全 文 ：第 38卷
双酚 A（Bisphenol-A，简称 BPA），是一种典型的
环境内分泌干扰物（EEDs），具有雌激素活性，会干扰
动物的正常内分泌功能。BPA广泛应用于化学工业，
是高分子材料聚碳酸酯、环氧树脂、阻燃剂等的前体
物质[1]，在生产和使用过程中通过废水或废物进入水
环境。目前发现水环境中 BPA的污染已经相当严重，
调查发现中国河南省贾鲁河的表层水和底泥中 BPA
平均浓度分别为 1.5 μg/L和 2.3 μg/g[2]，美国溪流水
中 BPA浓度为 12 μg/L[3]，葡萄牙河流和沿海水域中
BPA浓度约为 0.2~4.0 μg/L[4]。当 BPA浓度在 1 μg/L
时，就会对水生态系统造成不良影响，如使水生无脊
椎动物雌性化等[5]。因此，研究水体中 BPA的归趋对
Environmental Science & Technology
第 38卷 第 12期
2015年 12月
Vol. 38 No.12
Dec. 2 0 1 5
王乐乐，张国森，耿超，等.狐尾藻降解双酚A内生菌的分离鉴定及降解特性[J]. 环境科学与技术，2015，38（12）：16-21. WangLele，ZhangGuosen，
Geng Chao, et al. Isolation，identification and degradation properties of a bisphenol-a-degrading endophytic bacterium fromMyriophyllum verticillatumL.[J].
EnvironmentalScience&Technology，2015，38（12）：16-21.
狐尾藻降解双酚A内生菌的分离鉴定及降解特性
王乐乐 1， 张国森 1， 耿超 1， 杨娇艳 1*， 程浩艳 2， 蒋金辉 1， 杨劭 1
（1.华中师范大学生命科学学院； 2.华中师范大学物理科学与技术学院，湖北 武汉 430079）
摘 要：该研究从沉水植物狐尾藻中分离筛选到 1株可降解环境内分泌干扰物双酚 A（BPA）的内生细菌 Hu32。通过摇瓶实验进行
了菌株降解条件的优化和降解特性的探索，发现菌株降解初始浓度为 10 mg/L，BPA的最佳条件为接种量为 1%，初始 pH值为 6.0，温度
为 25 ℃。在该条件下，菌株最大生长浓度 OD600达到 0.22，3 d对 10 mg/L，BPA的降解率达到（47.17±1.22）%。经过对其形态特征和
16S r RNA基因同源性序列分析，该菌株初步鉴定为类芽孢杆菌属（Paenibacillus sp.）。这是首次从沉水植物中分离到新型可降解 BPA
的内生菌，有助于了解水生植物对 BPA污染水体的修复机制，为进一步阐明水体中 BPA的生态归趋奠定基础。
关键词：狐尾藻； 内生菌； 双酚 A； 类芽孢杆菌； 降解特性
中图分类号：X172 文献标志码：A doi：10.3969/j.issn.1003-6504.2015.12.004 文章编号：1003-6504(2015)12-0016-06
Isolation，Identification and Degradation Properties of a Bisphenol-A-
degrading Endophytic Bacterium from Myriophyllum verticillatum L.
WANG Lele1， ZHANG Guosen1， GENG Chao1， YANG Jiaoyan1*， CHENG Haoyan2，
JIANG Jinhui1， YANG Shao1
（1.College of Life Science，Central China Normal University；
2.College of Physical Science and Technology，Central China Normal University，Wuhan 430079，China）
Abstract：An endophytic bacterial strain Hu32，capable of utilizing Bisphenol A as source of carbon for growth，was
isolated from Myriophyllum verticillatum L. The degrading conditions for Strain Hu32 were optimized by tests in shaking
flasks and orthogonal tests. The results showed that the optimal conditions for the degradation on BPA at initial concentration
of 10 mg/L were 1% inoculum size，initial pH 6.0 and 25 ℃. Based on the above optimal conditions，the maximum optical
density （600 nm）of Strain Hu32 increased to 0.22 and （47.17±1.22）% BPA with an initial concentration of 10 mg/L was
degraded in three days. Strain Hu32 was preliminarily identified as Paenibacillus sp. based on morphological characteristics
and 16S rRNA gene sequence analysis. This is a novel Bisphenol-A-degrading bacterium isolated from the endophytes of
submerged macrophyte. It is helpful to illuminate the fate of BPA in water body and the bioremediation mechanism of toxic
pollutants contaminated body by macrophyte.
