全 文 ：文章编号:1674 － 5566(2015)04 － 0560 － 10
超声-纤维素酶法提取狐尾藻抑藻成分的工艺优化
收稿日期:2015-04-13 修回日期:2015-05-19
基金项目:上海市教委科研创新项目(10ZZ103) ;上海市教委重点学科建设项目(J50701) ;上海市高校知识服务平台项目(ZF1206)
作者简介:赵金涛(1988—) ，男，硕士研究生，研究方向为环境化学与毒理学。E-mail:zhaojintao1234@ 163． com
通信作者:江 敏，E-mail:mjiang@ shou． edu． cn
赵金涛
1，江 敏
1，2，王俊南
1
(1．上海海洋大学 水产与生命学院，上海 201306;2．上海海洋大学 上海市水域环境生态上海高校工程研究中心，上海
201306)
摘 要:研究了超声波-纤维素酶法和水浸提法提取狐尾藻
抑藻成分对铜绿微囊藻的抑制作用。以提取液对铜绿微囊
藻的生长阻碍率为评价指标，通过单因素和正交试验获得超
声波-纤维素酶法提取狐尾藻化感物质的最优工艺条件:酶
解时间为 4 h，最适 pH为 3． 0，温度为 30 ℃，酶用量(纤维素
酶质量 /藻粉质量)为 21%，超声波功率为 120 W，超声时间
为 1 h。超声波-纤维素酶法所得狐尾藻提取液对藻细胞的
生长阻碍率远远高于水浸提法，两者存在显著性差异(P ＜
0． 05)。随着反应时间延长，超声波-纤维素酶提取液对铜绿
微囊藻的生长阻碍率持续降低，在提取液浓度为 40 g /L，反
应时间为 24 h 时，其对铜绿微囊藻的生长阻碍率为
271． 74%，反应时间为 13 d时，对铜绿微囊藻的生长阻碍率
仍达 20%以上，显著高于其他组别(P ＜ 0． 05)。
研究亮点:随着水污染加剧，水华频发，
高效无负作用除藻技术研究迫在眉睫。
本文通过单因素和正交试验系统研究了
超声波-纤维素酶法和水浸提法提取狐尾
藻抑藻成分对铜绿微囊藻的抑制作用，结
果表明超声波-纤维素酶提取液具有高效
抑藻作用，这为今后治理水污染和控藻研
究提供一种新的研究方法，也具有一定的
现实意义。
关键词:超声波-纤维素酶法;狐尾藻;铜
绿微囊藻;生长阻碍率
中图分类号:S 912
文献标志码:A
随着人们生活水平的提高和工农业的发展，
大量氮磷等营养物质进入水体，导致水体富营养
化加剧，水华频发，进而引起水中溶氧量下降、水
质恶化，有些藻类还释放毒素，导致部分水生生
物死亡，并危及饮用水安全。常见的淡水水华藻
类主要有栅藻(Scenedesmus)、小球藻(Chlorella
vulgaris)、盘星藻(Pediastrum)和铜绿微囊藻
(Microcystis aeruginosa)等［1］，赤潮藻类有塔玛亚
历山大藻(Alexandrium tamarense)、赤潮异弯藻
(Heterosigma akashiwo)、双突角毛藻(Chaetoceros
didymus Ehrenberg)、柔弱角毛藻 (Chaetoceros
debilis Cleve)和新月菱形藻等 (Nitzschiaceae
closterium)［2］。目前常用的控藻方法有物理方法
如过滤法［3］、撒播黏土法［4］、人工打捞法［5］等，虽
然短时间内见效快，但程序复杂，不能彻底根除
隐患，很难大规模投入使用;化学方法如投加硫
酸铜和双氧水等无机除藻剂、二氯苯二甲脲等有
机除藻剂［6］、电化学法［7］、催化氧化法［8］等，虽然
见效快，但易引发二次污染，也难大规模投入使
用;生物方法如投加微生物制剂［9］、生物操控的
上行效应［10］、下行效应［11］和投放可释放化感物
质的植物［12］等。实际在控藻过程中，需要兼顾技
术、经济与自然环境状况，对不同方案进行效益
分析，以选择最优方案［13］。目前生物方法，尤其
是利用植物化感物质抑制藻类滋生具有良好的
应用前景［14］。
研究发现陆生植物如大麦秆 (Hordeum
vulgare)［15］、广玉兰(Magnolia grandiflora)［16］、红
树植物 (Mangrove plants)［17］、黑荆树 (Acacia
mearnsii)［18］ 等，以及一些水生植物如芦苇
4 期 赵金涛，等:超声-纤维素酶法提取狐尾藻抑藻成分的工艺优化
(Phragmites communis)［19］、黄花水龙(Jussiaea
stipulacea Ohwi )［20］、 凤 眼 莲 (Eichhornia
crassipes)［21］、轮藻(Charophyceae)［22］、狐尾藻
(Myriophyllum spicatum)［23］等均可释放化感物质
以抑制藻类的生长。狐尾藻为被子植物门
(Angiospermae)、双子叶植物纲(Dicotyledoneae)、
小 二 仙 草 科 (Haloragidaceae)、狐 尾 藻 属
(Myriophyllum)沉水植物，广泛分布于世界各地，
能吸收水中营养元素，且其水浸提液对藻类致死率
效果明显，因此常被用于净化水质，修复生态环境。
常用的化感物质提取方法包括溶剂浸提法、
水蒸气蒸馏法和厌氧腐解法。HONG等研究发现
芦竹(Arundo donax)水浸提液对产毒铜绿微囊藻
(Microcystis aeruginosa)的生长具有显著的抑制作
用，其 EC50为 4． 7 g /L
［24］。LI等利用有机溶剂浸
提法从芦苇中提取出对蛋白核小球藻(Chlorella
pyrenoidosa)和铜绿微囊藻具有抑制作用的化感
物质 2 －甲基乙酰乙酸乙脂［25］。胡晓佳等利用
水蒸气蒸馏法从一枝黄花(Solidago canadensis
L．)中提取的化感物质对铜绿微囊藻有抑藻作
用［26］。本实验主要研究利用超声波-纤维素酶法
提取狐尾藻抑藻有效成分的可行性，通过单因素
和正交试验法优化提取工艺，并与水浸提法相比
较，以期获得可有效抑制铜绿微囊藻生长的化感
物质提取方法，为有害藻类的控制提供实用技术
指导。
1 材料与方法
1． 1 实验材料
狐尾藻植株于冬季取自上海太和水环境科
技发展有限公司滴水湖基地，采集后经自来水和
蒸馏水清洗干净，然后自然风干，人工研磨粉碎，
过 20 目筛后备用。
铜绿微囊藻取自上海海洋大学水产与生命
学院藻种室，镜检无杂藻且生长良好，用 BG － 11
培养基［27］扩繁。培养条件为恒温 25 ℃，光照强
度约 3 000 lx，光暗比 12 h∶ 12 h，每天人工摇动 6
次，摇匀后，用血球计数板法计算藻细胞的数量，
当细胞生物量达到对数生长期时进行实验。实
验期间所用器皿和培养液均经灭菌处理，所有操
作过程在洁净工作台上进行。
实验仪器包括:数控超声波清洗器(KQ-
3200DB ，150 W，40 kHz，昆山市超声仪器有限公
司) ，电热恒温水浴锅(DK-S24 型，上海精宏实验
设备有限公司) ，Eppendorf 高速冷冻离心机
(5810r，深圳市赛亚泰科仪器设备有限公司) ，漩
涡振 荡 器 (CHA － S，常 州 国 华) ，纯 水 机
(0S007XXM1，上海诚铭科技有限公司) ，光照培
养箱(宁波莱福科技有限公司) ，可见分光光度计
(UV － 2102C，美国) ，电子天平(AE200，日本) ，
