全 文 ：DOI: 10.13344/j.microbiol.china.160546
凉山州龙肘山锈红杜鹃与薄叶马银花根部真菌分子检测
黄彩微 廖映辉 张琪 丁琼 ∗
(海南大学园艺园林学院 海南 海口 570100)


摘 要：【目的】为检验直接分子检测法用于揭示杜鹃花属(Rhododendron)植物 RAF 组成的有效性。【方
法】采用不依赖于培养的分子检测技术，直接从锈红杜鹃(R. bureavii)与薄叶马银花(R. leptothrium)的发根
(Hair root)提取 DNA、并用真菌特异性引物扩增 rDNA-ITS区、经克隆后测序，对获得的 ITS序列进行分析；
通过收集 NCBI 中与本研究的 RAF同源性 97%以上的所有序列对应的真菌来源(土壤或根系的身份)数据，
分析真菌的生态学特性，并用 FUNGuild软件提供的方法划分真菌的生态类型。【结果】从两种杜鹃花根部
共检测到 15种真菌，其中担子菌门(BASDIOMYCOTA)真菌 3种，子囊菌门(ASCOMYCOTA)的真菌 12种。
柔膜菌目(Helotiales)真菌在两种杜鹃花 RAF群落中占据优势，并且在两种杜鹃花根系中均检测到该类真菌。
此外，两种杜鹃花根部有多种生态类型的 RAF共存，包括曾被频繁报道的 ERM共生菌 Oidiodendron sp.和
Rhizoscyphus sp.、内生真菌 Phialocephala fortinii、共生型真菌 Pezoloma ericae、外生菌根共生菌Meliniomyces
sp.，以及腐生型真菌Myceana sp.、Lachnum_virgineum、Herpotrichia sp.及 Ascomycota sp.2。【结论】直接
分子检测法从两种杜鹃花属植物根部检测到的真菌谱系多样性较高、生态类型复杂，这一方法能较为全面
地反映杜鹃花属植物 RAF多样性。
关键字：内转录间隔(ITS)区，杜鹃花属，根系共生菌，序列分析，系统综述法
Molecular diagnosis of root-associated fungi of Rhododendron bureavii
and R. leptothrium in Longzhou mountain of Liangshan autonomous
prefecture
HAUNG Cai-Wei LIAO Ying-Hui ZHANG Qi QING Qiong*
(College of Horticulture and Landscape Architecture, Hainan University, Haikou, Hainan 570100, China)
Foundation item: Open Fund of Key Laboratory of Protection and Development Utilization of Tropical Crop Germplasm Resources
(Hainan University) (No. 2013kckled-12); Ministry of Education; Scientific Research Foundation for Scholars of Hainan University
(No. kydq1325)
∗Corresponding author: E-mail: dingqiong@hainu.edu.cn
Received: July 28, 2016; Accepted: November 15, 2016; Published online (www.cnki.net): December 05, 2016
基金项目：海南大学热带作物种质资源保护与开发利用教育部重点实验室开放课题(No. 2013kckled-12)；海南大学科研启动基
金项目(No. kydq1325)
*通讯作者：E-mail：dingqiong@hainu.edu.cn
收稿日期：2016-07-28；接受日期：2016-11-15；优先数字出版日期(www.cnki.net)：2016-12-05


网络出版时间：2016-12-05 15:53:18
网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1996.Q.20161205.1553.003.html
Abstract: [Objective] Plant root-associated fungi (RAF) are essential to the ecological processes involving organic
mass decomposition, nutrients cycling of ecosystem, and density-dependent regulation of plant populations.
Molecular and culture-dependent diagnosis is commonly used to study RAF community. To evaluate the effect of
culture-independent molecular technique on depicting the species composition of Rhododendron RAF communities,
[Methods] DNA was extracted from hair roots of R. bureavii and R. leptothrium, and then fungal ITS region was
amplified using fungus-specific primers ITS1f and ITS4. ITS-PCR products were cloned, sequenced, and analyzed.
Putative trophic mode and guild of RAF were assigned by linking sequences with metadata obtained from a
systematic review of published works on RAF ecology from multiple independent studies, and by functional
analysis provided by FUNGuild software. [Results] A total of 15 fungal species were identified from hair roots of
both Rhododendron species. Of these fungi, 3 species are BASDIOMYCOTA and 12 species are ASCOMYCOTA.
The dominant fungal group Helotiales sp. was detected in RAF community of both Rhododendron species. Fungal
taxa on the two Rhododendron plant root can be assigned to multiple trophic modes and guilds including known
ericoid mycorrhizal symbionts Rhizoscyphus sp. and Oidiodendron sp., as well as repeatedly documented
endophyte Phialocephala fortinii, symbiotic fungi Pezoloma ericae, ectomycorrhizal Meliniomyces sp. In addition,
saprotrophs Myceana sp., Lachnum virgineum, Herpotrichia sp., and Ascomycota sp2 were also common in the
RAF community of the two Rhododendron. These finding suggests the phylogenetical distant and multiple trophic
modes and guilds of fungi co-existing on the Rhododendron root. [Conclusion] Culture independent molecular
diagnosis used here is fast and reliable for fully revealing the Rhododendron plant RAF diversity.
