强健、行动敏捷 ,性情凶猛残忍 ,数量稀少 ,研究工作中存在着许多困难 .目前 ,我国对金钱豹的研究主要限于
资源调查、保护、饲养繁育以及精子结构形态观察和细胞学等方面 [ 1- 5] ,分子水平上的研究仅见零星报
道 [6, 7 ] ,分子遗传多态性方面的研究尚属空白 .
ISSR技术是以 PCR技术为基础 ,利用真核生物基因组广泛存在的简单重复序列设计引物 ,对基因组
DNA进行扩增 ,产物经电泳分离获得扩增指纹图 ,统计分析结果可以揭示样本间的遗传多样性 [8, 9 ] .
本研究以采自山西省和河北省 8个地区的金钱豹为研究对象 ,采用非损伤性取样方法采集血样或内脏
组织 ,以 ISSR为分子标记 ,检测其 DNA多态性及遗传分化程度 ,同时建立金钱豹不同地区个体之间的聚类
关系 ,结合已有的形态、生态学研究结果进行综合分析 ,为金钱豹的野生种群保护和繁殖以及相关研究提供
分子生物学方面的依据 .
1　材料与方法
1. 1　实验材料
本实验所用材料具体信息见表 1.
表 1　金钱豹样本来源
Table 1　 Information of Panthera pardus samples
编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9
采集地 石家庄 闻喜 汾阳 黎城 平遥 宁武 宁武 晋城 古县
组织 血液 血液 血液 血液 心脏 血液 血液 血液 心脏
性别 雌 雄 雌 雄 雌 雄 雌 雌 雌
1. 2　实验方法
收稿日期: 2007-10-24
　　 基金项目:国家自然科学基金 ( 30670361);山西省自然科学基金 ( 2007011078)
　　 作者简介: 朱　军 ( 1965-) ,男 ,高级工程师 ,主要从事野生动物的保护与管理工作 .* 通讯联系人: 任竹梅 E-mail: zmren
@ sxu. edu. cn
DOI : 10. 13451 /j . cnki . shanxi . uni v ( nat . sci . ) . 2008. 02. 008
1. 2. 1　总 DNA提取
冷冻保存的抗凝血解冻 ,取 100μL于 1. 5 mL离心管中 ,加入 2倍体积 TES,混匀 . 10 000 r /m ,离心 10
min,弃上清 ,加入 100μL TES缓冲液 ,然后建立蛋白液消化体系 ,按传统的酚 -氯仿法提取总 DNA.
　　对于心脏 DNA提取 ,取冷冻组织块 ,研碎后建立消化体系 ,用酚 -氯仿法提取总 DNA.
1. 2. 2　 ISSR-PCR扩增
金钱豹 ISSR-PCR扩增反应体系为 20μL: 模板 DNA 25 ng～ 50 ng , 2. 0 mmol· L- 1 Mg2+ ,质量浓度为
2%甲酰胺 , 0. 25 mmo l· L- 1 dN TP, 0. 3μmol· L- 1引物 , 1. 5 U Taq DNA聚合酶 .反应条件为: 94℃ 2 min,
94℃ 30 s, 68℃ 30 s, 72℃ 1 min,之后每个循环退火降低 0. 7℃ ,运行 13个循环 ;然后进行 25个循环 , 94℃ ,
30 s; 55℃ , 30 s; 72℃ , 1 min,最后在 72℃充分延伸 5 min(扩增产物 15μL上样检测 , 1. 8%琼脂糖凝胶电
泳 ,凝胶成像分析系统观察、照相统计分析 . )
1. 2. 3　引物筛选
从 UBC( Universi ty of Bri tish Co lumbia)标准 ISSR引物中筛选出用于金钱豹 ISSR扩增的引物 ,其编号
和序列见表 2.引物由上海生物工程公司合成 .