光学显微镜(OLYMPUS，日本) ，自动灭菌锅
(LDZX －30KBS，上海申安医疗器械厂) ，洁净工
作台(PSE-660，苏州真田洁净设备有限公司) ，血
球计数板等。
实验试剂包括:K2HPO4· 3H2O、MgSO4·
7H2O、CaCl2 · 2H2O、柠檬酸、柠檬酸铁铵、
NaNO3、EDTA-Na2、无水乙醇，纤维素酶。
1． 2 实验方法
1． 2． 1 化感物质提取步骤
称取 3 g 狐尾藻粉末、60 mL 经 0． 1 mol /L
HCl调节 pH 至 w 的水溶液和 m%纤维素酶(纤
维素酶质量 /藻粉质量 = m%)于 100 mL 锥形瓶
中，密封放置于恒温水浴振荡器，反应条件为:酶
解温度 t ℃，转速 120 r /min，酶解时间 x h，然后
放入超声温度 t ℃，超声功率 g %，超声时间 u h
的超声波清洗器中得粗提液，将粗提液转入 50
mL塑料离心管中，4 ℃、5 000 r /min离心 20 min，
取上清液保存。参考汪家政等［28］的方法，于 － 20
℃无水乙醇冰浴条件下，多次重复去除上清液中
的蛋白质，最后在恒温水浴振荡器中，以温度 t ℃
使上清液挥发浓缩结晶，并用蒸馏水定容至 50
mL，保存于冰箱中备用。此法得到狐尾藻化感物
质的质量浓度为 60 g /L(以狐尾藻粉末质量计) ，
提取步骤如图 1 所示。
图 1 狐尾藻化感物质提取步骤
Fig． 1 Extraction steps of allelo-chemicals
from Myriophyllum spicatum
165
上 海 海 洋 大 学 学 报 24 卷
1． 2． 2 单因素试验
选择酶解温度(20、30、40、50、60、70 ℃)、酶
解 pH(2． 0、3． 0、4． 0、5． 0、6． 0、7． 0)、酶解时间
(0． 5、2、4、8、16、32 h)、酶用量(0． 5%、1． 0%、
3%、6%、9%、15%)、超声功率 (40%、50%、
60%、70%、80%、90%)、超声时间(0． 5、1、2、3、
4、5h)6 个因子，按照图 1 所示步骤提取狐尾藻化
感物质，测定所得提取液对铜绿微囊藻的生长阻
碍率，并以生长阻碍率为指标确定最适的单因子
工艺条件。每组实验取 3 个平行，同时取无水乙
醇组做试剂空白对照。
1． 2． 3 正交试验
根据单因素试验结果，优化提取工艺。设计
酶解温度、酶解 pH、酶作用时间、酶用量和超声
波功率 5 因素 4 水平 L(45)正交试验，以提取液
对铜绿微囊藻的最大生长阻碍率为指标，评价各
组提取效率，并在最优工艺条件下重复操作，观
察稳定性。正交设计如表 1 所示。
表 1 正交试验因素和水平
Tab． 1 Factors and levels of orthogonal experimental design
水平
levels
因素 factors
A酶解温度 /℃
enzymatic hydrolysis
temperature
B 酶解 pH
enzymatic
hydrolysis pH
E超声功率 /%
ultrasonic
power
D酶用量 /%
enzymatic
hydrolysis dosage
C 酶作用时间 /h
enzymatic
hydrolysis time
1 20 2． 0 60 6% 2
2 30 3． 0 70 9% 3
3 40 4． 0 80 15% 4
4 50 5． 0 90 21% 5
1． 2． 4 提取液对铜绿微囊藻的抑制实验
取 4． 17 mL 不同条件下获得的狐尾藻提取
液、2． 5 mL处于对数生长期的铜绿微囊藻溶液和
5 mL浓缩 10 倍 BG-11 培养液置于 100 mL 锥形
瓶中，蒸馏水定容至 50 mL，各溶液中化感物质浓
度(以狐尾藻粉末质量计)均为 5 g /L。实验设 3
个平行，另设乙醇试剂空白对照，将锥形瓶置于
25 ℃光照培养箱内，光照强度约 3000 lx、光暗比
12 h∶ 12 h，每天人工摇动 6 次，每隔 24 h 观察计
数。
按照国际经合组织(OECD)规定的标准方法
计算藻类生长阻碍率［29］:
μti = ln(Nti /N0)/(ti － t0) (1)
ρti =(μ0 － μti)/μ0 × 100% (2)
式中:Nti为某一时间藻细胞浓度(cell /mL) ;N0 为
起始藻细胞密度(cell /mL) ;μti为某一时间藻细胞
生长速度［cell /(mL /d) ］;μ0 为对照组藻细胞生
长速度［cell /(mL /d) ］;ρti为藻细胞的生长阻碍
率。
1． 2． 5 水浸提液与超声波-纤维素酶法提取液抑
藻效果的对比
狐尾藻水浸出液的制备 取 20 g 狐尾藻茎
部干粉加入 400 mL 蒸馏水中，在室温条件下浸
泡 48 h，4 ℃、4 000 r /min 离心 30 min，多次离心
将浸出液浓缩结晶，用蒸馏水定容 200 mL 得提
取液 A，保存于 4 ℃冰箱内备用，所得提取液化感
物质的质量浓度为 100 g /L(以狐尾藻粉末质量
计)。
超声波-纤维素酶法提取液的制备 取 20 g
狐尾藻茎部干粉加入 400 mL pH = 3． 0 的水溶液
中，按照图 1 所示步骤，根据正交试验最优工艺
条件得狐尾藻超声波-纤维素酶法提取液，实验温
度条件下将提取液浓缩结晶后用蒸馏水定容至
200 mL得提取液 B，保存于 4 ℃冰箱内备用，所
得提取液化感物质的质量浓度为 100 g /L(以狐
尾藻粉末质量计)。
实验时，分别将 0 、2． 5 、5 、10 、15 和 20 mL
的提取液 A或提取液 B，2． 5 mL处于对数生长期
的铜绿微囊藻溶液和 5 mL 浓缩 10 倍的 BG-11
培养液置于 100 mL 锥形瓶中，蒸馏水定容至 50
mL，相应的化感物质浓度(以狐尾藻粉末质量
计)分别为 0 、5、10、20、30 和 40 g /L。设立 3 个
平行试验组，将锥形瓶置于 25 ℃光照培养箱内，
光照强度约 3 000 lx、光暗比 12 h∶ 12 h，每天人工
摇动 6 次，每隔 24 h观察计数。
1． 2． 6 数据分析
所有数据采用平均值 ± 标准差表示。用
Excel统计分析实验数据，用 SPSS 17． 0 进行方差
265
4 期 赵金涛，等:超声-纤维素酶法提取狐尾藻抑藻成分的工艺优化
分析和差异性研究，用 SigmaPlot 10． 0 软件绘图，
取 P ＜ 0． 05 为差异显著。
2 结果
2． 1 超声波-纤维素酶法单因素实验结果
2． 1． 1 酶解温度对提取液灭藻效果的影响
实验发现，试剂空白对照组溶液对铜绿微囊
藻生长无明显影响。由表 2 可知，随着酶解温度
的升高，提取液对铜绿微囊藻的生长阻碍率先升
高再降低，当酶解温度为 30 ℃时，生长阻碍率达
到最高，显著高于其他组，故适宜酶解温度为 30
℃。同时，随着提取液作用时间的延长，其对铜
绿微囊藻的抑制作用持续降低，各组间差异逐渐
缩小，说明提取液对铜绿微囊藻的抑制作用在早
期更为明显。
表 2 不同酶解温度下所得提取液对铜绿微囊藻生长阻碍率的影响
Tab． 2 Growth inhibition rate of M． aeruginosa treated with extraction obtained
