全 文 ：国际药学研究杂志 2016年10月 第43卷 第5期 J Int Pharm Res，Vol.43，No.5，October，2016
LC-MS/MS法测定大鼠血浆中的左旋紫堇达明及其药代动力学研究
刘 帅 1，原 梅 2，米桂芸 1，高赟赟 1，杨红菊 1，李 桦 2*，杨 征 1*
［摘要］ 目的 建立快速、灵敏的LC-MS/MS分析方法定量测定大鼠血浆中左旋紫堇达明（L-CDL）的浓度，经系统方法学
验证后，应用于该药的大鼠药代动力学研究。方法 以普萘洛尔为内标，以水（含0.1%甲酸与5 mmol/L的甲酸铵）和乙腈（含
0.1%甲酸）为流动相，血浆样品中的L-CDL和内标经C18（2.1 mm×750 mm，3 μm）柱分离后，质谱电喷雾离子化源（ESI）正离子多
反应监测（MRM）方式分别对离子对m/z 342➝192.1和m/z 260➝116.2进行检测。方法验证包括专属性、标准曲线与定量下限、
批内和批间精密度、准确度、基质效应、提取回收率、稳定性。结果 L-CDL在大鼠血浆样品的定量线性范围为1~5000 ng/ml，
最低定量下限为1 ng/ml，批内和批间精密度（RSD）＜10%，回收率93.5%~102.8%，基质效应108.3%~112.5%。大鼠经胃给予L-
CDL 10 mg/kg后的主要药动学参数Cmax、T1/2、AUC0-24分别为：（557.8±330.1）ng/ml、（7.04±3.93）h、（2408±630）h·ng/ml。结论 建
立的LC-MS/MS方法简便、快速、灵敏，适用于L-CDL在大鼠体内的药代动力学研究。
［关键词］ 左旋紫堇达明；LC-MS/MS；大鼠；药代动力学
［中图分类号］ R917；R96 ［文献标志码］ A ［文章编号］ 1674-0440（2016）05-0971-05
DOI：10.13220/j.cnki.jipr.2016.05.031
Determination of L-corydalmine in rat plasma by LC-MS/MS
and the pharmacokinetic studies
LIU Shuai1，YUAN Mei2，MI Gui-yun1，GAO Yun-yun1，YANG Hong-ju 1，LI Hua2*，YANG Zheng1*
（1. Institute of Basic Medical Sciences，2. Institute of Pharmacology and Toxicology，
Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100850，China）
［Abstract］ Objective To develop a simple，rapid and accurate analysis method for determination of L-corydalmine（L-CDL）
in rat plasma. Methods The plasma sample was determined with propranolol as the internal standard（IS），the separation was ac⁃
complished in a Capcell PAK C18（2.1 mm×750 mm，3 μm）column，and the mobile phase consisted of water（ including 0.1% formic
acid and 5 mmol/L ammonium formate）and acetonitrile（including 0.1% formic acid）at a flow rate of 0.25 ml/min. The mass spec⁃
trometer consisted of an ESI interface operating at positive ionization mode and the detection was performed using multiple reaction
monitoring（MRM）at the transitions of m/z 342➝192.1 for L-CDL and m/z 260➝116.2 for propranolol. Method validation included the
evaluation of the linearity range，lower LOQ，within-run and between-run precision，accuracy and stability，matrix effect and extrac⁃
tion recovery. Results The calibration curve was linear across the concentration range of 1-5000 ng/ml for L-CDL with a lower LOQ
of 1 ng/ml. The within-run and between-run precision（RSD%）was in the range 0.1%-10%. The extraction recovery was in 93.5%-
102.8% and the matrix effect for three QC was 108.3%-112.5%. L-CDL reached the peak concentration at 0.5 h after dosing. The main
pharmacokinetic parameters of rats after igl administration were as follows：T1/2：（7.04±3.93）h，Cmax：（557.8±330.1）ng/ml，AUC0~24：
（2408±630）h·ng/ml. Conclusion A simple，rapid，accurate，high sensitivity and repeatability method has been successfully devel⁃
oped，which can analyze the concentration of L-CDL in rat plasma. The method can be used for the investigation of pharmacokinetics
of L-CDL in rats.