Keywords: Internal transcribed spacer (ITS) region, Rhododendron, root-associated fungi (RAF), sequence
analysis, systematic review
在自然生境中，植物根系与多样性的土壤真菌互作，这些真菌被称为根部真菌(Root-associated fungi,
RAF)[1]。RAF不仅能直接或间接地影响植物的生长与适应性，还能参与生态系统的有机质分解、养分循环，
以及植物群落的密度制约等过程[2-3]。早期有关植物 RAF多样性与功能的认识主要采用居于纯培养的方法鉴
定真菌获得[4-5]，然而，由于大多数 RAF难以在人工培养基上生长，这种方法检测到的真菌谱系与生态类型
相对较为单一。直接从环境样品如根系、土壤提取 DNA，并扩增真菌 DNA 条形码片断的技术，被广泛地
应用于真菌群落生态学研究[6-7]。采用这一分子检测技术，近期的研究发现根系与真菌关系的复杂性超出预
料：仅从单株植物根系就能检测到多种真菌[8]；同一种植物的 RAF 不仅谱系多样性极高，而且涉及多种生
态类型的真菌[2,9]，如温带与北极地区多支系的内生真菌(Endophytic fungi)与菌根真菌(Mycorrhizal fungi)同时
侵染植物根系[10]。公共数据库中核酸数据随分子检测技术发展而快速累积，如何解析基于海量核酸序列而
鉴定的真菌分类单元的生态学特性与功能，是近期真菌群落生态学研究中的热点问题之一[11]。将居于真菌
的核酸序列的分类信息与其对应的环境因子，或标本、纯培养菌株、宿主表型等数据(Metadata)进行关联分
析，成为解析环境样品中真菌生态学特性的有效手段，如 Nguyen 等(2016)开发的 FUNGuild 软件，将基于
核酸序列的分类信息与对应真菌的 Metadata 相关联，用以推断真菌生态学特性[12-13]。如将这一方法应用于
划分 RAF的生态型，将有助于揭示 RAF群落功能多样性，以及不同层次，如群落(Community)、共位群(Guild)
的真菌-宿主互作关系。
杜鹃花科(Ericaceae)植物主要分布在高海拔、冷凉、土壤养分贫瘠的山区。RAF可以缓解杜鹃花科植物
的营养协迫，增强其环境适应性[14]，进而为其在多物种混合的植物群落中带来竞争优势[15-16]。杜鹃花科植
物RAF的有关研究主要集中在欧洲与北美洲地区的帚石楠属 (Calluna)、欧石楠属 (Erica)以及越橘属
(Vaccinium)植物。杜鹃花属(Rhododendron)是杜鹃花科中物种最丰富的属，当前对杜鹃花属植物的RAF生态
学研究主要采用传统的依赖于纯培养的真菌检测技术，并且通常集中于生态功能相似的真菌类群，如菌根
真菌或内生真菌。至今尚不清楚杜鹃花属植物RAF是否也包括较高的谱系多样性、多种生态类型的真菌。
本研究以我国凉山州的锈红杜鹃(R. bureavii)与薄叶马银花(R. leptothrium)为材料，采用直接的分子检测法鉴
定两种杜鹃花的RAF物种组成；采用系统综述(Systematic review)法[17]，从多个独立的研究中收集对应的
metadata，用以分析真菌的生态类型，同时采用FUNGuild软件划分真菌的生态类型，进而评估不依赖于培养
的分子检测技术是否能全面反映杜鹃花属植物RAF的谱系与功能多样性，为今后全面开展杜鹃花属植物RAF
群落生态学研究提供技术支持。
1 材料与方法
1.1 样品采集地
采样地为我国四川省会理县龙肘山(26º30′−27º30′N，102º06′−102º4′E)，海拔 3 580 m，位于四川西南部
横断山脉南段，西边邻接金沙江河谷，南边为云贵高原，是几个自然地理区的交界处；此区域还处于中国
－日本植物区系与中国－喜马拉雅植物区系的交界线附近，是世界杜鹃花最大的分布中心。山体基本为南
北走向，属中亚热带西部半湿润气候区，光热条件丰富，日照时数多(年均日照达 1 700多小时，无霜期达
300 d左右)，蒸发旺盛；雨量集中，干湿季分明(每年的 6−10月的降雨量可达全年降雨量的 90%左右)。因
山体垂直落差大(最大的垂直高差达 2 000 m以上)，其气候的垂直变化也很大，山顶气候较为寒冷、冬季常
有积雪，年平均气温在 7 °C左右[18]。
1.2 样品采集
在杜鹃花群落中，选取薄叶马银花与锈红杜鹃的成年植株各 1 株，去除地表的枯枝落叶，沿植株的主
干追踪到末端发根(Hair root)较多的侧根。因为真菌侵染植物根系可能存在空间自相关性，从以主杆为中心
点的 8 个不同的方向追踪发根较多的侧根，以最大限度抽检到多样性的 RAF。将侧根剪下后抖掉表面附着
的土壤，分别置于装有 75%酒精的 200 mL离心管常温保存，带回实验室后置于−80 °C中保存，直到提取根
系 DNA。每种杜鹃花采集 8份根系样品，两种杜鹃花共采集到 16份样品。
1.3 主要试剂和仪器
Taq DNA聚合酶、DNA纯化试剂盒、E. coli DH5α感受态细胞和 pMD19-T载体，均购自宝生物工程(大
连)有限公司。高通量多样品组织研磨仪，南京先欧仪器制造有限公司；PCR扩增仪，力康生物医疗科技控
股有限公司；电泳仪，北京君意东方电泳设备有限公司；紫外凝胶成像系统，北京五洲东方科技发展有限
公司。
1.4 真菌分子检测