under different enzymatic hydrolysis temperature %
时间 /h
time
酶解温度 /℃
enzymatic hydrolysis temperature
20 30 40 50 60 70
24 108． 42 ± 54． 69 153． 85 ± 60． 74 72． 94 ± 45． 35 119． 76 ± 18． 83 108． 19 ± 28． 12 1． 01 ± 30． 94
48 27． 93 ± 2． 92 50． 83 ± 13． 04 37． 15 ± 15． 98 32． 26 ± 13． 61 26． 50 ± 13． 34 33． 24 ± 18． 21
72 8． 37 ± 5． 08 34． 83 ± 5． 93 31． 89 ± 7． 07 20． 14 ± 10． 24 19． 15 ± 10． 80 24． 86 ± 10． 46
96 7． 76 ± 6． 85 19． 02 ± 5． 36 15． 64 ± 6． 29 10． 76 ± 1． 71 12． 34 ± 3． 21 9． 67 ± 3． 43
2． 1． 2 酶解 pH对提取液灭藻效果的影响
由表 3 可知，随着酶解 pH的升高，提取液对
铜绿微囊藻的生长阻碍率先升高后降低，当 pH
为 3． 0 时，提取液对铜绿微囊藻的生长阻碍率最
高，显著高于其他酶解 pH 组，同时，随着提取液
作用时间的延长，其对铜绿微囊藻的生长阻碍率
持续降低。作用时间为 96 h，酶解 pH 为 2 和 3
时所得提取液对铜绿微囊藻有抑制作用，前者抑
制作用明显小于后者，而其他酶解 pH 组所得提
取液对铜绿微囊藻的生长无抑制作用，故适宜酶
解 pH为 3． 0。
表 3 不同酶解 pH下所得提取液对铜绿微囊藻生长阻碍率的影响
Tab． 3 Growth inhibition rate of M． aeruginosa treated with extraction obtained
under different enzymatic hydrolysis pH %
时间 /h
time
酶解 pH
enzymatic hydrolysis pH
2． 0 3． 0 4． 0 5． 0 6． 0 7． 0
24 46． 79 ± 36． 02 50． 79 ± 6． 02 － 22． 59 ± 25． 15 30． 99 ± 6． 58 0． 00 ± 33． 79 11． 62 ± 20． 57
48 29． 66 ± 10． 09 34． 42 ± 21． 55 14． 88 ± 23． 44 23． 20 ± 4． 45 15． 71 ± 10． 20 27． 85 ± 22． 97
72 11． 44 ± 5． 36 23． 37 ± 11． 81 10． 08 ± 11． 05 6． 13 ± 4． 18 4． 80 ± 2． 40 6． 13 ± 21． 94
96 9． 68 ± 8． 72 11． 94 ± 8． 13 － 6． 15 ± 4． 79 3． 29 ± 6． 54 － 1． 11 ± 2． 80 1． 80 ± 8． 04
2． 1． 3 酶解时间对提取液灭藻效果的影响
由表 4 可知，随着酶解时间的增加，提取液
对铜绿微囊藻的生长阻碍率先升高再降低，当酶
解时间为 4 h 时，提取液对藻细胞的生长阻碍率
最高，显著高于其他酶解时间组，而且随着提取
液作用时间的延长，其对铜绿微囊藻的抑制作用
持续降低，各组间差异逐渐缩小，提取液对铜绿
微囊藻的抑制作用在早期更为明显，故适宜酶解
时间为 4 h。
2． 1． 4 酶用量对提取液灭藻效果的影响
由表 5 可知，随着酶用量的增加，提取液对
铜绿微囊藻的生长阻碍率持续升高，当酶用量为
15%时，提取液对铜绿微囊藻的生长阻碍率最
高，与其他组存在显著差异，故最适酶用量为
15%。随着提取液作用时间的延长，其对铜绿微
囊藻的生长抑制作用持续下降，各组间差异逐渐
缩小，提取液对铜绿微囊藻的抑制作用在早期更
为明显。
365
上 海 海 洋 大 学 学 报 24 卷
表 4 不同酶解时间下所得提取液对铜绿微囊藻生长阻碍率的影响
Tab． 4 Growth inhibition rate of M． aeruginosa treated with extraction obtained
under different enzymatic hydrolysis time %
时间 /h
time
酶解时间 /h
enzymatic hydrolysis time
0． 5 2 4 8 16 32
24 87． 99 ± 29． 52 67． 01 ± 19． 37 103． 15 ± 21． 60 60． 78 ± 28． 33 54． 91 ± 8． 05 75． 25 ± 25． 77
48 48． 40 ± 2． 75 49． 60 ± 2． 25 61． 10 ± 4． 47 46． 30 ± 3． 13 51． 45 ± 7． 15 54． 80 ± 14． 99
72 26． 00 ± 7． 36 28． 56 ± 12． 98 40． 37 ± 11． 74 20． 52 ± 5． 24 24． 19 ± 25． 02 30． 59 ± 1． 84
96 17． 13 ± 0． 12 22． 92 ± 13． 57 24． 92 ± 4． 06 17． 20 ± 1． 70 22． 07 ± 9． 34 23． 98 ± 6． 18
表 5 不同酶用量下所得提取液对铜绿微囊藻生长阻碍率的影响
Tab． 5 Growth inhibition rate of M． aeruginosa treated with extraction obtained
under different enzymatic hydrolysis dosage %
时间 /h
time
酶用量 /%
enzymatic hydrolysis dosage
0． 5% 1% 3% 6% 9% 15%
24 62． 29 ± 26． 80 77． 34 ± 44． 80 66． 79 ± 21． 44 78． 20 ± 23． 40 80． 80 ± 23． 91 98． 97 ± 21． 18
48 37． 27 ± 6． 23 49． 94 ± 12． 73 37． 01 ± 6． 03 49． 78 ± 9． 06 55． 28 ± 29． 73 62． 01 ± 23． 69
72 36． 43 ± 12． 92 37． 85 ± 2． 93 33． 53 ± 8． 13 44． 56 ± 10． 78 39． 54 ± 1． 96 46． 19 ± 6． 99
96 20． 97 ± 5． 80 28． 60 ± 11． 46 28． 60 ± 4． 38 27． 02 ± 4． 16 28． 06 ± 1． 04 31． 13 ± 7． 00
2． 1． 5 超声功率对提取液灭藻效果的影响
由表 6 可知，随着超声功率的增加，提取液
对铜绿微囊藻的生长阻碍率先升高后降低，当超
