全 文 ：针杂质，冷冻干燥工艺不产生该杂质，样品降解
后也不易产生该杂质，其原因亦与水分活度有
关。以加速稳定性实验过程中 LB 厂和 HY 厂产
品中的开环二聚体含量分别对各自的水分活度
作图，结果见图 7。
由图 7 可见，总趋势为样品中的开环二聚体含
量随着样品水分活度的增加而增加。由此可以对开
环二聚体杂质容易出现在溶媒结晶工艺产品中给出
合理的解释。这是因为，从闭环二聚体到开环二聚
体是一个水解反应，溶媒结晶的产品具有较高的自
由水含量，易发生水解反应，水分活度越大，水解反
图 7 两种溶媒结晶工艺的氨苄西林钠产品的开环二聚体
含量与水分活度的关系
a － HY厂;b － LB厂
Fig. 7 Relationship between the content of ampicillin-dimer
(open)-disodium and water activity of ampicillin sodium sam-
ples produced by two solvent crystallization processes
a － HY;b － LB
应越快，产生的开环二聚体越多。而冷冻干燥的产
品水分活度低，水解反应不易发生，因此不易产生开
环二聚体。由此提示，样品中开环二聚体的含量可
以间接反映其水分活度的大小;在实际生产中可以
通过测定并控制开环二聚体含量保证较低的水分活
度，从而保证产品的稳定性。
致谢:本实验的扫描电镜实验是在 Bruker AXS 公司完成的，
并且得到了该公司应用工程师刘军涛先生的大力协助。
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基金项目:河北省科技支撑计划项目 (09276423D) ;石家庄市科技局指令计划指导项目(10146513A)
作者简介:霍好利，女，硕士研究生 研究方向:药物质量控制与药代动力学研究 * 通讯作者:张兰桐，男，教授 研究方向:药物质量
控制与药代动力学研究 Tel: (0311)86266419 E-mail:zhanglantong@ 263. net
蛇床夫内酯在大鼠肝微粒体中的酶促反应动力学研究
霍好利，苑霖，刘西哲，曹亮，常路，张兰桐* (河北医科大学药学院药物分析教研室，石家庄 050017)
摘要:目的 研究蛇床夫内酯在大鼠肝微粒体中的酶促反应动力学。方法 以回芹内酯为内标，采用液质联用(LC /MS)的方
法测定蛇床夫内酯在体外代谢中的代谢产物 3″，8-甲氧基异欧前胡内酯(M1)和 5″-羟基-8-甲氧基异欧前胡内酯(M2)。用
Linewrave-Burk作图分析数据，计算酶促动力学常数。结果 代谢物 M1 的 Vmax = 1. 152 5 μmol·(min·mg pro)
－ 1，Km =
133. 156 6 μmol·L －1，M2 的 Vmax = 1. 630 8 μmol·(min·mg pro)
－ 1，Km = 292. 857 1 μmol·L
－1。结论 该方法简单、快速、可
靠，适用于蛇床夫内酯的体外代谢研究。
关键词:蛇床夫内酯;3″，8-甲氧基异欧前胡内酯;5″-羟基-8-甲氧基异欧前胡内酯;肝微粒体;酶促反应动力学
中图分类号:Q814 文献标志码:A 文章编号:1001 － 2494(2011)23 － 1839 － 05
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中国药学杂志 2011 年 12 月第 46 卷第 23 期 Chin Pharm J，2011 December，Vol. 46 No. 23
Enzyme Kinetics of Cnidilin Metabolism in Rat Liver Microsomes
HUO Hao-li，YUAN Lin，LIU Xi-zhe，CAO Liang，CHANG Lu，ZHANG Lan-tong* (Department of Pharmaceutical A-
nalysis，School of Pharmacy，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017，China)
ABSTRACT:OBJECTIVE To study the enzyme kinetics of cnidilin metabolism in rat liver microsomes. METHODS A LC-MS
method was established for quantitative analysis of two metabolites，3″，8-methoxy-isoimperatorin (M1)and 5″-hydroxyl-8-methoxy-iso-
imperatorin (M2) ，with pimpinellin as internal standard. Lineweave-Burk graphic method was used to calculate the enzyme kinetic pa-
rameters，maximum reaction rate (Vmax)and Km ． RESULTS The enzyme kinetics parameters of M1 were as follows:Vmax = 1. 152 5
μmol·(min·mg pro)－ 1，and Km = 133. 156 6 μmol·L
－1 . And the parameters of M2 were:Vmax = 1. 630 8 μmol·(min·mg
pro)－ 1，and Km = 292. 857 1 μmol·L
－1. CONCLUSION The method is simple，specific and reliable，which is suitable for the in
vitro metabolism research of cnidilin.
