全 文 ：第 32 卷第 5 期
2013 年 10 月
中 国 野 生 植 物 资 源
Chinese Wild Plant Ｒesources
Vol． 32 No． 5
Oct． 2013
收稿日期:2013 － 02 － 21
基金项目:重大新药创制专项———新型强效快速镇痛药物紫堇达明临床前研究(2012ZX09J12110 － 06B)资助
作者简介:宋洋(1986 －) ，男，中西医结合基础(药学)在读硕士研究生，主要从事天然产物的微生物结构修饰。
* 通讯作者:刘吉华(1969 －) ，男，生药学博士，教授，主要从事中药生物技术与活性成分相关研究。E-mail:jihualiu88@163． com
doi:10． 3969 / j． issn． 1006 － 9690． 2013． 05． 002
生物转化合成左旋紫堇达明诱导剂筛选及优化
宋 洋，王 严，余伯阳，刘吉华*
(中国药科大学 中药复方研究室，江苏 南京 211198)
摘 要 目的:左旋紫堇达明为中药延胡索中痕量高效镇痛活性成分，灰色链霉菌( Streptomyces griseus ATCC 13273)
具有生物转化左旋四氢巴马汀产生左旋紫堇达明的转化活性。筛选合适的生物转化诱导剂并优化诱导条件，提高
左旋紫堇达明的转化产率。方法:以左旋紫堇达明的转化产率为指标，选用苯甲酸、正己烷、苯巴比妥钠作为诱导
物，筛选合适的诱导物并优化转化体系诱导条件。结果:苯甲酸、正己烷、苯巴比妥钠均能显著提高左旋紫堇达明
的转化产率。结论:正己烷廉价易得且不影响转化产物分离，适合工业化生产使用，为该转化体系的合适诱导剂。
关键词 左旋紫堇达明; 灰色链霉菌 ATCC 13273; 诱导剂; 左旋四氢巴马汀
中图分类号:TQ92 文献标识码:A 文章编号:1006 － 9690(2013)05 － 0007 － 03
Screening and Optimality of Inducer Biologically
Converting to Synthesize l － CDL
Song Yang，Wang Yan，Yu Boyang，Liu Jihua*
(Department of Complex Prescription of Traditional Chinese Medicine，China Pharmaceutical University，
Nanjing 211198，China )
Abstract Objective:l-corydalmine(l-CDL) ，is proved to show high analgesic activity． However，l-
CDL falls into the category of trace ingredients of traditional Chinese medicine Corydalis Ｒhizoma． Previ-
ous research indicated that Streptomyces griseus ATCC 13273 catalyzed the microbial transformation
process of l-THP to produce l-CDL． The suitable inducers of the transformation systerm were screened
and the induction conditions were optimized to improve the transformation rate of l-CDL． Methods:Ben-
zoic acid，n-Hexane and phenobarbitol sodium were investigated as inducers． HPLC-UV method was em-
ployed to detect the transformation rate of l-CDL． Finally，the suitable inducing time and concentration
were ensured． Ｒesults:Benzoic acid，n-Hexane and phenobarbitol sodium all improved the transforma-
tion rate markedly． Conclusion:N-Hexane was a suitable inducer for this transformation systerm because