声功率为 80%时，提取液对铜绿微囊藻的生长阻
碍率最高，显著高于其他超声功率组，故最适超
声功率为 80%，即超声功率为 120 W。而且，随
着提取液作用时间的延长，其对铜绿微囊藻的生
长抑制作用持续降低，各组间差异逐渐缩小，提
取液对铜绿微囊藻的抑制作用在早期更为明显。
表 6 不同超声功率下所得提取液对铜绿微囊藻生长阻碍率的影响
Tab． 6 Growth inhibition rate of M． aeruginosa treated with extraction obtained under different ultrasonic power
%
时间 /h
time
超声波功率 /%
ultrasonic power
40% 50% 60% 70% 80% 90%
24 116． 24 ± 13． 46 115． 20 ± 7． 86 133． 29 ± 66． 80 112． 49 ± 13． 53 147． 18 ± 39． 30 136． 95 ± 0
48 55． 88 ± 18． 57 44． 51 ± 5． 15 50． 18 ± 17． 98 47． 76 ± 25． 01 77． 84 ± 9． 02 42． 87 ± 22． 75
72 32． 98 ± 5． 80 29． 29 ± 2． 29 27． 65 ± 5． 33 27． 24 ± 1． 92 32． 76 ± 10． 18 34． 13 ± 12． 89
96 25． 11 ± 6． 64 21． 92 ± 3． 29 25． 74 ± 7． 71 21． 92 ± 5． 17 29． 84 ± 1． 08 24． 47 ± 9． 48
2． 1． 6 超声时间对提取液灭藻效果的影响
由表 7 可知，随着超声时间的增加和提取液
作用时间的延长，各组提取液对铜绿微囊藻的生
长阻碍率未呈现规律性变化，经显著差异性分
析，各组间无显著差异(P ＞ 0． 05) ，故超声时间不
参与正交试验设计，在实际提取工艺中取超声时
间为 1 h。
表 7 不同超声时间下所得提取液对铜绿微囊藻生长阻碍率的影响
Tab． 7 Growth inhibition rate of M． aeruginosa treated with extraction obtained under different ultrasonic time %
时间 /h
time
超声时间 /h
ultrasonic time
0． 5 1 2 3 4 5
24 52． 94 ± 31． 19 64． 72 ± 41． 12 93． 50 ± 65，87 109． 80 ± 21． 12 89． 92 ± 47． 63 93． 50 ± 33． 55
48 69． 46 ± 12． 54 91． 51 ± 11． 72 74． 19 ± 21． 04 78． 01 ± 9． 39 67． 23 ± 30． 69 74． 94 ± 23． 08
72 51． 23 ± 9． 74 41． 57 ± 7． 23 31． 80 ± 14． 62 37． 21 ± 4． 07 29． 23 ± 9． 17 38． 33 ± 10． 55
96 18． 85 ± 4． 81 22． 06 ± 5． 79 20． 64 ± 6． 13 30． 05 ± 4． 28 33． 91 ± 16． 70 27． 19 ± 14． 35
465
4 期 赵金涛，等:超声-纤维素酶法提取狐尾藻抑藻成分的工艺优化
2． 2 正交实验结果
根据表 8 的 Ｒ值可知，各组提取液对铜绿微
囊藻的生长阻碍率影响程度依次为 B ＞ A ＞ E ＞
D ＞ C。根据 k3、k4 和酶作用时间可知，酶作用时
间 4 h的提取液与 5 h的提取液对铜绿微囊藻的
生长阻碍率不存在显著差异，故酶作用时间为 4
h。由表 9 可见，酶解温度、酶解时间、pH、酶用量
和超声时间对铜绿微囊藻的生长阻碍率影响均
达到显著性差异水平(P ＜ 0． 05) ，影响程度最大
是酶解 pH，然后是酶解温度，以提取液对铜绿微
囊藻的生长阻碍率为评价指标，5 个因素的最优
组合是 A2B2C4D4E3，即 pH 为 3． 0，酶解温度 30
℃，纤维素酶用量 21%，超声波功率 80% (120
W) ，酶作用时间 4 h。此优化工艺条件下，进行 3
次验证实验，提取液对铜绿微囊藻的生长阻碍率
均值达 180． 32%。
表 8 正交实验设计与结果
Tab． 8 The orthogonal table L16(45)and experimental results
序号
number
A酶解温度 /℃
enzymatic hydrolysis
temperature
B酶解 pH
enzymatic
hydrolysis pH
E超声功率 /%
ultrasonic
power
D 酶用量 /%
enzymatic
hydrolysis dosage
C酶作用时间 /h
enzymatic
hydrolysis of time
生长阻碍率 /%
growth
inhibition rate
1 20 2 60% 6% 2 125． 96
2 20 3 70% 9% 3 138． 12
3 20 4 80% 15% 4 236． 61
4 20 5 90% 21% 5 160． 93
5 30 2 70% 15% 5 175． 50
6 30 3 60% 21% 4 285． 02
7 30 4 90% 6% 3 189． 70
8 30 5 80% 9% 2 156． 27
9 40 2 80% 21% 3 118． 95
10 40 3 90% 15% 2 185． 74
11 40 4 60% 9% 5 159． 76
12 40 5 70% 6% 4 78． 27
13 50 2 90% 9% 4 98． 19
14 50 3 80% 6% 5 201． 98
15 50 4 70% 21% 2 144． 99
16 50 5 60% 15% 3 97． 28
k1 165． 40 129． 65 167． 00 148． 98 153． 24
k2 201． 62 202． 72 134． 22 138． 08 136． 01
k3 135． 68 182． 76 178． 45 173． 79 174． 52
k4 135． 61 123． 19 158． 64 177． 47 174． 54
Ｒ 66． 01 79． 53 44． 23 39． 39 38． 53
S 31． 34 39． 24 18． 76 19． 12 18． 64
表 9 方差分析表
Tab． 9 Analysis of variance for the growth inhibition rate of the algae
来源
source
偏差平方和
sum of Squares
自由度
df
均方
mean square F
显著性
significance
酶解温度 enzymatic hydrolysis temperature 35398． 9 3 11799． 62 18． 55 0
酶解 pH enzymatic hydrolysis pH 55 451． 5 3 18 483． 82 29． 05 0