表 2　引物编号及序列
Table 2　 Codes and sequences of ISSR-primers
编号 序列 ( 5′→ 3′) 编号 序列 ( 5′→ 3′)
807 ( AG) 8 848 ( GA )8YC
809 ( AG)8 G 857 ( AC)8 YG
811 ( GA) 8C 866 ( C CT )6
815 ( C T) 8G 873 ( GAC A)4
818 ( CA )8G 881 GGG T ( GG GGT ) 2G
826 ( AC)8 C 888 ( CA) 8
827 ( AC)8G
1. 2. 4　数据统计与分析
PCR扩增产物电泳照相后 ,统计“ 0, 1”数据 . ISSR为显性标记 ,按凝胶同一位置上 DNA带的有无进行
统计 ,清晰可见的强带或反复出现的弱带记为 1,无带记为 0,形成二元数据矩阵用 PopGen、 Ntsy s等软件进
行多态性分析 .
2　结果分析与讨论
2. 1　总 DNA提取和 ISSR-PCR扩增
2. 1. 1　总 DNA提取
金钱豹总 DNA提取电泳检测结果见图 1.图中可以看出 ,金钱豹总 DNA提取效果很好 ,对 1号和 5号样
品在扩增时要进行适当倍数的稀释 , 2号样品降解严重 ,要重新提取 .
图 1　金钱豹总 DNA提取电泳检测结果 ( M为λDN A)
Fig . 1　 Elect ropho resis r esult of Panthera s genome
DN A from pa rtial samples
2. 1. 2　 ISSR-PCR扩增
用筛选的 13条随机引物对金钱豹 9个个体进行扩
增 ,部分样本电泳检测结果见图 2.数据统计显示 ,
ISSR-PCR扩增金钱豹样品共获得114个清晰、稳定的
片段 ,大部分片段分子量大小在 200 bp～ 2 500 bp之
间 ,少数达到 4 kbp左右 .平均每条引物扩增的条带数
为 8,最多的为 13条 ,最少的为 6条 .
2. 2　数据分析
2. 2. 1　多态位点
不同的 ISSR引物在不同金钱豹中所检测出的 ISSR位点以及多态位点数不同 ,平遥个体由这 13个引物
检测出的位点最多 ,为 26,石家庄的个体最少 ,仅有 18.
245　　　　　　　　 　　　　　 　朱　军等:基于 ISSR标记技术的金钱豹遗传多样性分析
图 2　金钱豹部分样品 I SS R扩增电泳图谱 ( M: 200 bp Ladder)
Fig . 2　 ISSR-PCR electr ophosesis result of par tial Panthera s samples
2. 2. 2　遗传距离和遗传一致度
由 Nei’ s指数计算的遗传一致度和遗传距离见表 3,可以看出金钱豹不同个体之间存在一定程度的差
异 ,其中石家庄个体与平遥个体之间的遗传差异最大 ,晋城个体与古县个体之间的遗传差异最小 .
表 3　金钱豹 9个个体间的遗传一致度和遗传距离
Table 3　Ne i s genet ic identity ( above diagonal) and genetic distance ( below diagonal)
of 9 individuals of Panthera pardus detected with 13 primers
Code 1 2 3 4 5 6 7 8 9
1 * * * * 0. 605 3 0. 684 2 0. 701 8 0. 517 5 0. 640 4 0. 631 6 0. 614 0 0. 675 4
2 0. 502 1 * * * * 0. 657 9 0. 570 2 0. 754 4 0. 631 6 0. 728 1 0. 605 3 0. 561 4
3 0. 379 5 0. 418 7 * * * * 0. 789 5 0. 640 4 0. 728 1 0. 631 6 0. 719 3 0. 798 2
4 0. 354 2 0. 561 8 0. 236 4 * * * * 0. 605 3 0. 850 9 0. 578 9 0. 719 3 0. 886 0
5 0. 658 7 0. 281 9 0. 445 7 0. 531 5 * * * * 0. 666 7 0. 728 1 0. 675 4 0. 649 1
6 0. 445 7 0. 459 5 0. 317 4 0. 161 5 0. 405 5 * * * * 0. 587 7 0. 693 0 0. 754 4
7 0. 459 5 0. 317 4 0. 459 5 0. 546 5 0. 502 1 0. 317 4 * * * * 0. 736 8 0. 552 6
8 0. 487 7 0. 502 1 0. 329 5 0. 329 5 0. 392 4 0. 366 8 0. 305 4 * * * * 0. 780 7
9 0. 392 4 0. 577 3 0. 225 3 0. 121 1 0. 432 1 0. 281 9 0. 593 1 0. 247 6 * * * *
　注 : 1.石家庄 2.闻喜 3.汾阳 4.黎城 5.平遥 6.宁武 7.宁武 8.晋城 9.古县 其中 6, 7为同一窝兄妹
2. 2. 3　聚类分析
为了进一步研究各个个体间的遗传关系 ,基于 Nei的遗传距离采用 U PGM A方法构建金钱豹不同个体
之间的聚类树 (图 3) .根据聚类图 ,金钱豹 9个个体共分为两大聚类簇 ( I和 II)四个分支 .聚类簇 I包含黎城、
古县、闻喜、汾阳、石家庄的个体 ; II类簇包括平遥、宁武、晋城的个体 .