1.4.1 DNA提取：将保存的侧根从离心管中取出后，用流水洗净表面附着的泥土，用无菌水清洗两遍。为
最大限度抽检到多样性的 RAF，从每份侧根样品的不同方位剪下 20段长度约 1 cm的发根，再用无菌水清
洗两遍，放灭菌的滤纸上吸干多余的水分，转移到 1.5 mL离心管后，分别加入 50 μL CTAB提取缓冲液，
放置于−80 °C冷冻 2 h后取出，在粉碎仪上研磨。毛根 DNA提取中，水浴、抽提、漂洗等环节参照孙立夫
等人方法[19]。
1.4.2 ITS 扩 增 ： 采 用 PCR 法 扩 增 真 菌 的 内 转 录 间 隔 区 ， 扩 增 引 物 为 TIS1F
(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和 ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。每 25 μL PCR反应
体系分别含有：1 μL模板 DNA，1 μL (2.5 mmol/L) dNTPs，2.5 μL 10×PCR缓冲液(TaKaRa，Otsu，Japan)，
ITS1F与 ITS4引物各 1 μL (10 μmol/L)，1.5 U Taq DNA聚合酶(Takara，Otsu，Japan)。PCR反应程序：首
先 95 °C 5 min，94 °C 40 s，55 °C 40 s，72 °C 55 s，30个循环；72 °C 10 min。将 ITS-PCR产物在 0.8%的
琼脂糖凝胶上电泳，用凝胶成像仪观察、拍照。
1.4.3 PCR 产物克隆及测序：将每种杜鹃花的 8份 PCR产物混合后电泳、切胶回收。将回收的 PCR产物
作为外源 DNA，克隆到 pMD19-T Vector (Takara，Otsu，Japan)，在 16 °C下连接过夜，用 E. coli DH5α感
受态细胞(Takara，Otsu，Japan)进行转化。从每个真菌克隆文库中随机挑选 48个呈白斑的克隆，用引物 ITS1F
和 ITS4扩增；PCR产物在 0.8%的琼脂糖凝胶上电泳检测。电泳检测呈阳性 PCR产物委托上海生物工程有
限公司进行测序。
1.5 数据分析
在 BioEdit软件中对真菌的 ITS1-5.8S-ITS2全序列进行编辑和比对。ITS序列一致性(Identity)≥97%的真
菌被视为同一个分类单元(Operational Taxonomical Unit，OTU)[20]。在 NCBI数据库中检索与 OTUs代表序
列亲缘关系最近的真菌序列，并采用MEGA 5构建 NJ系统发育树(Neighbor-Joining Tree)，结合真菌在系统
树上的地位最终推断真菌的分类地位。本研究中检测到的真菌 ITS 序列已提交 GenBank，序列号为
KX609407−KX609421。
为了验证直接分子检测法用于杜鹃花科植物RAF研究的有效性，本研究采用系统综述(Systematic review)
的方法，从多个独立的研究结果出发，全面归纳、总结这些真菌的生态特性。具体而言，首先在 NCBI数据
库中检索截止至 2016年 10月 10日以前提交的、与本研究检测到的真菌 OTUs代表序列同源性高达 97%以
上的真菌，然后，从 NCBI数据库和Web of Science文献中查询对应真菌的来源，如宿主身份或土壤等信息
的Metadata，以推测真菌的的生态类型。来自于同一研究、相同宿主或土壤的相同 OTUs序列不重复计算。
与此同时，采用居于核酸与Metadata数据关联分析的 FUNGuild软件，将两种杜鹃的 RAF划到不同的营养
型 (Trophic mode)和共位群 (Guild)。营养型包括：共生型 (Symbiotroph)、腐生 -共生过渡型
(Saprotroph-Symbiotroph)、腐生型(Saprotroph)，以及致病型(Pathotroph)；共位群包括：杜鹃花菌根真菌、外
生菌根真菌、丛枝菌根真菌、兰科植物菌根真菌、内生真菌(真菌的菌丝体只局限在植物组织内部，并且被
侵染的植物不表现明显病症)、病原真菌、腐生真菌[12-13]。
用软件 Estimate S 9中提供的 Bootstrap方法估计宿主植物 RAF物种丰富度，并用物种累积曲线评估本
研究检测的克隆数是否足以全面地反映两种杜鹃花 RAF克隆文库中的物种。
2 结果与分析
2.1 两种杜鹃花根系真菌谱系分析
从锈红杜鹃与薄叶马银花 RAF的 ITS序列克隆文库中共检测了 96个克隆，真菌序列被划分为 15个分
类单元(OTUs)，其中 8个 OTUs来自于薄叶马银花根系，7个 OTUs来自于锈红杜鹃根系。基于真菌 ITS序
列构建的 NJ 系统发育树表明， 15 个 OTUs 分别聚为子囊菌门 (ASCOMYCOTA)及担子菌门
(BASDIOMYCOTA)两大支系(图 1)。其中子囊菌门有 12个 OTUs，担子菌门有 3个 OTUs。11个 OTUs与
NCBI数据库参考序列一致性≥97% (表 1)。在子囊菌门中，OTU01与 Ascomycota sp. (JQ272357)的同源性达
93%，并且两种真菌在系统发育树上聚为同类的支持率(Bootstrap值)达 100%，虽然该真菌为未知的子囊菌，
但在系统发育树上与已命名的柔膜菌目类真菌聚为同一支系，由此推断该真菌可能是柔膜菌目真菌。同时