of price and acquisition，easy product isolation，especially perfect for industrial-scale production．
Key words l-Corydalmine;Streptomyces griseus ATCC 13273;inducer;l-tetrahydropalmatine
左旋四氢巴马汀(l － tetrahydropalmatine，l-
THP)是由防己科植物华千金藤(Stephania sinica
Diels)中提取的一种异喹啉类生物碱，为中药罂粟
科植物延胡索(Corydalis yanhusuo W． T． Wang)有
效成分延胡索乙素的左旋体［1］，具有镇痛、镇静和
催眠作用。左旋紫堇达明(l － corydalmine，l － CDL)
是 l － THP 10 位羟基化的产物，研究表明，由于 l －
CDL电子云密度和结构扭曲度增加，与多巴胺受体
的亲和力增大，其镇痛活性显著强于 l － THP［2］，且
镇静催眠作用较弱。由于 l － CDL 属于中药中的微
量成分，自然来源十分有限。与大多数生物碱一样，
l － CDL具有复杂的稠环结构，难以通过化学合成或
结构修饰方法获得［3］。
微生物转化(Microbial Conversion) ，是利用微生
物代谢过程中产生的某个或某一系列的酶对底物进
行的催化反应［4］，与传统的有机反应相比，具有区
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中 国 野 生 植 物 资 源 第 32 卷
域选择性高、立体选择性强和反应类型众多等特点，
并能完成一些化学方法难以实现的反应［5］。目前
微生物转化已成为天然产物结构修饰的重要手
段［6］，通过先导化合物经微生物转化方法寻找新的
高活性、低毒性的药物已成为有效开发新药的一条
途径。前期研究表明，Streplomyces griseus ATCC
13273 具有生物转化 l － THP 生成 l － CDL 的活性，
由包括细胞色素 P450 酶的复杂酶系所催化。对生
物转化体系中催化反应的酶或酶系进行诱导可在不
增加生产成本的基础上极大提高转化产物的产
率［7］，为后续的工业放大生产奠定基础。本研究在
现有生物转化合成左旋紫堇达明体系的基础上，以
苯甲酸、正己烷、苯巴比妥钠为诱导物，通过筛选生
物转化体系的诱导剂并优化诱导条件，提高 l － CDL
的转化产率。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 菌种
灰色链霉菌 (Streptomyces griseus ATCC 13273) ，
本研究室保存。
1． 1． 2 培养基
斜面及平板培养基(g /L) :土豆 200，磷酸二氢
钾 3，葡萄糖 20，硫酸镁 0． 73，琼脂粉 20，维生素
B10． 01。
种子及发酵培养基(g /L) :玉米粉 30，磷酸氢二
钾 5，豆粕粉 7． 6，氯化钠 5，酵母粉 5，硫酸镁 0． 1，硫
酸亚铁 0． 1，葡萄糖 1． 2。
1． 1． 3 仪器及试剂
Agilent 1260 高效液相色谱仪;SW － CJ － IF 超
净工作台;LＲH －250A 生化培养箱;QHZ － DA 全温
大容量振荡培养箱;左旋四氢巴马汀(成都曼思特
生物科技有限公司) ，左旋紫堇达明(本实验室分离
纯化，HPLC检测纯度大于 98%)。甲醇为色谱纯，
乙酸乙酯，丙酮，正己烷均为分析纯试剂。
1． 2 试验方法
1． 2． 1 菌种活化及液体菌种制备
将保藏的 S． griseus ATCC 13273 菌种转接于斜
面培养基上，28 ℃活化培养 6 d。以活化的斜面菌
种转接液体种子培养基，于 28 ℃，180 r /min振荡培
养 24 h即得液体菌种，发酵转化时以 4%接种量转
接至发酵培养基相同条件下培养转化。
1． 2． 2 l － THP的微生物转化
向加入诱导物的转化体系中加入终浓度为 0． 4
mg /mL转化底物 l － THP(丙酮助溶) ，28 ℃，180 r /
min 转化发酵 96 h，HPLC检测 l － CDL的转化产率。
1． 2． 3 诱导剂的筛选及诱导条件的优化
诱导剂的筛选:液体菌种转接至发酵培养基，