图 3　基于 I SSR数据构建的金钱豹 UPGM A树
Fig . 3　 UPGM A tree o f Panthera pardus based ISSR data
　　本研究所用金钱豹样本均采集自野外生活种 ,其
中石家庄个体为省间动物园交换样本血样 ,其余血液
样本均来自山西省野生动物救护中心救护的个体 ,这
些个体现均在太原动物园饲养 ,心脏样品的两个金钱
豹是其进入生活区对居民造成危险时被迫击毙后及时
采集的组织材料 .从聚类图来看 ,除了宁武的两个个体
相聚为一支 ,显示很近的亲缘关系 ,与本身是一窝的兄
妹有关外 ,其余不同来源金钱豹个体之间的遗传关系
没有明显的规律性 ,与本身的性别和地理分布也均没
有明显的对应关系 .这可能与金钱豹本身的生活习性
和生态学特点关系密切 .作为一种大型肉食动物 ,该种在山西省分布较广 ,活动范围较大 ,不同地区样本个体
之间很可能发生基因交流 ,从而影响其遗传结构 .鉴于该物种更多的特殊性 ,标本获得难度较大 ,本文的结果
也可能与本研究所选个体数较少有关 ,今后的工作将尽可能的收集标本材料 ,采用其他的分子标记如
AFLP、 DNA序列分析等方法进行深入探讨 ,为金钱豹的繁衍和保护提供分子生物学方面的基础资料 .
246 山西大学学报 (自然科学版 )　　　　　　　 　　　　　　　　 31( 2)　 2008　
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Genetic Diversity of Panthera pardus Based on ISSR Markers
ZHU Jun1 , WANG Li-bin2 , GUO Dong-long2 , M A En-bo2 , REN Zhu-mei2
( 1. Shanx i Prov incial Forestry Department , Taiyuan 030012,China;
2. School of Lif e Science and Technology , Shanx i University , Taiyuan 030006,China)
Abstract: The genetic div ersity o f Panthera pardus f rom 8 di fferent locations w as examined using inter-
simple sequence repeat ( ISSR) ma rkers. The samples of blood or tissue w ere co llected using undamaged
sampling methods, then the to tal genome DN A were isolated and ISSR-PCR finished using chosen primers.
The“ 0” and “ 1” data w ere analy zed using Popgene sof tw are and the genetic distances w ere calcula ted and
the ph ylog enetic tree const ructed by using U PGMA method. The results show ed tha t genetic distances
betw een dif ferent individuals o f P. pardus were betw een 0. 517 5 and 0. 886 0, showing the genetic
di fferences of P. pardus individuals. The UPGMA tree show ed that the tw o individuals f rom Ningwu first
clustered closely and there are no rela tiv e relationship betw een geog raphic distance and genetic div ersi ty.
Key words: Panthera pardu; ISSR markers; g enetic div ersity
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