全 文 ：药　物　生　物　技　术
Pharmaceutical Biotechnology　2003 ,10(3):165 ～ 168
左旋四氢巴马亭生物转化为左旋紫堇达明的研究
张文伟 ,余伯阳＊ ,彭　娟
(中国药科大学中药学院 , 南京 210038)
摘　要　对链霉菌等 10株菌种进行筛选 ,发现灰色链霉菌(Streptomyces griseus)YD-007菌株将左旋四氢巴马
亭转化为左旋紫堇达明的转化率较高。通过碳 、氮源筛选 、正交实验 , 得到最佳培养基配方为:玉米粉 30g , 黄豆
粉 10g ,酵母粉 5g , K2HPO4 2g , NaCl 5g ,蒸馏水 1000ml , pH7.0;转化率从 6.03%提高到 17.00%。研究了转化温度
和时间对转化率的影响 ,同时比较了链霉菌细胞在不同转化液中的转化率 , 并选用不同 pH 磷酸缓冲液 , 确定转
化最适 pH 为 pH5.0。
关键词　左旋四氢巴马亭;左旋紫堇达明;链霉菌;转化率
中图分类号:TQ92　　　文献标识码:A　　　文章编号:1005-8915(2003)03-0165-04
　　左旋四氢巴马亭(l-Tetrahydropalmatine , l-
THP), 是由 防己科植物 华千金藤 (Stephania
sinicaDiels)中提取的一种生物碱 ,为中药罂粟科植
物延胡索(Corydalis yanhusuoW.T.Wang)有效成分
延胡索乙素的左旋体 ,现已人工合成。我国学者曾
详细研究其药理作用 ,表明具有镇痛 、镇静 、安定及
催眠作用 ,近年还发现有抗心律失常作用[ 1] 。
近年来 ,微生物因其丰富的酶源已愈来愈受到
重视 ,通过微生物转化将天然药物转化成药理作用
更强 、毒性较弱的药物 ,已成为新药开发的一条重
要途径。本实验室通过对 l-THP进行微生物转化 ,
已分离得到 A 、B 、C 、D这 4个主要转化产物 ,其中
C经光谱学鉴定为 l-THP 羟基取代物左旋紫堇达
明(l-corydalmine , l-CDL)。而宣建成等(1988)[ 2] 对
l-THP及其衍生物的研究发现 , l-CDL 药理作用明
显强于 l-THP。延胡索内虽含有 l-CDL ,但含量很
低 ,因此提高 l-CDL 的转化率具有重要意义 。本实
验以转化产物 l-CDL的转化率为指标 ,通过对链霉
菌YD-007等 10个菌种的筛选以及转化条件的优
化 ,试图获得将 l-THP转化为 l-CDL的最佳菌株和
转化条件。有关其它转化产物的结构鉴定及药理
作用正在研究之中。
1　材　料
1.1　药品
盐酸罗通定 ,广西南宁制药企业集团公司(含
l-THP30mg 片);色谱纯甲醇 ,江苏淮阴试剂厂;三
乙胺 、氯仿为分析纯 ,上海试剂一厂;重蒸水 。
1.2　仪器
岛津 LC-10AT 液相色谱仪 、 SPD-10A UV-Vis
检测器及 C-R6A色谱数据处理机。
1.3　微生物
本实验筛选所用微生物为灰色链霉菌(Strep-
tomyces griseus ,YD-007)、黑曲霉(Aspergillus sp.,YD-
001)、白僵菌(Beauveria sp.,YD-013)、红曲(Monas-
cus sp.,YD-014)、粘帚霉(Gliocladium sp.,YD-002)、
青霉(Penicillium sp.,YD-012)、毛霉(Mucor sp.,YD-
004)、棒杆菌(Corynebacterium sp.,YD-008)、拟无枝
酸菌(Amycolatopsis sp., YD-010)和酵母(S .C.)等
10株菌种 ,均为美国依阿华大学 John P.N.Rosa-
zza教授所赠 。
2　方　法
2.1培养基
2.1.1　筛选培养基　葡萄糖 20g ,黄豆粉 5g ,酵母
粉 5 g ,NaCl 5g ,K2HPO45 g ,蒸馏水 1000ml ,pH7.0。
2.1.2　碳源选择培养基　碳源20g ,黄豆粉 5g ,酵母
粉1 g ,NaCl 5 g ,K2HPO45 g ,蒸馏水 1000ml ,pH7.0。
2.1.3　氮源选择培养基 氮源 5g ,以玉米粉 20g L
165
收稿日期:2003-01-19
基金项目:国家自然科学基金(No.29972056)和教育部重点项目(No.2118)资助课题
联系人:余伯阳 ,电话:025-5391042;E-mai l:boyangyu@hotmail.com
作为碳源 ,其它同碳源选择培养基 。
2.1.4　正交设计 按正交表 L9(34)进行 。
25ml培养基置 150ml三角瓶中 ,121℃灭菌 20
分钟 。每个实验设 3个平行样本 。