［Key words］ L-corydalmine；LC-MS/MS；rat；pharmacokinetics
基金项目：国家自然科学基金面上项目（81473193）；军队十二五重大专项资助项目（2012ZX09031）
作者简介：刘 帅，男，在读硕士研究生，研究方向：药理学、药物代谢，Tel：010-66930335，E-mail：shuailiu5277@163.com
作者单位：100850 北京，军事医学科学院1.基础医学研究所（刘 帅，米桂芸，高赟赟，杨红菊，杨 征）；2.毒物药物研究所（原 梅，李 桦）
*通讯作者：李 桦，女，博士，研究员，博士生导师，研究方向：药物代谢，Tel：010-66932602，E-mail：amms_hli@126.com；杨 征，女，博士，研究
员，博士生导师，研究方向：心理学、药理学，Tel：010-66930335，E-mail：yangz236@163.com
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左旋四氢帕马丁（L-tetrahydropalmatine，L-THP）
是临床上常用的一种镇痛、镇静药物，是从防己科
植物华千金藤（Stephania sinica Diels）中分离提取得
到的一种异喹啉类生物碱，为中药元胡（Corydalis
yanhusuo W.T.Wang）的有效成分延胡索乙素的左旋
体，具有镇痛、镇静，抗心律失常、抗焦虑、抗脂质过
氧化以及神经保护活性［1-3］，在我国已有 40年的使
用历史［4-6］；最近的研究表明，L-THP能有效治疗药
物成瘾［7］。左旋紫堇达明（L-corydalmine，L-CDL）是
L-THP 10位去甲氧基后的羟基化产物（结构见图1），
其镇痛活性明显高于 L-THP，且镇静催眠作用较
弱［8-9］，本实验室前期进行的系列L-CDL药效学实验
证明其确有较好的镇痛作用，有望开发成为新型的
镇痛药物。但L-CDL的定量检测方法以及药代动力
学研究尚无文献报道，为了考察 L-CDL的吸收和体
内药代动力学特征，本研究首次建立了简便、快速、
灵敏的测定血浆中 L-CDL的LC-MS /MS方法，为其
进一步的开发利用提供科学依据。
1 材料与方法
1. 1 药品和试剂
L-CDL由中科院上海药物研究所化学合成，纯
度达到98.5%；内标盐酸普萘洛尔，美国Sigma公司；
乙腈（色谱纯），美国Fisher公司；纯净水，杭州娃哈
哈集团有限公司；甲酸、甲酸铵及其他试剂均为分
析纯。
1. 2 仪器
美国Agilent G6410B三重四级杆串联质谱仪，
配备Agilent 1290超高压液相色谱系统（UHPLC），
包括二元输液泵（G4220A）、自动进样器（G4226A）、
柱温箱（G1316C）、电喷雾离子化源（ESI）以及数据
采集软件Mass Hunter B.04.00；高速低温离心机、涡
旋振荡器，美国 Thermo公司；C18色谱分析柱（2.1
mm×750 mm，3 μm），日本资生堂公司；电子分析天
平，德国Sartourious公司。
1. 3 实验动物
雄性 SD大鼠 6只，体质量 180～220 g，军事医
学科学院动物中心，动物许可证号：SCXK-（军）
2012-004。
1. 4 色谱条件
以含0.1%甲酸和5 mmol/L甲酸铵水相（A）和0.1%
甲酸乙腈（B）为流动相，柱温25℃，流速0.25 ml/min，
进样体积10 μl。梯度洗脱程序为：0~1 min，85% A~
60% A；1~2 min，60% A~20% A，2~2.5 min 20% A~
10% A，2.5~2.8 min 10% A~85% A。
1. 5 质谱条件
采用ESI源正离子检测，扫描方式为多反应监
测（MRM）；质谱分析参数为：毛细管电压4000 V；毛
细管温度350℃；雾化气30 psi；干燥器流速为10 L/min；
L-CDL和普萘洛尔的质谱检测参数见表1。
1. 6 标准曲线工作液及质控样品的制备
标准曲线工作液的配制：准确称取 L-CDL粉末