Key words：Myriophyllum verticillatum L.；endophytic bacteria；Bisphenol A；Paenibacillus sp.；degradation properties
《环境科学与技术》编辑部：（网址）http://fjks.chinajournal.net.cn（电话）027-87643502（电子信箱）hjkxyjs@vip.126.com
收稿日期：2015-05-30；修回 2015-07-10
基金项目：国家自然科学基金（31200399，30900054）；国家水体污染控制与治理科技重大专项（2013ZX07104-004-03）
作者简介：王乐乐（1988-），女，硕士研究生，研究方向为环境微生物，（电子信箱）wll2012112334@126.com；*通讯作者，女，副教授，博士，主要从事
水环境中有毒污染物的微生物修复研究，（电子信箱）yang_jiaoyan@126.com。
第 12期
于水体生态系统稳态的维持意义重大。
沉水植物作为水生植物的重要组成部分，是湖泊
生态系统的初级生产者之一，也是湖泊生态平衡的重
要调控者。沉水植物具有较强的水体净化作用，对水
体中的氮、磷、重金属、有机污染物等都有去除作用，
还能够分泌化感物质抑制藻类生长，增强水体稳定
性[6]。狐尾藻（Myriophyllum verticillatum L.）作为多年
生沉水植物的典型代表，不仅能够较快地除去水体中的
氮、磷等富营养化元素[7]，吸收其中的重金属元素[8-9]，
还能够去除水体中的 BPA[10]。同时研究发现，广泛存
在于植物体的内生菌，不仅能促进宿主植物生长[11- 12]，
还能协助植物体抵抗不良环境的影响[13-15]。据报道，
内生菌不仅能够促进植物修复重金属 Fe、Pb、Ni 污
染[13]，还能够降解硝基芳香族和杂酚类污染物，如三
硝基甲苯、2，4-二氯苯氧乙酸等[14-15]。由此推测狐尾藻
在去除 BPA的过程中，除了植物体本身的作用外，其
内生菌的作用也不容忽视。因此本研究选用狐尾藻为
实验材料，证实了狐尾藻内生菌对 BPA的去除作用，
并进行了高效降解菌的筛选、鉴定和降解特性的研
究，为阐明水生态系统中 BPA的归趋及污染水体中
BPA的生物修复奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 主要材料
狐尾藻采自湖北省武汉市东湖。
双酚 A（97%纯，Acros Organics Inc，USA）；色谱级
乙腈（Tedia，America），其它化学药品均为国药分析纯。
MS 培养基：大量元素为 KNO3 1.90 g，NH4NO3
1.65 g，KH2PO4 0.17 g，MgSO4·7H2O 0.37 g，CaCl2·
2H2O 0.44 g；微量元素为 KI 0.83 mg，H3BO3 6.2 mg，
MnSO4·4H2O 22.3 mg，ZnSO4·7H2O 8.6 mg，Na2MoO4·
2H2O 0.25 mg，CuSO4·5H2O 0.025 mg，CoCl2 0.025
mg；铁盐为 Na2·EDTA 37.3 mg，FeSO4·7H2O 27.8 mg；
有机成分为肌醇 100 mg，甘氨酸 2 mg，VB1 0.1 mg，
VB6 0.5 mg，VB5 0.5 mg，蔗糖 30 g，6-BA 1.0 mg，
NAA 0.1 mg；蒸馏水 1 000 mL，pH 5.6~5.8。
无机盐培养基（Basal mineral salt medium，BSM）：
K2HPO4 4.35 g，KH2PO4 1.7 g，NH4Cl 2.1 g，MgSO4 0.2 g，
MnSO4 0.05 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，CaCl2·2H2O 0.03 g，
