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廖映辉，黄彩微，史佑海，等． 海南霸王岭毛棉杜鹃根部真菌的多样性［J］． 江苏农业科学，2016，44(6):432 － 437．
doi:10． 15889 / j． issn． 1002 － 1302． 2016． 06． 128
海南霸王岭毛棉杜鹃根部真菌的多样性
廖映辉，黄彩微，史佑海，丁 琼
(海南大学园艺园林学院，海南海口 570100)
摘要:以生长于海南岛霸王岭的毛棉杜鹃(Ｒhododendron moulmainense)为材料，用分子检测技术对其根部真菌的
rDNA － ITS序列进行扩增、克隆、测序，以及序列分析，共检测出 28 种真菌，其中子囊菌门(Ascomycota)19 种，担子菌
门(Basidiomycota)8 种，接合菌门(Zygomycota)1 种，其中物种最丰富的真菌类群为子囊菌门锤舌菌纲的柔膜菌目。采
用 Bootstrap法估算真菌的物种丰富度，表明霸王岭地区毛棉杜鹃的根系真菌至少有 37 种，并且物种累积曲线显示:随
着根系真菌的宿主植物个体数增加，Shannon － weiner多样性指数和物种丰富度增大，且物种数增加的潜力仍然较大。
研究结果表明，毛棉杜鹃根部真菌种类极丰富，有必要全面开展杜鹃花属植物根部真菌分子检测，并从中筛选出对杜
鹃花属植物生长有良好效应的真菌。全面揭示杜鹃花属植物的根部共生真菌多样性必将有助于杜鹃花属植物的保育
与引种栽培。
关键词:杜鹃花属;根系真菌;菌根;多样性
中图分类号:S685． 210． 2 文献标志码:A 文章编号:1002 － 1302(2016)06 － 0432 － 06
收稿日期:2016 － 01 － 26
基金项目:海南省重大科技项目(编号:ZDZX2013012)。
作者简介:廖映辉(1992—)，女，福建龙岩人，硕士研究生，主要从事
杜鹃花菌根真菌的多样性研究。E － mail:328949021@ qq． com。
通信作者:丁 琼，博士，讲师，主要从事菌根研究。E － mail:
dingqiong1@ gmail． com。
杜鹃花科(Ericaceae)植物根系在自然生境中与真菌形
成的互利共生体，称之为杜鹃花菌根(Ericoid mycorrhiza，
EＲM)［1］。野外条件下，杜鹃花类植物的菌根真菌能有效地
加强其对土壤中可溶性无机态 N、P 或不可溶性 N、P 复合物
的吸收利用［1 － 2］。北美地区的园艺生产中，常用杜鹃花类菌
根真菌接种蓝莓，以减少化肥的施用［3］。杜鹃花属(Ｒhodo-
dendron)是杜鹃花科的物种较为丰富的属，古诗有云“花中此
物为西施，芙蓉芍药皆嫫母”，具有极高的观赏价值和园林应
用价值，在市场上具有极大的产业发展前景。我国是杜鹃花
属植物最为重要的起源地和分布中心，共有约 530 种，占世界
总数的 59%［4］。相对于其他杜鹃花科植物欧石楠属(Cal-
luna)和越橘属(Vaccinium)而言，杜鹃花属植物根系真菌的
研究少之又少，自 2000 年来主要涉及宿主如 Ｒ． fortunei、Ｒ．
dauricum、Ｒ． decorum、Ｒ． obtusum var． kaempferi、Ｒ． argyro-
phyllum、Ｒ． floribundum、Ｒ． lochiae、Ｒ． pulchrum、Ｒ． maximum、
Ｒ． rubropilosum 等，且能形成杜鹃花类菌根真菌的大多数为
子囊菌门，包括柔膜菌目真菌及树粉孢属真菌，少部分为担子
菌门或其他类真菌［5 － 23］。
海南岛是我国唯一地处热带的岛屿，丰富的光照和温度
资源、复杂的地形和地貌孕育了多样性的热带特色野生花卉
资源，共分布 9 种 1 变种杜鹃花［24］。毛棉杜鹃(Ｒ． moul-
mainense Hook． f．)亦是其中一种，其分布范围还遍及我国江
西、福建、湖南、广东、广西、四川、贵州和云南等地，多数生长
在海拔 700 ～ 1 500 m 的山顶或山地林中。毛棉杜鹃花冠通
常为淡紫色、粉红色或者淡红白色，狭漏斗形。花期长，花朵
繁盛，颜色艳丽，还是杜鹃属植物中少有的耐热性种质资源，
具有非常高的园林应用潜力。当前野生杜鹃引种、栽培十分
困难是其园林应用的瓶颈。采用真菌分子检测技术，揭示毛
棉杜鹃在自然环境中的根系真菌多样性，有助于今后筛选出
能促进毛棉杜鹃生长的菌根真菌，可以有效地指导其引种、栽
培及园林应用。本研究结果不仅对毛棉杜鹃种群的保育具有