适量，使用DMSO溶解成 1 mg/ml的储备液，随后用
乙腈稀释得到10~50 000 ng/ml的工作液，浓度分别
为 10、100、500、1000、5000、10 000和 50 000 ng/ml，
置于4℃冰箱保存。在制备随行标准曲线时再使用
空白血浆，然后将对照品溶液稀释成浓度分别为
1、10、50、100、500、1000和5000 ng/ml的标准曲线工
作液。
内标溶液的配制：准确称取普萘洛尔固体粉末
适量，使用DMSO溶解成 1 mg/ml的贮备液，再用乙
腈于 100 ml容量瓶中定容稀释成 100 ng/ml的内标
工作液；放置于4℃冰箱保存。
质控样品标准溶液的配制：使用第一步对照品
溶液的母液 1 mg/ml的储备液，用乙腈稀释成 20、
800和40 000 ng/ml（低、中、高）3个浓度的质控标准
溶液，4℃冰箱保存
1. 7 血浆样品的处理
将待测的血浆样品 50 μl加入 150 μl内标工作
液（含普萘洛尔100 ng/ml的乙腈溶液）沉淀蛋白，涡
旋振荡1 min，于4℃离心机14 000×g离心10 min，取
上清10 μl进样至LC-MS/MS分析。
图1 左旋四氢帕马丁（L-THP）与左旋紫堇达明（L-CDL）的
化学结构式
Fig.1 Chemical structures of L- tetrahydropalmatine（L-
THP）and L-corydalmine（L-CDL）
化合物
l-CDL
普萘洛尔
母离子（m/z）
342
260
子离子（m/z）
192.1
116.2
碎裂电压（V）
135
120
碰撞能（V）
15
14
表1 L-CDL和普萘洛尔的质谱检测参数
Tab.1 Mass spectrometry parameters of L-CDL and pro⁃
pranolol
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1. 8 统计学分析
采用WinNonLin 5.2.1（Pharsight Inc.，USA）软件
的非房室模型分析计算药代动力学参数。实验数
据以x±s的方式表示。
2 结果
2. 1 LC-MS/MS方法学建立与验证
2. 1. 1 专属性 用 6只大鼠的空白血浆 50 μl，不
加药物和内标，使用纯乙腈沉淀蛋白，其他按照1. 7
操作，进样10 μl，得到色谱图A；另取同量空白血浆
50 μl，加入 1 ng/ml的标准溶液和内标溶液，按同法
操作，得到色谱图B；取 ig L-CDL 30 min后的大鼠血
浆样品，按同法操作，得到色谱图C。结果表明，L-
CDL与内标普萘洛尔分离度良好，两者的保留时间
分别为1.58 min和2.04 min，内源性物质对待测物和
内标的测定无明显干扰（图2）。
2. 1. 2 标准曲线与定量下限 配制血浆终浓度分
别为1、10、50、100、500、1000和5000 ng/ml的L-CDL
标准曲线样品，并按1. 7操作，进样10 μl，用LC-MS/MS
进行测定。低、中、高3个浓度水平的质控样品处理
及测定同上。以血浆中待测物的浓度为横坐标，待
测物与内标峰面积的比值为纵坐标，采用最小二乘
法进行线性回归，得到 L-CDL的线性方程为 y=
0.805363x+1.24999（r2=0.99），表明 L-CDL在 1~5000
ng/ml的浓度范围内线性良好，最低定量下限为1 ng/
ml，相对标准偏差（RSD）均在规定范围之内，灵敏度
满足本实验要求。
2. 1. 3 精密度与准确度 取50 μl混合空白大鼠血
浆分别加入5 μl不同浓度的质控样品标准工作液，
制备L-CDL的3种浓度分别为2、80和4000 ng/ml的
质控血浆样品（n=3），样品经前处理后，连续 3 d每
天重复测定3次，用随行标准线曲计算相应的浓度，
分别考察批内或批间精密度和准确度。结果表明
（表 2），L-CDL在血浆样品中的批内和批间精密度
RSD均＜10%，准确度在 87.0%~110.0%范围内，方