蒸馏水 1 000 mL，pH 6.8~7.0。
含 BPA的无机盐培养基（BSMB）：在 BSM配置的
基础上，每升培养基中加入 10 mg BPA（甲醇助溶）。
LB培养基：胰蛋白胨 10 g，NaCl 10 g，酵母提取
物 5 g，加水定容到 1 000 mL。
1.2 组织培养
选取生长状况良好的狐尾藻短芽，去除叶片，自来
水反复冲洗后浸泡 12 h。然后用 70%酒精浸泡 30 s，
10%次氯酸钠浸泡 5 min，无菌水反复冲洗 3~5次，置
于MS培养基 25 ℃恒温光照培养。约 10~15 d后腋芽
开始萌发，待茎节上长出多个腋芽后，将腋芽分离进
行增殖培养。
1.3 植物组织及其总内生菌对 BPA的去除实验
无菌条件下，取表面除菌的狐尾藻 1.0 g，加入适
量 BSMB培养基匀浆，2 000 r/min离心 1 min，取上
清。沉淀重悬，离心，取上清重复 3次。将上述所有上
清液混合并定容 100 mL 作为内生菌实验组。以
BSMB培养基为对照组，BSMB培养基加入 1.0 g表
面除菌的狐尾藻为植物实验组。每个处理 3个重复。
样品置于 30 ℃、180 r/min的摇床上振荡培养 3 d。分
别于培养前后取样测定 BPA浓度。
1.4 内生菌的分离纯化及其 BPA降解实验
无菌条件下，取表面除菌的狐尾藻 0.2 g，加入 1
mL无菌水匀浆。将匀浆液转移到 2 mL离心管，2 000
r/min离心 1 min，以上清液为母液，稀释 10-1、10-2、10-3
3 个梯度菌悬液，分别取 200 μL涂布于固体 BSMB
培养基，30 ℃黑暗培养 5~7 d，划线分离单菌，保藏
于-80 ℃。
将分离到的单菌转接于 LB液体培养基，30 ℃、
180 r/min恒温振荡培养 12～16 h。取菌液适量，离心、
洗涤，调整 OD600=1.0制成菌悬液，按 1%（体积比）的
接种量接种于 BSMB培养基。对照组为 BSMB培养
基。样品放于 30 ℃、180 r/min的摇床上振荡培养 3 d。
分别于培养前后取样测定 BPA浓度。根据 BPA的去
除率筛选出降解 BPA的高效菌。
1.5 BPA的定量测定
BPA的定量测定采用高效液相色谱法。将培养液
样品在台式高速冷冻离心机（Heal Force Neofuge
23R）上常温 10 000 g离心 10 min，上清液用 0.22 μm
滤膜过滤后，用于高效液相色谱测定。高效液相色谱
仪为戴安 Ultimate 3000，色谱柱为 Agilent C18柱。色
谱条件为流动相∶乙腈和水的体积比为 55∶45，流速为
1.0 mL/min，检测器为紫外检测器，检测波长为 278
nm，进样量为 20 μL。
1.6 高效菌株生长条件的测定和降解条件的优化
菌株活化，离心、洗涤，调整 OD600=1.0 制成菌悬
液，备用。在不同接种量、初始 pH值、温度的条件下，
转速为 180 r/min的摇床上振荡培养 3 d，分别测定菌
株培养前后 OD600的变化。其中，设定接种量为 0.5%、
1%、2%、3%、4%，初始 pH值为 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，温
度为 20、25、30、35、40 ℃。
王乐乐，等 狐尾藻降解双酚A内生菌的分离鉴定及降解特性 17
第 38卷
以适宜菌株生长的接种量、初始 pH值、温度分别
为三因素的不同水平，以 BPA去除率为指标，采取三
因素三水平的正交试验法设计实验，制作 L9（3×3）的
正交表格，以获得降解菌株的最优降解条件。每个实
验设 3个重复。
1.7 生长曲线和降解动力学
菌株活化，离心、洗涤，调整 OD600=1.0制成菌悬液，
按照 1.6的最佳降解条件接种，30 ℃、180 r/min振荡培