酶用量 enzymatic hydrolysis dosage 12 638． 9 3 4 212． 97 6． 62 0． 001
酶作用时间 enzymatic hydrolysis time 13 135． 4 3 4 378． 48 6． 88 0． 001
超声波功率 ultrasonic power 12 539． 8 3 4 179． 95 6． 57 0． 001
误差 error 20 361 32 636． 28
总和 total 1 371 662． 6 48
总偏差平方和 corrected total 149 525． 5 47
565
上 海 海 洋 大 学 学 报 24 卷
2． 3 水浸提液与超声波-纤维素酶提取液对藻细
胞生长阻碍率的影响
由图 2 可知，随着水浸提液浓度的增加，其
对铜绿微囊藻的生长阻碍率持续升高，当浓度为
40 g /L，作用时间 24 h 时，最大生长阻碍率为
129． 78%。同时，随着提取液作用时间的延长，其
对铜绿微囊藻的抑制作用持续降低，各组间差异
逐渐缩小，7 d后，各浓度组提取液对铜绿微囊藻
生长的抑制作用消失。
图 2 水浸提液对铜绿微囊藻生长阻碍率的影响
Fig． 2 Influence of water extraction on the
growth inhibition rate of M． aeruginosa
由图 3 可知，随着超声波-纤维素酶提取液浓
度的增加，其对铜绿微囊藻的生长阻碍率持续升
高，当浓度为 40 g /L，作用时间 2 4h时，最大生长
阻碍率为 271． 74%。同时，随着提取液作用时间
的延长，其对铜绿微囊藻的抑制作用持续降低，
说明提取液对铜绿微囊藻的抑制作用在早期更
为明显。与水浸提液相比，仅低浓度组(5 g /L、10
g /L)在 7 d后对铜绿微囊藻抑制作用消失，其他
各组仍保留着比水浸提液更高的抑制能力，尤其
是 40 g /L浓度组，在第 13 天，对铜绿微囊藻的生
长阻碍率仍达 20%以上，显著高于其他组别(P ＜
0． 05)。
图 3 超声波-纤维素酶提取液对
铜绿微囊藻生长阻碍率的影响
Fig． 3 Influence of extraction of ultrasonic-cellulase
on the growth inhibition rate of M． aeruginosa
由图 4 可知，随着反应时间的延长，藻密度
不断增加。藻密度随着提取液浓度上升而下降。
40 g /L浓度组藻密度与其他浓度组存在显著性
差异(P ＜ 0． 05) ，与对照组存在显著差异(P ＜
0． 05)。
图 4 不同浓度超声波-纤维素酶提取
液下铜绿微囊藻的生长曲线
Fig． 4 Growth curves of M． aeruginosa at the different
concentration of extraction of ultrasonic-cellulase
3 讨论
狐尾藻茎部细胞壁的主要成分是纤维素，纤
维素酶可水解纤维素，破坏细胞结构，加速细胞
内容物的释放，超声波也可以破坏植物细胞结
构。本研究中发现，随着酶解温度升高，提取液
对铜绿微囊藻的生长阻碍率先升高后降低，30 ℃
达到最高，这与石亚中等［30］对酶解温度的研究相
类似，可能是由于纤维素酶是一种蛋白质，温度
对其活性产生影响，适宜的温度可以增强酶活
性，温度过高或者过低会使酶活性降低或者失
活，从而导致提取液中有效成分含量降低。随着
酶解 pH 升高，提取液对铜绿微囊藻的生长阻碍
率先升高后降低，3． 0 达到最高，可能是因为适宜
pH有助于酶和底物的有效结合，增强酶的活性，
提高化感物质提取率，反之则破坏酶的结构，导
致纤维素酶活性降低或失活，从而影响其对纤维
素的降解作用［31］。随着酶解时间延长，提取液对
铜绿微囊藻的生长阻碍率先升高后降低，4h 达到
最高，可能是因为酶解时间过短，纤维素分解不
完全，有效抑藻成分含量低;酶解时间过长，藻细
胞分解完全，但抑藻成分间相互作用，导致有效
成分的含量降低［30］。随着酶用量的增加，提取液
对藻细胞的生长阻碍率持续上升，这可能是因为
只有当酶量达到纤维素饱和状态，作用效果才更
高，才能够彻底分解藻细胞，加速内容物的释放，
665
4 期 赵金涛，等:超声-纤维素酶法提取狐尾藻抑藻成分的工艺优化
这与李梦雪等［31］对纤维素酶用量的研究结论相
一致。40 kHz 频率下，随着超声功率增加，提取
液对铜绿微囊藻的生长阻碍率先升高后降低，这
可能是因为超声功率在一定范围内可促进酶介
导的反应，如果功率过大，酶结构可能会发生不
可逆的变化，而且功率过大，也可能会降解化感
物质中的有效成分。
徐艳等研究发现利用超声 － 酶法提取黄柏
中小檗碱具有提取率高、省时、高效、节能等优
点［32］。本研究中超声波-纤维素酶提取液与水浸
提液相比，仅低浓度组(5 g /L、10 g /L)在 7 d 后
对铜绿微囊藻抑制作用消失，其他各组仍保留着
比水浸提液更高的抑制能力，尤其是 40 g /L浓度
组，在第 13 天，对铜绿微囊藻的生长阻碍率仍达
30%以上，显著高于其他组别(P ＜ 0． 05) ，表明超
声-酶法提取液抑藻效果好于水浸提液。本实验
中，狐尾藻水浸提液对铜绿微囊藻的抑制效率与
崔莉凤等［33］对狐尾藻的研究结论存在差异，可能
是因为本文中提取狐尾藻化感物质用的是蒸馏
水，而后者用的是培养液，也有可能是因培养条
件不同而导致。何连生等发现荷茎叶浸出液对
铜绿微囊藻的生长抑制率在 6 d 内先升高后降
低，最高可达 60%左右［34］。NAKAI 等发现穗花
狐尾藻与铜绿微囊藻共生培养下，短期内对铜绿
微囊藻有抑制作用［35］。而本研究中超声波-纤维
素酶狐尾藻提取液对铜绿微囊藻有持续抑制作
用，20 g /L及以上各组在 7 d 后仍保持着比水浸
提液更高的抑制能力。因此，超声波-纤维素酶法
提取狐尾藻化感物质具有较强的抑藻作用，可为
今后控藻研究提供一种研究方法，也为今后实际
应用提供一些指导。
参考文献:
［1］ 邹华，邓继选，朱银． 植物化感作用在控制水华藻类中的
应用［J］．食品与生物技术学报，2012，31 (2) :134 － 140．
ZOU H， DENG J X， ZHU Y． Application of plant
allelopathy in controlling of algal bloom［J］． Journal of
Science and Biotechnology，2012，31(2) :134 － 140．
［2］ 李玉瑛，李冰．鼠李糖脂对赤潮藻类的防治作用［J］．中国
环境科学，2010，30(s) :24 － 28．
LI Y Y，LI B． The effect of rhamnolipid on the mitigation of
red tide algae［J］． China Environmental Science，2010，30
(s) :24 － 28．
［3］ 张学礼，季爱玲．超滤膜在富营养化水处理中的应用前景
［J］．辽宁化工，2011，40(2) :148 － 155．
ZHANG X L，JI A L． Application prospect of ultrafiltration