法的精密度和准确度满足生物样品分析方法的要求。
2. 1. 4 提取回收率和基质效应 在低、中、高 3种
QC浓度水平，考察方法的回收率和基质效应。将6
只大鼠混合空白血浆加标后进行蛋白沉淀处理、测
定，得到的峰面积与配制在流动相中的标准溶液的
峰面积相比，计算方法的回收率。结果表明，3种浓
度的 L-CDL在大鼠血浆中的回收率分别为 93.5%、
102.7%和 102.8%。将 6只大鼠混合空白血浆先行
进行沉淀蛋白处理，在处理后的样品中加入内标测
定，得到的峰面积与标准溶液相比，计算方法的基质
效应。结果表明（表3），3种浓度水平QC样品L-CDL
图2 L-CDL与普萘洛尔在大鼠血浆样品的LC-MS/MS谱图
注：A：大鼠空白血浆；B：大鼠空白血浆加样品（1 ng/ml）与内标；C：大鼠 ig L-CDL 30 min后的血浆样品与内标；1. L-CDL；2.普萘洛尔
Fig.2 Chromatograms of l-CDL and propranolol in rat plasma samples A：blank rat plasma；B：blank rat plasma & internal standard
& sample（1 ng/mL）；C：rat plasma after ig L-CDL for 30 min & internal standard；1. L-CDL；2. propranolol
表2 大鼠血浆中L-CDL的批内和批间精密度和准确度（x±s）
Tab.2 Precision and accuracy of the assay method for L-CDL in rat plasma（x±s）
样品浓度（ng/ml）
2
80
4000
批内（n=3）
实测值（ng/ml）
2.1±0.1
81.7±0.6
3480.1±250.3
RE（%）
105.0
102.1
87.0
RSD（%）
4.8
0.7
7.2
批间（n=9）
实测值（ng/ml）
2.2±0.2
82.7±2.8
3776.5±357.4
RE（%）
110.0
103.4
94.4
RSD（%）
9.1
3.4
9.5
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的基质效应分别为 108.3%、112.5%和 108.3%，表明
蛋白沉淀法处理样品后，L-CDL的质谱测定无明显
的基质干扰。
2. 1. 5 样品的稳定性 6只大鼠混合空白血浆外加
药制成含L-CDL低、中、高浓度为2、80和4000 ng/ml
的血浆样品，将样品置于-20℃冰箱中放置15 d后取
出冻融，按1. 7方法处理后上样检测，考察待测样品
在-20℃条件下长期放置的稳定性。结果表明，L-
CDL 3个浓度与同浓度新鲜配制样品相对误差分别
为-6.3%、2.8%和1.7%。同样浓度的样品在-20℃和
室温条件下反复冻融 3次，然后将样品按 1. 7方法
处理后上样检测，考察其反复冻融的稳定性。结果
表明，L-CDL 3个浓度与同浓度新鲜配制样品的误
差分别为-8.6%、-4.0%和-6.3%；将配制的同浓度样
品按 1. 7方法处理，将处理后的样品在放置进样托
盘（4℃）24 h后测定并考察其稳定性。结果表明，L-
CDL 3个浓度相对同浓度新鲜配制样品的误差分别
为-4.9%、-3.4%和-1.2%。以上结果说明 L-CDL在
上述条件下是稳定的。
2. 2 大鼠灌胃L-CDL的药代动力学
大鼠单次灌胃L-CDL后的药代动力学参数见表4，
血浆动力学曲线见图3。灌胃L-CDL在大鼠体内吸
收较快，血浆浓度在0.8 h达峰值（557.8±330.1）ng/ml，
随后浓度逐渐下降，给药 6 h后的血浆浓度为
（134.0±38.4）ng/ml后缓慢下降，在给药24 h后血浆
浓度仍然高于检测限。灌胃消除半衰期为（7.04±
3.93）h，AUC0-24为（2408±630）h·ng/ml。
3 讨论
本研究建立并验证了定量检测大鼠血浆中的
L-CDL的LC-MS/MS方法。结果表明，该法血浆用量