OTU03与 Ascomycota sp. (GU559096)有高达 99%的同源性，两者在谱系聚类中有 100%的支持率，由于其
在谱系树中与锤舌菌纲支系聚集，推断该真菌可能为锤舌菌纲真菌。OTU08 与 OTU13 分别与锤舌菌纲的
Meliniomyces sp. (HM230868)及 Rhizoscyphus ericae (JQ272407)有 99%、95%的一致性，两种真菌分别与参考
序列聚集在系统发育树上支持率达100%；在担子菌门中，OTU14、OTU15分别与Sebacinales sp. (HQ850092)、
Sebacinales sp. (HQ850117)同源性达 95%、98%，并且在系统发育树上聚为同一支系的支持率高达 100%，
由此鉴定 OTU14及 OTU15为亲缘关系较近的两种蜡壳耳目真菌。在 15种 RAF中，80%真菌能鉴定到目及
以下水平，其中 3种真菌能鉴定到种，5种能到属水平，1种能到科水平，3种到目水平，还分别有 3种仅
鉴定到门水平(图 1、表 1)。


























:







图 1 基于 ITS序列构建的两种杜鹃花 RAF的 NJ系统发育树
Figure 1 NJ phylogenetic tree based on rDNA ITS sequences of fungi associated with hair roots of R. bureavii and R.
leptothrium
注：Glomeromycota sp. (JX276894)表示外群；0.05指每单位核苷酸的变化；节点处的数值指 Bootstrap值，仅显示高于 85%的 Bootstrap
值；括号中的序号表示序列号；加粗实线：担子菌门，不加粗实线：均为子囊菌门.
Note: Glomeromycota sp. fungus is used as out group; 0.05 substitutions/site; Numbers at the nodes are bootstrap values which are more than
85%; The number in brackets is the sequence number; Bold solid lines: BASDIOMYCOTA, light solid lines: ASCOMYCOTA.
Rhizoscyphus sp. (GU256945)
Rhizoscyphus ericae (JQ272407)
OTU13 (KX609415)
OTU08 (KX609416)
Meliniomyces sp. (HM230868)
Helotiales sp. (FJ827178)
OTU04 (KX609412)
OTU11 (KX609410)
Pezoloma ericae (JQ711893)
Phialocephala fortinii (JQ272457)
OTU12 (KX609419)
Phialocephala fortinii (LC130996)
OTU01 (KX609407)
Ascomycota sp. (JQ272357)
Hyaloscyphaceae sp. (GU393951)
OTU06 (KX609413)
OTU07 (KX609414)
Lachnum virgineum (KJ188694)
99
OTU03 (KX609411)
Ascomycota sp. (GU559096)
Oidiodendron sp. (AB846984)
OTU10 (KX609418)
Oidiodendron sp. (GU256948)
OTU02 (KX609408)
Talaromyces sp. (LC016747)
Talaromyces muroii (NR 103672)
OTU05 (KX609409)
Herpotrichia sp. (JQ347004)
OTU09 (KX609417)
Mycena sp. (JQ346836)
OTU14 (KX609420)
Sebacinales sp. Group B (HQ850092)
OTU15 (KX609421)
Sebacinales sp. Group B (HQ850117)
Glomeromycota sp. (JX276894)
98
100
100
100
100
100
100
91
100
100
100
100
100
100
91
100
100
98
100
0.05
表 1 根部真菌的 ITS序列分析、真菌的生态型和宿主来源
Table 1 ITS Sequence identity, ecological type and host plant species of root-associated fungi
分类单
元
OTU
鉴定名
Name
Blast最接近比对
Closest BLAST match
一致性
Identity (%)
真菌生态学特性
Ecological charcteristic of fungi
宿主来源
Host plant
营养型
Trophic
Mode
共位群
Guild
可靠度
Confidence
Ranking
OTU01 Ascomycota sp.1
Ascomycota sp.