重要意义，而且对我国热带地方特色花卉资源利用及花卉产
业的资源优势发挥有重要意义。
1 材料与方法
1． 1 样品采集地点
样品采集于海南霸王岭国家级自然保护区(18． 87° ～
19. 20° N，108． 88° ～ 109． 33° E)，地处海南岛西南部昌江县
境内。保护区的气候属热带季风气候，年平均温度23． 6 ℃，
—234— 江苏农业科学 2016 年第 44 卷第 6 期
年均降水量 1 500 ～ 2 000 mm［25］。海拔高度在 100 ～ 1 700 m
范围，保护区内的土壤以砖红壤为主要类型，随着海拔高度的
增加不断过渡为山地红壤［26］。低地雨林和山地雨林是该地
区分布最广的 2 个主要植被类型，低地雨林是以青梅(Vatica
mangachapoi)、荔枝(Litchi chinensis)等为优势种，山地雨林以
鸡毛松(Podocarpus imbricatus)、陆均松(Dacrydium pierrei)等
为优势种［27］。
1． 2 样品采集
采集时，选取成年的植株，沿主干找到最细的发根部分，
在不同位置上用枝剪小心剪下。将取到的发根同附着的土块
在水中浸泡约 1 h，用水小心冲洗干净后置于装有 75%乙醇
的塑料管中，标号，－ 80 ℃冰箱中保存。共采集 8 株毛棉杜
鹃植株。
1． 3 真菌分子检测
1． 3． 1 DNA提取 杜鹃花属植物根系真菌 DNA 的提取采
用改良的 CTAB 法［28］。在提取 DNA 之前，对根系样品进行
预处理。每份样品提取 12 份 DNA，每份 DNA 样品为随机挑
选的 50 份约 1． 5 cm 长的毛根，并置于 1． 5 mL 的离心管中，
加入 20 μL CTAB 提取缓冲液，放置于 － 80 ℃冰箱冰冻 1 夜
后在冰浴中使用电钻研磨成沫。
1． 3． 2 ITS扩增 采用普通的 PCＲ 方法扩增真菌的内转录
间隔区，扩增引物为 ITS1F(5 － CTTGGTCATTTAGAGGAAG-
TAA －3)和 ITS4 (5 － TCCTCCGCTTATTGATATGC － 3)，引
物序列由上海生物工程有限公司合成。PCＲ 反应体系总共
25 μL，分别含有:1 μL 模板 DNA，0． 2 mmol /L dNTPs，2． 5 μL
10 × PCＲ缓冲液(TaKaＲa，Otsu，Japan)，ITS1F与 ITS4 引物各
0． 2 μmol /L，0． 8 μmol /L 牛血清白蛋白(Bovine serum albu-
min，BSA)，1． 5 U Taq DNA 聚合酶(TaKaＲa，Otsu，Japan)。
PCＲ反应程序:95 ℃预变性 5 min;94 ℃变性 40 s，55 ℃退火
40 s，72 ℃延伸 55 s，共 30 个循环;最后 72 ℃延伸 10 min。
最后将 ITS － PCＲ产物在 0． 8%的琼脂糖凝胶上电泳，用凝胶
成像仪观察、拍照。
1． 3． 3 PCＲ产物克隆及测序 将同一植株的 12 份 PCＲ 产
物混合后电泳、切胶回收。将回收的 PCＲ 产物作为外源
DNA，克隆到 pMD19 － T Vector (TaKaＲa，Otsu，Japan)，在
16 ℃ 下连接过夜，用 E． coli DH5α感受态细胞(TaKaＲa，Ot-
su，Japan)进行转化。从每株宿主植物的根系真菌克隆文库
中随机挑选 30 个呈白斑的克隆，用引物 ITS1F和 ITS4 扩增;
PCＲ产物在 0． 8%的琼脂糖凝胶上电泳检测。电泳检测呈阳
性 PCＲ产物测序委托北京三博远志生物技术有限责任公司。
1． 3． 4 生物信息学分析 在 Bioedit 软件中对真菌的
ITS1 － 5． 8S － ITS2 全序列进行编辑和比对。ITS 序列一致性
(identity)≥97%的真菌被视为同一个分类单元(operational
taxonomical unit，OTU)。每个 OTU的参考序列与 NCBI(Gen-
Bank)数据库中的序列进行比对，确定与试验克隆亲缘关系
最近的种属。将 ITS 序列通过 ClustalX2 进行序列间的匹配
排序(必要时需要手动调整)。NJ 系统发育树的构建采用
MEGA 5。将本试验获得的 ITS 序列提交至 NCBI 数据库中，
获得相应的序列号为 KU550104 － KU550131。
1． 4 数据分析
用软件 Estimate S 9 中提供的 Bootstrap 方法估计研究区
物种丰富度，并计算 Shannon － Weiner 多样性指数，并用物种