少，样品处理只需一步沉淀蛋白，简单快速，且专属
性较好，精密度好、灵敏度高，方法的基质效应小，
回收率及批内、批间精密度均满足生物样品定量分
析的要求，为候选药物的临床前评价和进一步研究
提供了必要的生物分析技术，可支持其作为创新药
物进行的开发研究。L-CDL的大鼠灌胃后服药代动
力学研究结果表明，其血药浓度达峰较快，0.8 h后
即达到 557.8 ng/ml的平均血药浓度峰值。这提示，
该药入血迅速、吸收良好；血药浓度达峰后呈双相
消除，经历快速下降过程后再缓慢消除，灌胃给药
的消除半衰期达 7 h，在给药 8 h L-CDL的血浆浓度
仍＞100 ng/ml，提示该药体内稳定性较好，消除速
度适中，在一定时间内可维持发挥药效所需的血药
浓度，有利于提高患者的依从性。
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（下转第979页）
表4 SD大鼠 ig L-CDL 10 mg/kg后的药代动力学参数（x±
s，n=5）
Tab.4 Pharmacokinetic parameters of L- CDL after SD
rats received a single ig dose of 10 mg/kg（x±s，n=5）
参数名称
Tmax（h）
Cmax（ng/ml）
AUC0~24（h·ng/ml）
T1/2（h）
MRT0~t（h）
参数值
0.80±0.67
557.8±330.1
2408±630
7.04±3.93
5.79±0.83
图 3 SD大鼠 ig L-CDL 10 mg/kg后的血药浓度-时间曲线
（n=5）
Fig.3 Plasma concentration- time profile of L-CDL after
SD rats received a single ig dose of 10 mg/kg（n=5）
表3 大鼠血浆中 l-CDL的提取回收率和基质效应（x±s，n=
3）
Tab.3 Extraction recoveries and matrix effects of l-CDL in
rat plasma（x±s，n=3）
样品浓度（ng/ml）
2
80
4000
提取回收率（%）
93.5±4.3
102.7±3.7
102.8±2.2
基质效应（%）
108.3±1.9
112.5±7.8
108.3±6.1
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这 6种活性成分的含量。此外，本法的建立可为红
景天提取物质量评价提供依据，为同时研究这 6种
活性成分的药代动力学过程提供给药剂量的参考，
为抗低氧研究奠定基础。
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（收稿日期：2016-07-19 修回日期：2016-08-28）
图1 红景天提取物总离子流色谱图及各成分多反应监测模式下的色谱图
注：A.红景天提取物总离子流色谱图；B.红景天苷；C.红景天素；D.草质素苷；E.草质素；F.山柰酚；G.槲皮素
Fig.1 Total ion curreut chromatography（TIC）and multi reaction monitoring chromatograms of the ingredients in Rhodio⁃
la extract A. TIC of Rhodiola extract；B. salidroside；C.rhodiosin；D. rhodionin；E. herbacetin；F. kaempferol；G. quercetin
（上接第974页）
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（收稿日期：2016-03-23 修回日期：2016-05-12）
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