(JQ272357)
484/519(93%) — — — —
OTU02 Ascomycota sp.2
Talaromyces sp.
(LC016747)
173/188(92%) Saprotroph Undefined Saprotroph Probable —
OTU03 Ascomycota sp.3
Ascomycota_sp.
(GU559096 )
498/503(99%) — — — Pinus sylvestris1(ECM); Soil2
OTU04 Helotiales sp.
Helotiales sp.
(FJ827178)
550/553(99%) — — —
Carex sp.3(AM).; Picea abies4(ECM); Potentilla sp.3(AM);
Pseudotsuga menziesii5(ECM); Soil*
OTU05 Herpotrichia sp.
Herpotrichia sp..
(JQ347004)
478/482(99%) Saprotroph Undefined Saprotroph Probable
Calamagrostis purpurea6(AM); Calluna vulgaris*(ERM); Carex
bigelowii*(AM); Cedrs libani7(AM); Colobanthus quitensis8(AM);
Dryas octopetala9(AM); Equisetum arvense10(AM); Festuca
paniculata*(AM); Juniperus sp.11(AM); Lycopodium sp.12(AM);
Microthlaspi perfoliatum13(AM); Picea abies4,14,*(ECM); Pinus
arizonica15(ECM); P. monticola16,17(ECM); P. mugo11(ECM); P.
nigra*(ECM); P. sylvestris*(ECM); Polygonum sp.3(AM);
Rhododendron ferrugineum*(ERM); Salix arctica18(ECM); Salix
sp.19(ECM); Sanionia uncinata20(ECM); Soil21,22,23,24,25,26,*,*,*
续表
OTU06 Hyaloscyphaceae sp.
Hyaloscyphaceae sp.
(GU393951)
491/510(96%) — — — —
OTU07 Lachnum_virgineum
Lachnum_virgineum
(KJ188694 )
500/508(98%) Saprotroph Undefined Saprotroph Probable
Betula ermanii*(ECM); Carex sp.3(AM); Decalepis arayalpathra*(AM);
Deschampsia flexuosa27,28,29(AM); Dryas octopetala9(AM); Enkianthus
cernuus30(ERM); Epacris microphylla31(ERM); Erica caffra*(ERM); E.
glumiflora*(ERM); E. nemorosa*(ERM); Fagus sylvatica32(ECM);
Festuca paniculata*(AM); Kobresia sp.33(AM); Ledum palustre*(ERM);
Lithocarpus densiflorus34(ECM); Nyssa sylvatica*(AM); Pinus
pinaster*(ECM); P. sylvestris35(ECM); Poaceae sp.36(AM); Polygonum
sp.3(AM); Populus trichocarpa*(ECM); Potentilla sp.3(AM);
Pseudorchis albida37(ERM); Pyrola sp.38(ERM); Rhododendron
dauricum*(ERM); R. lochiae39(ERM); R. moulmainense40(ERM);
Rhododendron sp.41(ERM); Trientalis europaea29(AM); V.
membranaceum42(ERM); Vaccinium spp.43,*(ERM); Soil2,21,44
OTU08 Meliniomyces_sp.
Meliniomyces_sp.
(HM230868 )
504/506(99%)
Saprotroph-S
ymbiotroph
Ectomycorrhizal-
Saprotroph
Probable Gaultheria erecta*(ERM); Rhododendron decorum45(ERM)
OTU09 Mycena sp.
Mycena sp.
(JQ346836)
640/646(99%) Saprotroph Undefined Saprotroph Probable
Fagus sylvatica*(ECM); Gastrodia confusa46(ORM); G. elata*(ORM);
G. nipponica47(ORM); G. pubilabiata47(ORM); Lithocarpus
densiflorus34(ECM); Picea abies*(ECM); Pinus taeda*(ECM);
Polygonum sp.3(AM); Quercus rubra*(ECM); Taxus chinensis48(AM);
Wullschlaegelia aphylla*(ORM); Soil49,50,51,*,*,*
OTU10 Oidiodendron sp.