累积曲线评估抽样到的真菌群落的物种是否能较全面地反映
当地物种库。
2 结果与分析
2． 1 毛棉杜鹃根系真菌多样性
对 8 株毛棉杜鹃的根系真菌进行检测，获得真菌 ITS 有
效序列 84 条，并划分为 28 个 OTUs(以后统称为物种)(表
1)。子囊菌门(Ascomycota)19 种，其中包括锤舌菌纲(Leotio-
mycetes)13 种、粪壳菌纲(Sordariomycetes)2 种、散囊菌纲
(Eurotiomycetes)3 种和未能鉴定到纲水平的盘菌亚门(Pez-
izomycotina)1 种;担子菌门(Basidiomycota)8 种，均为伞菌纲
(Agaricomycetes)的物种;除此以外，还有 1 种为接合菌门
(Zygomycota)的物种。与此同时，共有 26 种真菌鉴定到了目
的水平，分别为子囊菌门的柔膜菌目(Helotiales)、刺盾炱目
(Chaetothyriales)、Chaetosphaeriales、肉座菌目(Hypocreales)、
斑痣盘菌目(Ｒhytismatales)和树粉孢属(Oidiodendron);担子
菌门的伞菌目(Agaricales)、红菇目(Ｒussulales)、蜡壳耳目
(Sebacinales)、革菌目(Thelephorales)、Trechisporales 及接合
菌门的被孢霉目(Mortierellales)(图 1)。在目水平上，物种丰
富度最高的真菌类群为锤舌菌纲的柔膜菌目(11 种)(图 2)。
通过与 NCBI 数据库中的序列比对发现，有 11 个 OTUs
与来自草本或木本植物的根系真菌同源性达 97%以上(表
1)。其中 7 个 OTUs(OTU 8 － 11;OTU 17 － 18;OTU 22)属于
柔膜菌目，OTU 4 与 Chaetosphaeria sp． (AY781219)具有较高
的相似性，OTU 5 和 OTU 23 分别与 Cladophialophora sp．
(AB986333)、Ｒhytismataceae sp． (JQ272405)同源性高达
99%，而 OTU 20 与 Oidiodendron citrinum(NＲ_111033)同源性
达 95%，因此被鉴定为树粉孢属真菌。在这 11 个 OTU 中，9
个 OTUs都曾在杜鹃花科植物根系中检测到，1 个 OTU(OTU
5)在兰科植物 Cypripedium的根系中出现，另一个(OTU 9)则
在铁杉属根系中检测到。在这 9 个 OTU 中，除 OTU 20 和
OTU 11 仅在杜鹃花科植物根系中出现外，其余 OTU(OTU 4、
OTU 8、OTU 10、OTU 17、OTU 18、OTU 22、OTU 23)不仅在杜
鹃花科植物根系(Ｒhododendron、Eucalyptus、Woollsia、Enkian-
thus、Vaccinium、Pyrola、Epacris、Calluna)中检测到，还在少数
的兰科植物(Hoffmannseggella;Lecanorchis)和外生菌根根段
(Picea;Deschampsia;Lithocarpus;Pinus;Fagus)中检测到。
2． 3 根系真菌物种丰富度估计及物种累积曲线
用 Bootstrap算法估计的海南霸王岭毛棉杜鹃根系真菌
物种数 37 种，高于实际观察到的物种数(28 种)。随着根系
真菌的宿主植物个体数增加，物种丰富度不断增大，且从物种
累积曲线来看检测到的真菌物种数增加的潜力仍然较大，然
而 Shannon － Weiner多样性指数却趋于平缓(图 3)。
3 讨论与结论
本次从海南霸王岭毛棉杜鹃根系中共检测到 28 种真菌，
通过序列比对和真菌 ITS序列谱系树分析发现子囊菌门的真
菌种类丰富约占 68%(19 种)，其中又以柔膜菌目真菌占的
比例最大，共有 11 种，其中有 7 种与来自杜鹃花科植物或少
数其他草本或木本植物根系真菌同源性达97%以上。子囊
—334—江苏农业科学 2016 年第 44 卷第 6 期
表 1 毛棉杜鹃根系真菌的 ITS序列与 UNITE或 GenBank数据库中最接近的序列
分类
单元
鉴定命名
GenBank
序列号
Blast最接近比对 一致性
(bp) 宿主植物种类
1 Agaricales sp1 KU550104 Hemimycena sp． (HQ604775) 541 /624(87%) —