2.2　菌体培养与转化
取28℃旋转(180r min)培养24h的菌液接种新
鲜培养基(接种量 10%),培养 24h 后加入 39mg 盐
酸罗痛定片粉末(约含 10mg l-THP), 继续培养
96h。
2.3　温度和转化时间对转化率的影响
　　同 2.2进行菌体培养 ,离心收集菌体 ,菌体用
少量 pH6.0的 0.1mol L 磷酸盐缓冲液进行洗涤 ,
将菌体用 pH6.0 , 0.1mol L 磷酸盐缓冲液 25ml悬
浮 ,加入 39mg 盐酸罗通定粉末 ,于 28℃或 33℃转
化96h。每天取上清样 2ml ,转化 96h后测定整个
培养液的转化率 。
2.4　产物分离
发酵液用氨水调至 pH8 ～ 9 ,加 2倍体积氯仿
萃取 1次 ,等体积氯仿萃取 3次 ,提取液减压浓缩
至干 ,残渣用少量氯仿溶解供薄层色谱鉴别用 。
如采用HPLC进行产物 C的定量分析 ,则将浓
缩后的样品用色谱纯甲醇溶解定容至 10ml ,进行
HPLC分析前稀释 1倍测定 。将萃取后的 2.3上清
样同上定容至 2mL ,进行 HPLC 分析 。
2.5　转化产物的 TLC 鉴别
样品氯仿溶液点于用 0.5%CMC-Na 制成的硅
胶G薄层板上 ,正己烷 —氯仿 —甲醇(50:30:10)上
行法展开 ,取出晾干溶剂后 ,先在紫外灯 254nm下
观察 ,再喷改良碘化铋钾显色 ,检查转化结果 。
2.6　转化产物 HPLC分析
2.6.1　色谱条件[ 3] 色谱柱:25cm×4.0 mm ODS-
C18柱;流动相:甲醇-水-三乙胺(71:29:0.3),用冰
乙酸调至 pH 6.5;检测波长:281nm;流速:1 ml
min;灵敏度:0.05 AUFS 。
2.6.2　标准曲线　精密称取一定量 l-THP 和 l-
CDL ,分别以甲醇溶解配成浓度为 1.0 mg ml 和
0.20mg ml的标准溶液 ,倍比稀释成 6个浓度梯度 。
各取 20μl进样 ,以峰面积对标准品浓度进行线性
回归 , 得 l-THP 的回归方程:Y1 =0.004604062 +
0.000002920X1(r1=0.99996);l-CDL的回归方程:Y2
=0.695111502+0.002187089X2(r2=0.99981)。
2.6.3　产物分析　样品按 2.3方法处理后进样
20μl ,根据峰面积由回归方程求得转化产物量。
3　结　果
3.1　菌株的筛选
用10个菌种进行转化实验 , TLC检测结果表
明 ,灰色链霉菌 YD-007将 l-THP 转化成产物 C 的
产量最高(图 1),黑曲霉 YD-001 、白僵菌 YD-013和
拟无枝酸菌 YD-010次之 ,其余菌株转化量很低(表
1)。选用灰色链霉菌 YD-007进行下一步研究 。
1:l-THP , 2:Tranformation Product of l-THP ,3:l-THP and C , 4:D
Fig 1　TLC result of transformation product A～ D
Tab 1 　Preliminary screening of strains for transformation of l-
THP
Organisms Transformation results
Amycolatopsis sp.(YD-010) +
Aspergillus sp.(YD-001) +
Monascus sp.(YD-014) -
Beauveria sp.(YD-013) +
Corynebacterium sp.(YD-008) -
Gliocladium sp.(YD-002) -
Mucor sp.(YD-004) -
Penicillium sp.(YD-012) -
S .C　　　　　 -
Streptomycesgriseus(YD-007) ++
3.2　菌株的转化条件
按照表2改变碳 、氮源 ,采用HPLC测定产物 C
的含量 ,以确定适于 l-THP 转化生成产物 C 的碳 、
氮源 。
166 药 物 生 物 技 术 第 10 卷第 3期
Tab 2　Selection of carbon and nitrogen sources
Carbon
sources
Transformation
rate
Carbon
sources
Transformation
rate
Glucose 6.03% (NH4)2 SO4 9.84%
Maltose 4.00% NaNO3 5.36%
Lactose 4.90% Urea 4.51%
Sucrose 5.23% Glycine 5.54%
Starch 5.00% Arginine 7.44%