Oidiodendron
sp.(GU256948)
510/512(99%)
Pathotroph-S
ymbiotroph
Ericoid Mycorrhizal Probable
Abies alba*(ECM); Andromeda polifolia52(ERM); Calluna
vulgaris*(ERM); Cypripedium acaule*(ORM); Enkianthus
campanulatus30(ERM); Fagus sylvatica*(ECM); Halimium
ocymoides53(AM); Phyllodoce aleutica*(ERM); Pinus
massoniana*(ECM); P. pinaster*(ECM); P. sylvestris*(ECM);
续表
OTU10 Oidiodendron sp.
Oidiodendron sp.
(GU256948)
510/512(99%)
Pathotroph-
Symbiotroph
Ericoid Mycorrhizal Probable
P. taeda*(ECM); Populus deltoids* (ECM); Quercus petraea54(ECM); Q.
robur55(ECM); R. argyrophyllum56(ERM);R. fortunei57(ERM);R.
lochiae39(ERM); R. maximum58(ERM); R. obtusum59(ERM);
Rhododendron spp.41,57,60(ERM); Schizocodon soldanelloides61(AM);
Tsuga sp.62(AM); V. corymbosum63(ERM); V. membranaceum42(ERM);
V. oldhamii64(ERM); Vaccinium spp.65,*(ERM); Soil2,66,*,*,*
OTU11 Pezoloma ericae
Pezoloma ericae
(JQ711893 )
519/532(98%)
Pathotroph-Sy
mbiotroph
Biotroph-Undefined
Saprotroph
Probable
Abies balsamifera67,68,(ECM); Betula papyrifera67,68(ECM); Calluna
vulgaris69,70(ERM); Dipterocarpus alatus*(AM); Phyllodoce
aleutica*(ERM); Picea abies71,72(ECM); P. glauca68(ECM);
Pinus73(ECM); P. sylvestris35,72(ECM); Polygonum sp.3(AM); Potentilla
sp.3(AM); R. maximum58(ERM); Rhododendron sp.41(ERM); Tsuga
heterophylla*(ECM); V. macrocarpon69(ERM); Vaccinium sp.43(ERM);;
Soil24,26,49,74,*
OTU12
Phialocephala
fortinii
Phialocephala fortinii
(LC130996)
491/494(99%)
Pathotroph
-Symbiotroph
Undefined
Endophyte
Highly
Probable
Abies alba*(ECM); Calluna vulgaris69(ERM); Chloraea-gavilu*(ORM);
Cypripedium acaule*(ORM); Epacris microphylla31(ERM); Fagus
sylvatica*(ECM); Lithocarpus densiflorus34(ECM); Phyllodoce
aleutica*(ERM); Picea abies71,75,76,77,78 (ECM); Picea mariana79 (ECM); P.
contorta80,81(ECM); P. pinaster*,*,*(ECM); Pinus73(ECM);
P. sylvestris35,82,83,84,*,*(ECM); Polygonum sp.3 (AM); Populus sp.*(ECM);
Potentilla sp.3(AM); Pseudotsuga menziesii85(ECM); Pyrola
asarifolia*(ERM); P. media*(ERM); Quercus petraea86(ECM); R.
fortune57( ERM ); Rhododendron sp.41( ERM ); Salix arctica87(ECM); S.
helvetica*(ECM); Tsuga sp.*(ECM); V. macrocarpon69(ERM);
Vaccinium sp.43(ERM);V. vitis-idaea*(ERM); Soil2,24,26,50,*,*
续表
Note: Bold fonts indicate the plants of Ericaceae; * unpublished research; 1−88 published research. 1. Lindahl et al, 2010. International Society for Microbial Ecology, 4(7): 872-881; 2. Taylor
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OTU13 Rhizoscyphus sp.
Rhizoscyphus ericae
(JQ272407)
452/476(95%)
Pathotroph-
Symbiotroph
Ericoid Mycorrhizal
Highly
Probable
Rhododendron argyrophyllum56(ERM)
OTU14 Sebacinales sp.1
Sebacinales sp.
( HQ850092)
584/624(95%) — — — —
OTU15 Sebacinales sp.2
Sebacinales sp.
( HQ850117)
620/627(98%) — — — Rhododendron decorum45(ERM); R. neriiflorum88(ERM)
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New Phytologist, 174(4): 864-878. 28
29
2.2 两种杜鹃花 RAF类群组成
锈红杜鹃与薄叶马银花根系检测的 15种真菌可以划分到子囊菌门及担子菌门，涉及 3个纲 6个目。
其中，在子囊菌门的 12种真菌中，锤舌菌纲(Leotiomycetes)的柔膜菌目(Helotiales) 5种，锤舌菌目(Leotiales)
1 种，树粉孢属(Oidiodendron) 1 种，(Meliniomyces) 1 种；座囊菌纲(Dothideomycetes)的格孢菌目
(Pleosporales) 1种，还有 3种是未知的子囊菌门真菌；3种担子菌门真菌均来自于伞菌纲(Agaricomycetes)，
包括蜡壳耳目(Sebacinales) 2种，伞菌目(Agaricales) 1种。其中，在纲水平上，锤舌菌纲为最大类群，占
53%，其次为伞菌纲，占 20%，座囊菌纲的真菌占 7%。在目水平上，柔膜菌目是两种杜鹃花 RAF物种
的优势类群，所占比例最高(33%)，其次是蜡壳耳目(13%)，伞菌目、格孢菌目、树粉孢属以及Meliniomyces
各占 7% (图 2)。

图 2 锈红杜鹃与薄叶马银花根部真菌类群组成
Figure 2 Compositional structure of root-associated fungal community of R. bureavii and R. leptothrium
注：图中内圈为纲，外圈为目.