养，每12 h取一次样，用于光吸收值OD600的测定和BPA
含量的测定，做 3个重复，绘制生长曲线和降解曲线。
1.8 菌株鉴定
1.8.1 菌株形态特点
根据分离菌株的菌落形态特征，利用革兰氏染色
以及电镜（JEOL，JSM-6700F，Japan）扫描等常规方
法，记录菌株的特点。
1.8.2 16S rRNA 基因序列分析及系统进化树的构建
液体 LB培养基摇菌，12 000 r/min离心 1 min收
集菌体，CTAB法提取基因组 DNA，作为扩增模板。
16S rRNA 扩增的 PCR 反应所用引物为 27F 和
1492R。PCR 反应体系（50 μL）：模板 2.0 μL，引物
27F 和 1492R各 2.0 μL，2×ES Taq Mastermix（康为
世纪）25.0 μL，RNase-Free Water 19.0 μL。PCR扩增条
件：先 94℃预变性 5 min；然后 94℃ 30 s，55℃ 30 s，
72 ℃ 1.0 min，循环 30 次；最后 72 ℃ 延伸 5 min，4 ℃
保温。用 1%琼脂糖凝胶对扩增产物进行电泳检测。
PCR 产物的纯化用康为世纪生物科技公司的 Gel
Extraction Kit，具体步骤参看说明书。PCR纯化产物
交上海生工生物工程技术服务有限公司测序。将测得
的 16S rRNA 序列与 GenBank 数据库中序列进行
BLAST分析。以 16S rRNA基因序列为依据，利用
MEGA 6.0软件构建系统进化树，分析菌株与其它几株
菌的遗传进化关系。
1.9 数据的统计分析
用软件 SPSS 19.0进行数据统计分析，分别采用
LSD法和双侧 t检验对数据进行单因素方差分析和
显著性差异分析。
2 结果与分析
2.1 植物组织及其总内生菌对 BPA的去除
1.0 g表面除菌的狐尾藻及其内生菌对 BPA的去
除结果如图 1。表面除菌的狐尾藻培养 3 d后对 BPA
的去除率达到（70.75±0.30）%，与对照组有极显著性差
异（P<0.01）；而总内生菌经过培养 3 d后对 BPA的去
除率为（9.96±2.03）%，显著高于对照组（P<0.05）。结果
表明，狐尾藻对高浓度 BPA有较强的去除作用，在水
体 BPA的迁移和转化中扮演重要角色。体外培养的
植物内生菌对 BPA也有去除作用，推测内生菌参与狐
尾藻对水体 BPA污染的原位修复，可能减轻 BPA对
植物体的毒害，增加植物的抗逆性。
2.2 降解 BPA内生菌的分离
从狐尾藻内生菌中分离到了多株可降解 BPA的
菌株，并测定了 3 d内对 10 mg/L BPA的降解能力。
其中 Hu32 的降解率最高，3 d 对 BPA 的降解率为
（33.46±2.38）%，与对照组有极显著性差异（P<0.01），
如图 2所示。
2.3 菌株鉴定
2.3.1 菌落形态
Hu32在 LB固体培养基上呈乳白色半透明菌落，
表面光滑，凸起，边缘整齐。菌体杆状，革兰氏阴性。扫
描电镜结果如图 3，长约 1.588 ~2.336 μm，宽约
0.388~0.777 μm。
18
第 12期
2.3.2 16S rRNA 测序结果分析及系统进化树的
构建
菌株 Hu3216S rRNA 已在 GeneBank中注册，登
录号为 KJ946204。在 NCBI中进行 Blast检索，发现
Hu32 16S rRNA 序列与类芽孢杆菌属（Paenibacillus
sp.）的同源性最高，相似度都达到 100%。Hu32 16S
rRNA基因序列构建的系统发育树见图 4。从系统
进化树可以看出，Hu32 与 Paenibacillus 属聚类，自
展值为 100，故应归属于 Paenibacillus sp.。综合形态
学特征和 16S rRNA 基因序列分析，将 Hu32 归于
Paenibacillus属。