2 Agaricales sp2 KU550105 Mycena sp． (KP012834) 513 /582(88%) —
3 Agaricomycetes sp． KU550106 Cyptotrama asprata (DQ097355) 331 /389(85%) —
4 Chaetosphaeriaceae sp． KU550107 Chaetosphaeria sp． (AY781219) 419 /446(94) Hoffmannseggella caulescens;
Ｒ． lochiae;Eucalyptus;Woollsia;
5 Cladophialophora sp． KU550108 Cladophialophora sp． (AB986333) 546 /548(99%) Cypripedium acaule
6 Helotiaceae sp1 KU550109 Ｒhizoscyphus ericae (AB847029) 455 /494(92%) —
7 Helotiaceae sp2 KU550130 Hymenoscyphus ericae (AY394684) 458 /485(94%) —
8 Helotiales sp1 KU550131 Helotiales sp． (EU639688) 483 /490(99%) Ｒ． fortunei;Enkianthus campanulatus;
Vaccinium vitis—idaea;Pyrola;
Picea;Epacris microphylla;
9 Helotiales sp2 KU550110 Helotiales (KC019885) 466 /498(94%) Tsuga heterophylla;
10 Helotiales sp3 KU550111 Helotiales sp．(JX852326) 489 /505(97%) Picea abies;Ｒ． lochiae;Ｒ． maximum;
Calluna vulgaris;
11 Helotiales sp4 KU550112 Scytalidium sp． (HQ631037) 443 /483(92%) Epacris microphylla;
12 Herpotrichiellaceae sp1 KU550113 Herpotrichiellaceae sp．(AB847033) 471 /516(91%) —
13 Herpotrichiellaceae sp2 KU550114 Herpotrichiellaceae sp．(KF359595) 704 /737(96%) —
14 Hyaloscyphaceae sp1 KU550115 Lachnum virgineum(JQ272454) 454 /501(91%) —
15 Hyaloscyphaceae sp2 KU550116 Lachnum sp． (KJ529001) 445 /478(93%) —
16 Hypocreales sp． KU550117 Neonectria lugdunensis(FJ000394) 426 /495(86%) —
17 Lachnum sp1 KU550118 Lachnum sp． (KJ817288) 478 /487(98%) Deschampsia flexuosa;Vaccinium
uliginosum;Lithocarpus densiflorus;
Pyrola;Calluna vulgaris;
Enkianthus cernuus;
18 Lachnum sp2 KU550119 Lachnum sp．(FJ440910) 478 /484(99%) Pyrola;Carex;Erica glumiflora;
Ｒ． dauricum;Populus trichocarpa;
Epacris microphylla;Kobresia;
Ｒ． lochiae;Vaccinium vitis － idaea;
Ｒ． fortunei;Enkianthus perulatus;
19 Mortierella sp． KU550120 Mortierella biramosa(JX976094) 541 /563(96%) —
20 Oidiodendron sp． KU550121 Oidiodendron citrinu(NＲ_111033) 446 /470(95%) Enkianthus campanulatus;Ｒ． decorum;