membrane in treatment of eutrophic water［J］． Liaoning
Chemical Industry，2011，40(2) :148 － 155．
［4］ 余志，王仕汇．天然粘土治理赤潮的研究进展［J］．山西建
筑，2008，34(1) :191 － 192．
YU Z，WANG S H． Ｒesearch advancement on controlling red
tide by natural clay［J］． Shanxi Architecture，2008，34(1) :
191 － 192．
［5］ 潘攀，刘德启，李海青，等．藻类打捞对水体营养循环的影
响及其生态效果研究［J］． 环境工程学报，2012，4(7) :
1509 － 1512．
PAN P，LIU D Q，LI H Q，et al． Study on influence and
ecological effect of water nutrient cycle caused by algae
salvage［J］． Chinese Journal of Environmental Engineering，
2012，4 (7) :1509 － 1512．
［6］ 李今，华江环．几种除藻剂对铜绿微囊藻生长的毒性效应
［J］．沈阳师范大学学报:自然科学版，2011，29(3) :444 －
448．
LI J，HUA J H． Toxic effect of Cu2 +，H2O2 and 3-1，1-
dimethylurea(DCMU)to Microcystis aeruginosa［J］． Journal
of Shenyang Normal University :Natural Science，2011，29
(3) :444 － 448．
［7］ 白敏冬，白希尧，吕吉斌，等．强电离先进氧化 OH．治理赤
潮试验［J］．应用与环境生物学报，2004，10(5) :626 －
630．
BAI M D，BAI X Y，L J B，et al． Treating red tide using
strong ionization advanced oxidation OH． ［J］． Chinese
Journal of Applied ＆Environment Biology，2004，10(5) :
626-630．
［8］ 尹平河，黄风，赵玲．载 Fe3 +纳米 TiO2 薄膜去除球形棕囊
藻赤潮生物的研究［J］．热带海洋学报，2010，29(4) :102-
106．
YI P H，HUANG F，ZHAO L． Study on visible photocatalysis
removal of Phaeocystis globosa by use of Fe3 + -doped Nano-
TiO2 film［J］． Journal of tropical Oceanography，2010，29
(4) :102 － 106．
［9］ MAYALI X，AZAM F． Algicidal bacteria in the sea and their
impact on algal blooms［J］． The Journal of eukaryotic
microbiology，2004，51(2) :139 － 144．
［10］ 许海，朱广伟，秦伯强，等．氮磷比对水华蓝藻优势形成的
影响［J］．中国环境化学，2011，31 (10) :1676 － 1683．
XU H，ZHU G W，QIN B Q，et al． Influence of nitrogen-
phosphorus ratio on dominance of bloom-forming cyanobacteria
(Microcystis aeruginosa) ［J］． China Environmental Science，
2011，31(10) :1676 － 1683．
［11］ 张丽彬，王金鑫，王启山，等．浮游动物在生物操作法除藻
中的作用研究［J］．生态环境，2007，16(6) :1648 － 1653．
ZHANG L B，WANG J X，WANG Q S，et al． Effect of
zooplankton on removing algae in bio-manipulation ［J］．
Ecology and Environment，2007，16(6) :1648 － 1653．
［12］ 李小路，潘慧云，徐洁，等．金鱼藻与铜绿微囊藻共生情况
下的化感作用［J］．环境科学学报，2008，28(11) :2243 －
765
上 海 海 洋 大 学 学 报 24 卷
2249．
LI X L，PAN H Y，XU J，et al． Allelopathic effects of
Ceratophyllum demersum and Microcystis aeruginosa in co-
cultivation［J］． Acta Scientiae Circumstantiae，2008，28
(11) :2243 － 2249．
［13］ 张义龙，慕永通．基于生态系统的渔业管理理论探讨［J］．
中国渔业经济，2006(3) :34 － 36．
ZHANG Y L，MU Y T． The theoretical research about the
ecosystem-based fishery management［J］． Chinese Fisheries
Economics，2006(3) :34 － 36．
［14］ 洪喻，胡洪营．水生植物化感抑藻作用研究与应用［J］．科
学通报，2009，54(3) :287 － 293．
HONG Y，HU H Y． Ｒesearch and application of inhibitory
allelopathy from aquatic plants on algae［J］． Chinese Science
Bulletin，2009，54(3) :287 － 293．
［15］ TEＲLIZZID E，FEＲＲIEＲ M D，AＲMBＲESTEＲ E A，et al．
Inhibition of dinoflagellate growth by extracts of barley straw
(Hordeum vulgare) ［J］． Journal of Applied Phycology，
2002，14:275 － 280．
［16］ DONG K M，ZHOU X J，JIN C L，et al． Ｒesearch on
algistatic activities of allelochemicals in Magnolia Grandiflora
Leaves and GC-MS analysis［J］． Agricultural Science＆
Technology，2011，12(8) :1191 － 1194．
［17］ 孙志伟，段璐洋，周静韵，等．红树植物干粉和新鲜组织水