28 ℃，180 r /min摇床培养 10 h，分别加入苯甲酸或
正己烷作为诱导物诱导培养 6 h 后加入 l － THP，水
溶性苯巴比妥钠于转接发酵培养基时加入。相同条
件不加诱导物的转化体系为对照。比较各组 l －
CDL的转化产率，筛选转化体系的诱导剂。
诱导条件的优化:以单因素试验方法，对影响诱
导效果的诱导剂浓度、诱导剂诱导时间进行优化。
1． 2． 4 l － CDL转化产率测定
发酵液以等体积乙酸乙酯萃取 3 次，合并萃取
液并减压浓缩至干，残渣用色谱甲醇溶解定容至
20 mL，微孔滤膜过滤即得 HPLC 分析样品。HPLC
分析条件为色谱柱:Hedera C18;流动相:0． 6%乙酸
水溶液(含 0． 06%三乙胺)－乙腈(77 ∶ 23) ;流速:
1 mL /min;检测波长:281 nm;柱温:28 ℃;进样量:
15 μL。
2 结 果
2． 1 转化体系诱导剂的筛选
参考相关文献［8］，选择苯甲酸、正己烷、苯巴比
妥钠为 l － CDL 转化体系诱导物，考察其对 l － CDL
转化产率的影响。结果(表 1)显示:苯甲酸、正己
烷、苯巴比妥钠均能显著提高 l － CDL 的转化产率，
表明所选诱导物对 S． griseus ATCC 13273 转化合成
l － CDL的转化活性均有诱导作用。
表 1 三种诱导物对 S． griseus ATCC 13273
转化合成 l － CDL产率的影响
诱导物 诱导物浓度 l － CDL的转化产率(%)
苯甲酸 2 mmol /L 69． 71
正己烷 2 μL /(mL·h) 62． 86
苯巴比妥钠 0． 75 mmol /L 66． 12
对照 0 50． 53
2． 2 诱导条件的优化
2． 2． 1 苯甲酸作为诱导剂诱导条件优化
苯甲酸类物质是芳香族化合物代谢中最常见的
中间产物。在微生物中，由细胞色素 P450 酶催化的
羟基化反应是苯甲酸的主要降解途径之一，苯甲酸
对相应的细胞色素 P450酶也有明显的诱导作用［9］。
2． 2． 1． 1 苯甲酸浓度对转化体系诱导作用的影响
液体菌种转接转化发酵培养基，28 ℃，180
r /min培养 10 h 后，分别加入苯甲酸使其终浓度为
1，2，3 mmol /L，按诱导剂优化方法进行 l － THP 转
—8—
第 5 期 宋 洋，等:生物转化合成左旋紫堇达明诱导剂筛选及优化
化，HPLC检测。结果(表 2)显示:转化发酵培养基
中苯甲酸终浓度为 2 mmol /L时 l － CDL的转化产率
达到 69． 71%，对转化体系生物转化合成 l － CDL 活
性诱导作用最强。
表 2 苯甲酸对浓度 S． griseus ATCC 13273
转化合成 l － CDL产率的影响
苯甲酸浓度 (mmol /L) 诱导时间(h) l － CDL的转化产率(%)
1 6 61． 06
2 6 69． 71
3 6 55． 86
2． 2． 1． 2 苯甲酸诱导时间对转化体系诱导作用的
影响
液体菌种转接转化发酵培养基，28 ℃，180 r /min
培养 10 h 后，加入终浓度为 2 mmol /L 苯甲酸，分别
诱导培养 6、9、12 h 后进行 l － THP 生物转化。结果
(表 3)显示:2 mmol /L苯甲酸诱导培养9 h，转化体系
具有最高转化能力，l － CDL转化产率达到 79． 57%。
表 3 苯甲酸诱导时间对 S． griseus ATCC 13273
转化合成 l － CDL转化产率的影响
诱导时间 (h) 苯甲酸浓度 (mmol /L) l － CDL的转化产率(%)
6 2 69． 71
9 2 79． 57
12 2 66． 77
2． 2． 2 正己烷作为诱导剂诱导条件优化
正己烷对多种微生物的细胞色素 P450 酶都有
明显的诱导作用，而且诱导产生的细胞色素 P450 酶
具有多样的功能，因而被称作细胞色素 P450 酶的多
功能诱导剂。
2． 2． 2． 1 正己烷浓度对转化体系诱导作用的影响
液体菌种转接转化发酵培养基，28 ℃，180 r /
min培养 10h 后，分别加入 1，2，3 μL /(mL·h)的正
己烷，按诱导剂优化方法进行 l － THP 转化，HPLC
检测。结果(表 4)显示:加入正己烷 2 μL /(mL·h)
时 l － CDL的转化产率达到 62． 86%，对转化体系生
物转化合成 l － CDL活性诱导作用最强。