2.4 菌株生长条件的测定
不同接种量、初始 pH值和温度对菌株 Hu32 的
生长影响如图 5、6、7所示。当接种量为 1%~3%时，菌
株生长良好，而接种量为 0.5%和 4%时，菌株的生长量
与摇菌前相比变化不大。在此接种量范围内，初始
pH值在 5.0~8.0时，菌株长势良好，最适 pH为 7.0，倾
向生活于弱酸、弱碱和中性环境中，适应范围较宽，
而初始 pH值为 9.0时，菌株生长量急剧下降；温度在
20~30 ℃时，菌株生长量随温度升高而逐渐增大，且
在 25 ℃和 30 ℃时生长量达到最大，而温度在 30 ℃以
上时，菌株生长量急剧下降。不同接种量、初始 pH值
和温度对菌株生长的影响结果表明，适宜菌株生长的
接种量为 1%、2%、3%，温度为 20、25、30 ℃，初始 pH
值为 5.0~8.0。
2.5 菌株降解条件的优化
选择适宜菌株生长的接种量、初始 pH值和温度
分别为三因素的不同水平，建立菌株 Hu32的降解条
件优化的正交试验表见表 1。其中，接种量的 3个水平
为 1%、2%、3%，温度的 3个水平为 20、25、30 ℃，适宜
菌株生长的初始 pH值为 5.0~8.0，但考虑到一般天然
水体的 pH值为 6.0~9.0，故选择 6.0、7.0、8.0为初始
pH值的 3个水平。结果表明，接种量、初始 pH值、温
度 3个因素的极差分别是 45.74、38.67、23.13，由此得
出各因素对菌株降解的重要性从大到小依次为接种
量、初始 pH值、温度。
接种量对菌株 Hu32去除 BPA影响最大，当接种
量为 1%时，菌株对 BPA的降解率最高，而接种量为
表 1 菌株 Hu32降解 BPA的条件优化的正交实验表
Table 1 Orthogonal test design of optimizing the degradation
condition for Strain Hu32
因素 接种量/% pH 温度/℃ 降解率/%
1 1 6.0 20 46.00
2 1 7.0 25 47.17
3 1 8.0 30 18.00
4 2 6.0 25 20.89
5 2 7.0 30 25.89
6 2 8.0 20 18.65
7 3 6.0 30 22.10
8 3 7.0 20 23.32
9 3 8.0 25 21.06
K1 /% 111.17 88.99 87.97
K2 /% 65.43 96.38 89.12
K3 /% 66.48 57.71 65.99
Ri 45.74 38.67 23.13
王乐乐，等 狐尾藻降解双酚A内生菌的分离鉴定及降解特性 19
第 38卷
2%和 3%时，降解率有明显下降。因此，选择 1%作为条
件优化的最佳接种量。pH对降解率的影响次之，pH
为 6.0和 7.0时降解率变化不大，而 pH为 8.0时降解
率有显著降低，表明偏碱性的环境不利于 Hu32 对
BPA的降解，初始 pH为 7.0时菌株 Hu32 的降解率
最高，故选择 7.0作为条件优化的初始 pH值。培养温
度是 25 ℃ 时降解效果最好。因此，分别选择 1%、7.0、
25 ℃作为条件优化的最佳接种量、初始 pH值、温度，
在该优化条件下，Hu32对 BPA的 3 d降解率达（47.17±
1.22）%。
2.6 菌株 Hu32的生长及对 BPA的降解
菌株 Hu32在接种量为 1%、初始 pH值为 7.0、温
度为 25 ℃的最佳降解条件下培养 3 d，每隔 12 h对
光吸收值OD600和 BPA的残留进行测定。该菌株在 3 d
内的生长曲线及对 BPA的降解曲线如图 8所示。0~
24 h，菌株处于迟缓期，生长缓慢。24~48 h，菌株呈现
对数生长的趋势，对数期后期 BPA残留量迅速减少。
48 h后进入稳定期，BPA残留量仍呈下降趋势。经过
72 h的培养，（47.17±1.22）%的 BPA被去除。