Dextrin 7.06% Peptone 10.91%
Corn meal 11.20% Soybean meal 11.20%
Glycerol 9.25%
3.2.1　碳源 实验了 8 种不同的碳源 ,表 2的结
果说明 ,该菌转化 l-THP 为 l-CDL 的最佳碳源为玉
米粉 ,其次是糊精和甘油 。
3.2.2　氮源 选用 7种氮源进行试验 ,发现黄豆
粉是最好的氮源 ,蛋白胨其次(表 2)。
3.2.3　正交试验 按表 3进行正交试验 ,方差分
析表明:玉米粉 、黄豆粉 、酵母粉为显著因子(p<
0.05),K2HPO4为非显著因子 ,最优培养基配方为
玉米粉 30g , 黄豆粉 10g , 酵母粉 5g , K2HPO4 2g ,
NaCl5g ,蒸馏水 1000ml , pH7.0。 l-THP 转化率为
17.00%的HPLC图谱如图 2。
Fig 2　HPLC result of l-THP transformation by Streptomyces gri-
seus YD-007
Tab 3　Orthogonal experiments L9(34)
No.
Corn
meal
(%)
Soybean
meal
(%)
Yeast
extract
(%)
K2HPO4(%)
Transformation
rate(%)
1 1.0 02 0.1 0.2 4.27
2 1.0 0.6 0.3 0.5 7.43
3 1.0 1.0 0.5 0.8 11.73
4 2.0 0.2 0.3 0.8 7.25
5 2.0 0.6 0.5 0.2 17.00
No.
Corn
meal
(%)
Soybean
meal
(%)
Yeast
extract
(%)
K2HPO4
(%)
Transformation
rate(%)
6 2.0 1.0 0.1 0.5 13.28
7 3.0 0.2 0.5 0.5 11.82
8 3.0 0.6 0.1 0.8 10.00
3.2.4　温度和转化时间对转化率的影响 由表 4
可知 ,反应液上清样和总的 l-CDL产量均反映出温
度提高不利于 l-THP转化。随着转化时间延长 ,转
化产物量上升趋势渐缓 。
Tab 4　Effect of temperature on the l-CDL production
Conc.
(μg ml) 24h 48h 72h 96h
Total l-CDL
production(μg)
28℃ 6.42 8.10 9.28 9.31 547.20
33℃ 5.89 6.56 6.49 6.46 365.20
3.2.5　YD-007菌株在不同转化液中的转化 用
培养 24h 的菌体悬液在不同转化液中转化(起始
pH均为 7.0),结果说明 ,在培养液中转化最好(表
5)。
Tab 5　Results of transformation in several transformation fluids
Transformation fluids Transformation rate(%)pH in 96h
Fermentation medium 9.83 9.0
0.1mol L Tris-HCl 3.15 8.0
0.1mol L H3PO4 buffer 5.68 7.0
3.2.6　pH 值对转化的影响 将培养 24h 的菌体
转入不同 pH值的 0.1mol L K2HPO4-KH2PO4缓冲液
中 ,转化结果表明 ,菌体在 pH5.0 条件下 ,具有最
高的转化活性 ,如高于 pH5.0 ,则转化率随着 pH 值
的升高逐步下降(图 3)。
Fig 3　Effect of pH on the transformation rate of l-THP
4 讨　论
(1)宣建成等选用 l-SPD(l-stepholidine ,左旋
千金藤立定)和 l-CDL 代表 l-THP 的双羟基和单羟
基取代物 ,对它们进行立体化学结构和量子化学计
167张文伟等:左旋四氢巴马亭生物转化为左旋紫堇达明的研究
算 ,证明 l-THP 为羟基取代后伴有电子云密度增加
和结构扭曲度增大 ,随之与多巴胺受体的亲和力增
大 ,药理作用亦增强。同时双羟基的 l-SPD 最活
泼 ,其次是单羟基的 l-CDL , l-THP 最稳定[ 2] 。目前
对 l-THP的生物转化尚未见报道。本实验经培养
基优化 , l-CDL的产量可增加 3倍左右。灰色链霉
菌YD-007在筛选培养基中形成菌球体 ,可观察到
在最优配方培养基中的菌球体要比筛选培养基中
的直径小而量多 ,因此具有更大的转化表面积 ,对
于转化是有利的 。
(2)灰色链霉菌 YD-007生长最适 pH 在6.5 ～