表 4 正己烷浓度对 S． griseus ATCC 13273
转化合成 l － CDL转化产率的影响
正己烷浓度(μL /mL·h) 诱导时间(h) l － CDL的转化产率(%)
1 6 54． 61
2 6 62． 86
3 6 50． 72
2． 2． 2． 2 正己烷诱导时间对转化体系诱导作用的
影响
液体菌种转接转化发酵培养基，28 ℃，180 r /
min培养 10 h 后，加入 2 μL /(mL·h)正己烷，分别
诱导培养 6、9、12 h后进行 l － THP生物转化。结果
(见表 5)显示:加入 2 μL /(mL·h)的正己烷，诱导
培养 9 h，转化体系具有最高转化能力，l － CDL转化
产率达到 69． 84%。
表 5 正己烷诱导时间对 S． griseus ATCC 13273
转化合成 l － CDL转化产率的影响
诱导时间(h) 正己烷浓度(μL /mL·h) l － CDL的转化产率(%)
6 2 62． 86
9 2 69． 84
12 2 59． 12
2． 2． 3 苯巴比妥钠作为诱导剂诱导条件优化
苯巴比妥钠是典型的、最先发现的细胞色素
P450 酶的诱导剂，在微生物细胞色素 P450 酶活性
调控中常被采用［10］。
2． 2． 3． 1 苯巴比妥钠浓度对转化体系诱导作用的
影响
液体菌种转接发酵培养基的同时，分别加入苯
巴比妥钠使其终浓度为 0． 15，0． 75，1． 50 mmol /L，
按诱导剂优化方法进行 l － THP 转化，HPLC 检测。
结果(表 6)显示:转化发酵培养基中苯巴比妥钠终
浓度为 1． 5 mmol /L 时 l － CDL 的转化产率达到
66． 12%，对转化体系生物转化合成 l － CDL 活性诱
导作用最强。
表 6 苯巴比妥钠浓度对 S． griseus ATCC 13273
转化合成 l － CDL转化产率的影响
苯巴比妥钠浓度(mmol /L) 诱导时间(h) l － CDL的转化产率(%)
0． 15 16 h 63． 51
0． 75 16 h 66． 12
1． 5 16 h 74． 57
2． 2． 3． 2 苯巴比妥钠诱导时间对转化体系诱导作
用的影响
液体菌种转接转化发酵培养基的同时，加入终
浓度为 1． 5 mmol /L 的苯巴比妥钠，分别诱导培养
12、16、20 h后进行 l － THP 生物转化。结果(见表
7)显示:1． 5 mmol /L 苯巴比妥钠诱导培养 16 h，转
化体系具有最高转化能力，l － CDL 转化产率达到
74． 57%。
表 7 苯巴比妥钠诱导时间对 S． griseus ATCC 13273
转化合成 l － CDL转化产率的影响
诱导时间(h) 苯巴比妥钠浓度(mmol /L) l － CDL的转化产率(%)
12 1． 5 68． 29
16 1． 5 74． 57
20 1． 5 66． 74
( 下转第 20 页)
—9—
中 国 野 生 植 物 资 源 第 32 卷
后熟的过程才能萌发。
(3)低浓度的赤霉素可显著促进七叶一枝花种
子的萌发，高浓度则抑制其萌发，100 mg·L －1的赤霉
素处理种子时萌发率最高。
(4)七叶一枝花萌发温度范围较窄，20 ℃为其
萌发的最佳温度，低于 10 ℃不萌发;基质与光照对
其萌发影响不大。
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53 － 58．
( 上接第 9 页)
3 讨 论
近年来，微生物转化技术已经广泛用于中药活
性成分的结构修饰以及药物先导化合物的发现［11］，
在中药研究的多个领域发挥了重要作用。研究表
明，S． griseus ATCC 13273 转化合成 l － CDL是由包
括细胞色素 P450 酶的复杂酶系所催化，转化体系的
催化活性的提高可在不增加成本的条件下极大提高
转化产物的产率。本研究以 l － CDL 转化产率为指
标，比较苯甲酸、正己烷、苯巴比妥钠对转化合成 l －
CDL活性的影响并优化其诱导条件，显著的提高了
l － CDL的转化产率，为其后续的放大发酵奠定了基
础。
从来源广泛，不影响产物分离考虑，优选正己烷
为生物转化合成 l － CDL 的合适诱导剂。同时正己
烷对转化底物 l － THP 具有良好的溶解性，在转化
体系中可同时起到转化活性诱导及底物助溶的作
用。
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