提物对两种赤潮藻的化感抑制效应［J］． 生态科学，2012，
31(2) :109 － 114．
SUN Z W，DUAN L Y，ZHOU J Y，et al． Allelopathic
effects of water extracts from mangrove plants dry powder and
fresh tissue on two red-tide algae［J］． Ecological Science，
2012，31(2) :109 － 114．
［18］ 罗凯，刘丹丹，周丽蓉，等．黑荆树提取物对铜绿微囊藻的
化感抑制效应［J］．深圳大学学报:理工版，2014，31(2) :
205 － 209．
LUO K，LIU D D，ZHOU L Ｒ，et al． Allelopathic inhibitory
effect of the Acacia mearnsii extracts on Microcystis Aeruginosa
［J］． Journal of Shenzhen University Science and
Engineering，2014，31(2) :205 － 209．
［19］ 门玉洁，胡洪营． 芦苇化感物质 EMA 对铜绿微囊藻生长
及藻毒素产生和释放的影响［J］．环境科学，2007，28(9) :
2059 － 2062．
MENG Y J，HU H Y． Effects of allelochemical ema from reed
on the production and release of cyanotoxins in Microcystis
aeruginosa［J］． Environmental Science，2007，28 (9) :
2059 － 2062．
［20］ 吴湘，吴昊，叶金云． 黄花水龙化感物质对铜绿微囊藻生
长及藻毒素产生和释放的影响［J］． 海洋与湖沼，2014，45
(4) :783 － 788．
WU X，WU H， YE J Y． Influences of allelochemical
extracted from Jussiaea stipulacea Ohwi on growth，
microcystins production，and release of Microcystis aeruginosa
［J］． Oceanologia et Limnologia Sinica，2014，45(4) :783 －
788．
［21］ 刘光涛，周长芳，孙利芳，等．凤眼莲化感物质对铜绿微囊
藻、斜生栅藻生长及细胞数相对比例的影响［J］． 环境科
学学报，2011，31(10) :2303 － 2311．
LIU G T，ZHOU C F，SUN L F，et al． Effects of Eichhornia
crassipes allelochemicals on the growth of two mono-and co-
cultured algae Microcystis aeruginosa and Scenedesmus
obliquus［J］． Acta Scientiae Circumstantiae，2011，31(10) :
2303 － 2311．
［22］ 李一葳，黄彩红，孟睿，等．轮藻浸出液对铜绿微囊藻生长
特性的影响［J］．湿地科学，2013，11(3) :388 － 391．
LI Y W， HUANG C H， MENG Ｒ， et al． Effect of
charophyceae extract on growth characteristicsof Microcystis
aeruginosa［J］． Wetland Science，2013，11(3) :388 － 391．
［23］ HU W，ZHANG D，ＲAN Y X，et al． The allelopathy of
myriophyllum spicatum on freshwater algae［J］． Journal of
Anhui Nomal University (Natural Science) ，2011，34 (4) :
359 － 364．
［24］ HONG Y，HU H Y． Effects of the aquatic extract of Arundo
donax L． (giant reed)on the growth of freshwater algae［J］．
Allelopathy Journal，2007，20(2) :315 － 325．
［25］ LI F M，HU H Y． Isolation and characterization of a novel
antialgal allelochemical from Phragmites communis［J］．
Applied Environmental Microbiology，2005，71(11) :6545 －
6553．
［26］ 胡晓佳，魏月姑，孙小红，等．加拿大一枝黄花提取物对铜
绿微囊藻的抑制作用［J］．环境科学与技术，2012，35(1) :
55 － 58．
HU X J，WEI Y G，SUN X H，et al． Inhibitive effects of
extracts of Solidago canadensis L． on Microcystis aeruginosa
［J］． Environmental Science ＆Technology，2012，35(1) :
55 － 58．
［27］ STANIEＲ Ｒ Y，KUNISAWA Ｒ，MANDEL M， et al．
Purification and properties of unicellular blue-green algae
(Order Chroococcales) ［J］． Bacteriological Ｒeview，1971，
35(2) :171 － 205．
［28］ 汪家政，范明． 蛋白质技术手册［M］． 北京:科学出版社，
2000，313:68 － 69．
WANG J Z，FAN M． Protein technology manual［M］．
Beijing:Science Press，2000，313:68 － 69．
［29］ 刘静铃，郎佩珍．硝基芳烃类对斜生栅列藻的毒性及中毒
症状［J］．环境科学，1995，16 (2) :7 － 10．
LIU J L，LANG P Z． Toxicities of nitroaromatic compound to
Scenedesmus obliquus and toxic symptoms［J］． Environmental
Science，1995，16(2) :7 － 10．
［30］ 石亚中，方娇龙，钱时权，等．响应曲面法优化纤维素酶酶
解提取工艺［J］．食品科学，2013，34 (4) :75 － 79．
SHI Y Z，FANG J L，QIAN S Q，et al． Ｒesponse surface
methodology for the optimization of enzymatic extraction of