7.0左右。灰色链霉菌 YD-007在筛选培养基和最
优配方培养基中生长 48 h后 ,pH 均升至 8.0 ,继续
培养至 96h , pH 升至 9.0。实验结果表明 ,灰色链
霉菌 YD-007转化 l-THP 的最适pH 偏酸 ,因而灰色
链霉菌 YD-007生长后期的培养液 pH 值不利于菌
体生长和转化 。因此改善发酵液 pH 值以利于转
化是进一步提高 l-THP转化率的关键 ,目前此项研
究正在进行中。
(3)一般认为 ,采用静止细胞进行转化优于使
用发酵液转化 ,因为静止细胞转化不需考虑污染问
题 ,反应时间短 ,反应条件容易控制 ,产物提纯精制
容易 ,且副反应少[ 4] 。因此如能进一步摸索条件 ,
采用最优配方培养基中培养的灰色链霉菌 YD-007
酶活最高时的静止细胞转化 l-THP ,是一条有利于
工业生产的途径。
(4)该菌种的对数生长期在 24 h 后 ,生长旺
盛 ,以此为种子液接种至新鲜培养基有利于转化 。
本研究工作在筛选过程中还发现 ,外部条件的改变
如补料的控制可明显提高转化率及缩短培养周期 ,
详细的研究工作有待继报。
参 考 文献
[ 1] 　马小亚 ,梁颖彬 , 邢建峰 , 等.反相高效液相色谱法测
定血浆中左旋四氢巴马汀浓度[ J] .药物分析杂志 ,
1994 , 14(3), 13.
[ 2] 　宣建成 ,林光大 , 金国章 , 等.4种四氢原小檗碱同类
物的立体结构和量子化学对多巴胺受体的作用关系
[ J] .中国药理学报 , 1988 , 9(3), 197.
[ 3] 　张金风 ,谭力 ,周继红 , 等.测定人血浆中颅痛定浓度
及药代动力学研究[ J] .中国药科大学学报 , 1998 , 29
(1), 67.
[ 4] 　Yamanaka T.Production of 1-(-D-ribofuranosyl-1 , 2 , 4-tri-
azate[ P] .USP:4458016 , 1984.
Bioconversion from l-Tetrahydropalmatine to l-Corydalmine
ZHANG Wen-wei ,YU Bo-yang ,PENG Juan
(College of Traditional Chinese Medicine , China Pharmaceutical University ,
Nanjing210038)
Abstract　Through screening of 10 strainsincluding Streptomyces griseusYD-007 , Streptomyces griseus YD-007 was se-
lected for its high transformation rate of converting l-tetrahydropalmatine to l-corydalmine.After carbon and nitrogen
sources selection and sequent orthogonal experiments , the optimal fermentationmedium was as follows:corn meal 30g ,
soybean meal 10g , yeast extract 5g , K2HPO4 2g , NaCl 5g , distilled water 1000ml , pH 7.0.The transformation rate
was increased from 6.03%to 17.00%.Effects of transformation temperature and time on tranformation rate were stud-
ied.The transformation rate of cells of Streptomyces griseus in different transformation fluids were compared.The opti-
mal pH of transformation was 5.0 by using phosphate buffer of different pH values.
Key words　Tetrahydropalmatine , l-Corydalmine , Streptomyces griseus , Transformation rate
·信　息·
2003-B-28　稳定的乳糖酶的成分
2003-B-29　PCT用于改进胰岛素和胰岛素类似物的制备方法的 C肽
168 药 物 生 物 技 术 第 10 卷第 3期