3 讨论
与宿主植物长期共生互作的内生菌，其功能和活
性不同于其它环境中的微生物。已有研究表明，内生
菌能通过固氮作用[11]、分泌促生长物质 [11]、拮抗病原
菌[12]等实现与宿主植物的共生。同时内生菌主要以生
物膜（biofilm）形式定植在植物体内[16-17]，协助内生菌
抵抗不良环境[18-20]，进而更加高效地促进植物生长。
此外，内生菌能够协同植物体降解环境中的重金属
及有机污染物。如从超富集植物遏兰菜（Thlaspi
goesingense）、龙葵（Solanum nigrum）等中分离到的对
铜、镉、铅、镍、铬、锌、钴等重金属有较强抗性的内生
菌菌株[21-22]。从白杨（Populus）内生菌中分离到了能够
降解甲苯、苯、乙苯、二甲苯、2，4-二氯苯氧乙酸
（2，4-D）、三硝基甲苯等污染物的菌株[14-15，23]。从水生
植物眼子菜（Potamogeton crispus）、大茨藻（Najas
marina）、睡莲（Nymphaea tetragona）、芦苇（Phragmites
communis）中分离到降解毒死蜱、甲氰菊酯、萘等污染
物的内生菌菌株[24]。由此可见，内生菌在降解污染物
方面的潜力巨大，对环境中污染物的修复意义重大。
作为一种环境内分泌干扰物，双酚 A在环境中广
泛存在。BPA在工业生产和生活用品中被广泛应用，
且不断排放到环境中，在不同水体中都能检测到 BPA
的污染[1，25-26]。作为一种雌性环境激素，BPA具有生殖
毒性、胚胎发育毒性和致癌性。水体中 BPA的污染势
必会对水生态系统的安全造成威胁。水环境中的 BPA
浓度低、存在范围广，生物修复方法最可行，且以微生
物对 BPA污染的修复研究较多。目前，国内外报道的
BPA降解菌主要是从河水、土壤、污水处理厂[27-31]中分
离获得，未有从植物体尤其是水生植物内生菌中分离
的报道。已发现的 BPA降解菌集中在鞘氨醇单胞菌
属（Sphingomonas sp.）[27]、假单胞菌属（Pseudomonas
sp.）[28 -29]、芽孢杆菌属（Bacillus sp.）[30]、链霉菌属
（Streptomyces sp.）[31]、无色菌属（Achromobacter sp.）[32]
等。本研究选用对 BPA有去除作用的狐尾藻为实验
材料，并从其内生菌中分离得到一株类芽孢杆菌
Hu32。这是首次从沉水植物内生菌中分离到的新型
BPA降解菌，为水体中 BPA的污染修复奠定了理论
基础。
通过狐尾藻内生菌的体外增殖培养，发现内生
菌能够去除水体中的 BPA，且分离到的内生菌 Hu32
在接种量为 1%、初始 pH 值为 7.0、温度为 25 ℃的
最佳降解条件下，3 d 对 10 mg/L BPA 的去除率达
（47.17±1.22）%。由此推测内生菌对植物体去除水中双
酚 A有促进作用。这对于揭示狐尾藻对水体中 BPA
的去除机制具有重要意义，同时也为阐明水体中 BPA
的归趋提供了理论支撑。
4 结论
（1）1.0 g狐尾藻内生菌经过植物体外增殖培养 3 d
对 10 mg/L BPA的去除率为（9.96±2.03）%，推测内生
菌在植物体的原位修复中，能够解除部分 BPA对植
物体的毒害，增加植物的抗逆性，促进植物修复水体
BPA污染。
（2）从内生菌中分离得到的菌株 Hu32，经过形态
学特征、16S rRNA 同源序列分析，确定该菌株为
Panebacillus sp.。
（3）菌株Hu32最佳降解 BPA条件为接种量是 1%，
初始 pH值是 6.0，温度是 25 ℃。在该条件下，菌株最
大生长浓度 OD600达到 0.22，3 d 对 10 mg/L BPA 的
降解率达到（47.17±1.22）%。
20
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