resveratrol grape pomace with cellulase［J］． Food Science，
2013，34 (4) :75 － 79．
［31］ 李梦雪，张志军，孙子文，等．紫苏秸秆纤维素酶水解工艺
优化研究［J］．食品工业科技，2013，34(15) :193 － 195．
865
4 期 赵金涛，等:超声-纤维素酶法提取狐尾藻抑藻成分的工艺优化
LI M X，ZHANG Z J，SUN Z W，et al． Process optimization
on cellulose enzymatic hydrolysis of Perilla frutescens stalk
［J］． Science and Technology of food industry，2013，34
(15) :193 － 195．
［32］ 徐艳，刘少霞，孙娟． 超声-酶法提取黄柏中小檗碱的工艺
研究［J］．时珍国医国药，2007，18 (6) :1460 － 1462．
XU Y，LIU S X，SUN J． Extraction study of berberine from
cortex Phellodendri by ultrasonic wave-cellulase ［J］．
Lishizhen Medicine and Materia Medica Ｒesearch，2007，18
(6) :1460 － 1462．
［33］ 崔莉凤，赵硕，吴溶，等．穗花狐尾藻浸出液对铜绿微囊藻
生长和产毒的影响［J］．环境科学与技术，2010，33(12F) :
50 － 54．
CUI L F，ZHAO S，WU Ｒ，et al． Effects of extracts from
Myriophyllum spicatum L． on the production and release of
cyanotoxins in Microcystis aeruginosa［J］． Environmental
Science ＆ Technology，2010，33(12F) :50 － 54．
［34］ 何连生，孟繁丽，刁晓君，等．白洋淀荷茎叶提取液对铜绿
微囊藻及四尾栅藻化感效应［J］． 环境科学，2013，34
(7) :2637 － 2641．
HE L S，MENG F L，DIAO X J，et al． Allelopathic effect of
nelumbo nucifera stem and leaf tissue extract on the growth of
Microcystis aeruginosa and Scenedesmus quadricanda ［J］．
Environment Science，2013，34(7) :2637 － 2641．
［35］ NAKAI S，INOUE Y，HOSOMI M，et al． Growth inhibition
of blue-green algae by allelopathic effects of macrophytes
［J］． Water Science and Technology，1999，39(8) :47 － 53．
Optimal extraction of inhibitory components from Myriophyllum spicatum
with the ultrasonic-cellulase method
ZHAO Jintao1，JIANG Min1，2，WANG Junnan1
(1． College of Fisheries and Life Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China;2． Ｒesearch and Engineering
Center on Aquatic Environment Ecosystem，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China)
Abstract:The article explained that inhibitory components from Myriophyllum spicatum with the ultrasonic-
cellulase method and water extraction method caused inhibition of M． aeruginosa． Based on one-way and
orthogonal test，and regarding growth inhibition rate of extraction on M． aeruginosa as index of evaluation，an
optimal extraction process of Myriophyllum spicatum was obtained as follows:enzymatic hydrolysis time was 4
h，pH was 3． 0，optimal temperature was 30 ℃，cellulase dosage(mass of cellulase to Myriophyllum spicatum
powder)was 21%，ultrasonic power was 120 W and ultrasonic time was 1h． The inhibition rate of extraction
obtained with water extraction method and ultrasonic-cellulase method indicated that the latter showed better
effect and had obvious difference with the water extraction (P ＜ 0． 05)． With the increasing of reaction time，
the growth inhibition rate of the ultrasonic-cellulase extraction on M． aeruginosa continued to decrease，which
was 271． 74% at concentration of 40 g /L and reaction time for 24 h and the inhibition rate was more than
20% by the reaction time for 13d with the obvious difference with the other concentration groups (P ＜ 0． 05)．
Key words:ultrasound-cellulase method;Myriophyllum spicatum;M． aeruginosa;growth inhibition rate
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