Erica caffra;Epacris pulchella;
21 Pezizomycotina sp． KU550122 Pezizomycotina (JF519200) 756 /799(95%) —
22 Phialocephala fortinii KU550123 Phialocephala fortini (NＲ_103577) 504 /510(99%) Ｒ． decorum;Ｒ． maximum;Ｒ． fortunei;Calluna vulgaris;
Pyrola media;Pyrola asarifolia;
Picea abies;Lecanorchis japonica;
Vaccinium macrocarpon;Pinus;
23 Ｒhytismataceae sp． KU550124 Ｒhytismataceae sp．(JQ272405) 297 /299(99%) Ｒ． maximum;Fagus;
24 Ｒussula sp． KU550125 Ｒussula favrei (KC581298) 608 /643(95) —
25 Ｒussulaceae sp． KU550126 Ｒussula vesca (KM085395) 495 /525(94%) —
26 Sebacinaceae sp． KU550127 Sebacina sp．(AB831790) 543 /576(94%) —
27 Thelephoraceae sp． KU550128 Tomentella (GU553375) 565 /599(94%) —
28 Trechisporales sp． KU550129 Trechispora farinace(EU909231) 531 /619(86%) —
菌门柔膜菌目的真菌是一类多样且典型的杜鹃花菌根真菌，
国内外大多学者在对杜鹃花菌根真菌研究中也都发现了该类
真菌，在多种杜鹃花根系中都检测到［5，9 － 13，18，22，29］。在这 7 种
柔膜菌目真菌中，OTU 9 仅与来自 Tsuga heterophylla 的根系
真菌(FJ152534)同源性达 98%，OTU 11 仅与 Epacris micro-
phylla的根系真菌同源性达 98%［30］，其余 5 个 OTU都曾在多
种杜鹃花科植物根系及少数外生菌根根段中检测到。OTU 7
曾被报道与中国的 Ｒhododendron fortunei 和 Vaccinium vitis －
idaea(KJ817304)，日本的 Enkianthus campanulatus，美国的
Pyrola和澳大利亚的 Epacris microphylla等多种杜鹃花科植物
根系共生［13，30 － 32］，且曾在美国的 Picea根系中出现［33］，OTU10
则在澳大利亚的 Ｒhododendron lochiae，美国的 Ｒhododendron
maximum，德国的 Calluna vulgaris(FM172790)和瑞士的 Picea
abies 均有报道［5，9，34］。OTU 17 和 OTU 18 都为粒毛盘菌
(Lachnum)的物种，都与来自多种不同草本或木本植物的根
系真菌同源性达 97%以上。OTU 17 曾在杜鹃花科植物 Vac-
ciniumuliginosu(KJ817288)、Pyrola、Calluna vulgaris和 Enkian-
thus cernuus，禾本科植物Deschampsia flexuosa及壳斗科植物
—434— 江苏农业科学 2016 年第 44 卷第 6 期
Lithocarpus densiflorus的根系中出现［31 － 32，35 － 36］。OTU 18 则曾
在多种杜鹃花属植物 Ｒhododendron lochiae、Ｒhododendron for-
tunei、Ｒhododendron dauricum(KJ817276)和其他多种杜鹃花
科植物 Pyrola、Epacris microphylla、Erica glumiflora、Enkianthus
perulatus、Vaccinium vitis － idaea (AJ430215 )中 检 测
到［5，13，30 － 31，37］。OTU 22 与 Phialocephala fortinii(NＲ_103577)
同源性高达 99%，被鉴定为 Phialocephala fortinii。Phialoceph-