Note: The inner circle in figure is grouped by class and the outer circle is grouped by order.
2.3 两种杜鹃花 RAF生态学特性
通过核酸序列检索，本研究检测到的 15 种 RAF 中，有 11 种真菌在 NCBI 中能检索到同源性高达
97%以上的真菌序列，这样的序列共 233条，来自于 154个独立的研究。共有 6种真菌在 NCBI中的同
源序列较多，介于 18至 48条之间，来源于根系和土壤，根系涉及的植物类型有：杜鹃花菌根(ERM)植
物、外生菌根(ECM)植物、丛枝菌根(AM)植物、兰花菌根(ORM)植物。OTU10 Oidiodendron sp.的真菌序
列中，杜鹃花宿主植物比例最高达 48.6%，其次是 ECM植物(28.6%)，此外尚有 5.7%、2.9%、及 14.3%
的真菌序列分别来自于 AM植物、ORM植物、及土壤(图 3 A)；OTU07 Lachnum virgineum主要来自于
ERM植物(37%)，其次是 AM植物(35.1%)和 ECM植物(16.2%)，还有 2.7%和 8.1%的序列分别来自 ORM
植物和土壤(图 3B)；OTU11 Pezoloma ericae的宿主报道最多的是 ECM植物(46.4%)和 ERM植物(25%)，
AM植物和土壤来源分别占 10.7%和 17.9% (图 3C)；OTU12 Phialocephala fortinii的宿主以 ECM植物为
主，ERM也高达 20.8%，AM植物与 ORM植物分别占 6.2%和 4.2%，还有 12.5%源自土壤(图 3D)；OTU05
Herpotrichia sp.主要源自 AM植物(34.3%)、ECM植物(34.3%)以及土壤(25.7%)，ERM植物只占 5.7% (图
3E)；OTU09 Mycena sp.在 ERM植物中没有报道过，在 AM植物、ECM植物、ORM植物及土壤的报道
分别占 11.1%，27.8%，27.8%，33% (图 3F)。

图 3 NCBI中与锈红杜鹃、薄叶马银花根部真菌 ITS序列高同源性(97%)的真菌来源
Figure 3 The sources of fungi which displayed more than 97% sequences identity with target fungi associated with root of
Rhododendron bureavii and R. leptothrium



图 4 两种杜鹃花根部真菌群落中不同营养型、共位群真菌物种数百分比与序列数百分比
Figure 4 Percentage of species and sequences in different trophic mode and guild of fungi associated with the two
Rhododendron
注：A不同营养型真菌物种数百分比；B不同营养型真菌序列数百分比；C不同共位群真菌物种数百分比；D不同共位群真菌序
列数百分比.
Note: A percentage number of species grouped by trophic mode; B percentage number of sequences grouped by trophic mode; C
percentage number of species grouped by guild; D percentage number of sequences grouped by guild.

FUNGuild软件分析结果表明，从两种杜鹃花根部真菌群落检测到的 15种真菌中，有 5种被认为有
较高或很高的可能性是共生型真菌，有 4种被认为有可能或较高可能为腐生真菌。在 5种共生型真菌中，
有两种真菌(OTU10和 OTU13)为高度确定的杜鹃花菌根真菌，还一种(OTU12)是极为确定的内生真菌，
OTU08 极可能为菌根型真菌(表 1)。从检测到的真菌序列数来看，共生型的真菌序列数占 24%；腐生型
真菌序列数占 15%；营养型不确定的真菌序列数占 61%。被确定为杜鹃花科菌根真菌的序列数占 4%；
暗色有隔菌(OTU12)是极为确定的内生真菌，其序列多达 11% (图 4)。
2.4 真菌克隆的物种累积曲线
锈红杜鹃与薄叶马银花根部检测的真菌分别为 7 种和 8 种，用 Bootstrap 法估计的物种数分别达 8
种和 9种。物种累积曲线(图 5)显示，随着检测的真菌克隆数增加，被检测到的真菌物种数增加。然而，
当检测的真菌 ITS序列克隆数达到 30个以上，真菌物种数增加的趋势变平缓。可见，对于锈红杜鹃以及
薄叶马银花的 RAF的克隆文库，本研究检测 48个真菌克隆，已能够较全面地反映各自的 RAF的物种组
成。

图 5 基于克隆数的根系真菌物种累积曲线
Figure 5 Accumulation curves of fungal species based on the number of clones of root-associated fungi of
Rhododendron bureavii and R. leptothrium
3 讨论
近期，采用不依赖于培养的分子检测技术发现植物根系与真菌关系的复杂性超出预料，同一种植物的
RAF不仅谱系多样性极高，而且涉及多种生态类型的真菌[2,9-10,21]。本研究采用不依赖于培养的直接分子检
测技术在两种杜鹃花属植物根部检测到15种真菌，这些真菌的谱系多样性较高，既有子囊菌门真菌(12种)，
也有担子菌门真菌(3种)；此外，检测到的真菌的生态类型较为丰富，包括曾被频繁报道的ERM共生菌
Oidiodendron sp.和Rhizoscyphus sp.、内生真菌Phialocephala fortinii、外生菌根共生菌Meliniomyces sp.，腐
生型真菌Myceana sp.、Lachnum_virgineum、Herpotrichia sp.及Ascomycota sp。其中，Oidiodendron sp.与
Rhizoscyphus sp.，占本研究的RAF克隆文库总序列比例达4%，这两种真菌在以往的研究中通过纯培养及回
接实验证实是典型的杜鹃花类菌根真菌[22]，并且在澳大利亚的杜鹃花属(Rhododendron)[23]，以及加拿大的
越橘属(Vaccinium)[24]等植物根系中均分离培养到这两类真菌；本研究检测到的共生型真菌P. fortinii
(OTU12)，占RAF克隆文库总序列11%。该真菌又被称为暗色有隔真菌(Dark septate endophytes，DSE)，是
一种典型的内生真菌，在杜鹃花科不同属，如越桔(Vaccinium)[25]、鹿蹄属(Pyrola)[20]、以及未发表的帚石
楠属(Calluna)、杜鹃(Rhododendron)等植物根系中均有报道，并且有回接实验证实P. fortinii与杜鹃花根系共
生[26]，此外，这种真菌在未发表的兰科植物Chloraea-gavilu以及外生菌根宿主植物Norway spruce中有报道
等)[27]。担子菌门的蜡壳耳目真菌Sebacinales spp. (OTU14，OTU15)是两杜鹃花RAF群落的优势种之一，该
类真菌在欧洲的火红杜鹃(R. neriiflorum)[28]、我国的大白杜鹃(R. decorum)[19]、银叶杜鹃(R. argyrophyllum)[29]
的根系中检测到这些真菌，这类真菌也常被报道与外生菌根植物共生。被划为腐生型的4种真菌中，Mycena
sp.(OTU09)在多种兰科植物[30-31]、松科植物[27]中均有报道，该真菌在我国海南尖峰岭地区的海南杜鹃与毛
绵杜鹃根部也检测到[32]。有稳定性同位素研究证实，Mycena可以成为兰科植物的菌根共生伙伴[30]。上述研
究表明，RFA群落物种丰富、生态类型多样。由于只有少数RAF能培养，并且采用传统纯培养法的研究只
关注一类真菌，如内生真菌或菌根真菌[33-34]，从而不能相对完整地揭示RAF组成。未来的杜鹃花RAF研究
有必要采用直接的分子检测技术，无偏好地检测所有RAF，以期全面揭示地下植物与真菌互作的多样性与
复杂性。
随着公共数据库中核酸序列数据的累积，微生物学家正致力于推动居于核酸序列的分类单元与相应的
metadata直接关联，进而能从生态学的角度系统地解析环境微生物分类单元的生态功能[11]。例如，Nguyen
等(2016)将真菌的分类信息直接与环境因子、培养物、宿主表型等信息的metadata关联，进而将海量的核酸
序列划分成有生态学意义的真菌组群，如营养型、共位群[12]。本研究采用这一方法划分两种杜鹃花RAF的
生态型，得到与systematic review法分析的相似结果。未来的杜鹃花RFA研究中，如应用这一方法划分RAF
的生态型，将有助于推动RAF群落生态学研究从多样性扩展到功能特性解析，以及揭示不同层次(群落、功
能群)的真菌-宿主互作关系。值得注意的是，杜鹃花科植物根部的某些真菌-宿主互作关系严格上来讲可能
非菌根共生关系，但是这些RAF可能通过促进有机质分解并释放养分为植物带来间接的利益。如Wurzburger
等(2012)在杜鹃花的ERM子囊菌中观察到一些MCO基因序列，这些基因与漆酶相关，这类氧化酶可能有助
于ERM真菌从有机质丰富的土壤中获得养分[35]。采用直接的分子检测技术，全面开展我国杜鹃花RAF多样
性研究，必将有助于揭示与RAF有关的生态系统功能及多样性维持机制。
参 考 文 献
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