ala fortinii是北半球地区侵染植物根系的典型的暗色有隔内
生真菌(dark septate endophytes，DSE)复合体中常见的一种真
菌。关于这种内生真菌或菌根真菌的习性在以往的研究中争
议较大，有学者认为 Phialocephala fortinii 是菌根性的真
菌［38 － 39］，它曾在 Ｒhododendron decorum、Ｒhododendron maxi-
mum、Ｒhododendron fortunei、Calluna vulgaris、Pyrola media、Py-
rola asarifolia、Vaccinium macrocarpon 出现［9 － 10，13，40 － 42］。而周
诗涵等在台湾地区的红毛杜鹃根系中也检测到 Phialocepha-
la，菌根形态鉴定与 rDNA 序列分析，以及回接试验均证实
Phialocephala能与杜鹃花类植物形成杜鹃花菌根［23］。
除此之外，还有4个OTU(OTU4、OTU5、OTU20、OTU23)
—534—江苏农业科学 2016 年第 44 卷第 6 期
与 NCBI中不同植物的根系真菌同源性达 97%以上。OTU5
与美国的 Cypripedium acaule 的根系真菌同源性达 98%［43］。
OTU4 和 OTU23 不仅在杜鹃花科植物中检测到，还在其他植
物根系中也有出现。前者曾报道在 Hoffmannseggella caules-
cens、Ｒhododendron lochiae、Eucalyptus、Woollsia pungens 根系出
现［5，44 － 46］，后 者 则 在 Ｒhododendron maximum 和 Fagus
(FN619991)根系中检测到［9］。OTU20 与 Oidiodendron citri-
num(NＲ_111033)同源性达 95%，因此鉴定为树粉孢属真菌。
树粉孢属是常见的杜鹃花菌根真菌，特别是在北半球的杜鹃
花根系中是非常常见的，本研究中树粉孢属与日本的 Enkian-
thus campanulatus(99%)、中国四川及云南的 Ｒhododendron
decorum(98%)、南非的 Erica caffra(98%)及澳大利亚热带森
林的 Epacris pulchella 的根系共生真菌同源性高达 98% 或
99%［10，32，37，47］。然而，在本研究中并没有出现分布最广且在
杜鹃花类菌根真菌中研究最多的 Oidiodendron maius。从这些
同源性达 97%的根系真菌的宿主植物分析中推测杜鹃花类
菌根真菌类型在目的水平上总体相似，但不同的种之间可能
受到其寄主植物的影响。
担子菌门的真菌物种数在本研究中仅占 29%，为伞菌纲
中伞菌目、红菇目、蜡壳耳目、革菌目、Trechisporales。在早
期，蜡壳耳目的真菌被认为是腐生真菌，后续的研究表明
Sebacinales 真菌可以划分为 Clad A 与 Clad B 两大支系［48］。
Clad A被报道既能与兰科形成内生型菌根，又能与壳斗科、
松科植物形成外生菌根［49］，Clad B 与杜鹃花科植物，如杜鹃
花属、越橘属，帚石楠属等宿主共生。红菇目和革菌目是典型
的外生菌根真菌，在美国大烟雾山国家公园 Ｒhododendron
maximum及澳大利亚 Ｒhododendron hirsutum根系中也曾分离
到红菇［7 － 9］，中国云南的 Ｒhododendron decorum根系中曾有革
菌目的出现［10］。
群落物种丰富度的研究表明，受抽样样本大小的限制，在
一个地区观察到的物种往往只能代表当地物种库中的一部
分，然而，可以采用物种丰富度估计的方法来最大限度地估计
当地物种数。本研究用 Bootstrap 估计的杜鹃花根系真菌物
种数 37 种，高于实际观察到的物种数(28 种)。物种累积曲
线表明，随着杜鹃花宿主植物个体数增加，检测到的根系真菌
物种数增加的潜力仍然较大，因此，全面揭示杜鹃花菌根真菌
资源的多样性是杜鹃花菌肥开发利用的关键环节。
另外，本试验研究检测到的真菌有 93%的物种只能鉴定
到目，能鉴定到科、属、种水平的真菌仅占少数。主要是因为
NCBI等公共数据库中暂时缺少与这些真菌高同源性，并且已
知分类地位的代表性序列。随着 NCBI 数据库中分类信息准
确的真菌 DNA条形码序列累积，本研究检测到的真菌序列将
会获得更精细的分类信息。
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