KEY WORDS:cnidilin;3″，8-methoxy-isoimperatorin;5″-hydroxyl-8-methoxy-isoimperatorin;liver microsomes;enzyme kinetics
白芷为伞形科植物白芷的干燥根，主要用于治
疗感冒头痛，眉棱骨痛，鼻塞流涕，鼻鼽，鼻渊，牙痛，
带下，疮疡肿痛等症状［1］。蛇床夫内酯(8-甲氧基异
欧前胡内酯，cnidilin)是一种线性呋喃香豆素类化
合物，为白芷中的有效成分。近年来，对白芷中氧化
前胡素、欧前胡素、异欧前胡素等香豆素类化合物研
究较多［2-3］。本实验室对白芷药材中蛇床夫内酯进
行了定量研究［4］，并通过微生物转化制备了 2 个代
谢物 3″，8-甲氧基异欧前胡内酯(M1)与 5″-羟基-8-
甲氧基异欧前胡内酯(M2)［5］。目前，对于药物酶促
反应动力学的研究报道较多［6］，但对于蛇床夫内酯
的相关研究未见报道，本实验通过监测M1、M2 生成
量的变化，研究其在大鼠肝微粒体中的酶促反应动
力学，寻找最佳反应条件，为该药的代谢酶系及代谢
物定性研究提供前提条件，进而为研究药材的作用
机制奠定基础。
1 仪器与材料
1. 1 仪器
Agilent － 1200 高效液相色谱仪(在线脱气机，
四元泵，自动进样器，Agilent 美国)。QTRAPTM3200
三重四极杆线性离子阱质谱仪、Turbo V 源、Analyst
software 色谱工作站(美国应用生物系统公司)。
MTN －2800D型氮气吹干仪(天津奥特赛恩斯仪器
有限公司)。TDL －5 台式离心机(北京雷勃尔离心
机有限公司) ;Optima TM LE －80K超速低温离心机
和 Allegra TM 64R 离心机(美国 Beckman 公司) ;
XW80A型涡旋混合器(上海医科大学仪器厂) ;多
功能调速振荡器(金坛市晨阳电子仪器厂)。
1. 2 试药
蛇床夫内酯由本室从白芷中分离得到，归一化
法测定含量大于 98%［4］。M1 和 M2 由本室从蛇床
夫内酯的微生物转化放大实验中制备得到，归一化
法测定含量大于 98%［5］。茴芹内酯(内标，IS，中国
药品生物制品检定所)。氯化镁(MgCl2) ，氧化型辅
酶Ⅱ(β-NADP) ，葡萄糖-6-磷酸(G-6-P) ，葡萄糖-6-
磷酸脱氢酶(G-6-PD) (Sigma 公司)。甲醇、甲酸为
色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为重蒸馏水。
1. 3 动物
SD大鼠(250 g，河北省实验动物研究中心，合
格证编号 DK 0908083)。
2 方法与结果
2. 1 溶液的配制
蛇床夫内酯对照品溶液:精密称取蛇床夫内酯
对照品适量，用甲醇溶解并制成 18 540 μmol·L －1
的储备液;精密量取适量，用甲醇稀释成 13 910、
9 270、6 953、4 635、2 318、927 μmol·L －1的系列浓
度对照品溶液，备用。
M1 和 M2 混合对照品溶液:精密称取 M1 和 M2
对照品适量，分别用甲醇溶解并制成储备液。精密
量取适量，混合并用甲醇稀释成混合储备液，其中
M1、M2 的浓度均为 1 898 μmol·L －1。精密量取适
量，用甲醇稀释成 1 582、1 266、791. 2、158. 2、31. 6、
15. 8 μmol·L －1的系列浓度对照品溶液，备用。
IS溶液:精密称取茴芹内酯对照品适量，用甲
醇溶解并稀释成 1. 45 μmol·L －1的溶液。
空白温孵液:肝微粒体高温灭活，稀释成蛋白浓
度 1 mg·mL －1的空白温孵液。
2. 2 肝微粒体的制备
雄性 SD大鼠 5 只(220 ～ 250 g) ，禁食 12 h 后，
断头处死，开腹迅速取出肝脏，用滤纸吸干后称重，
立即于冰冷的蔗糖溶液(10 mmol·L －1 Tris，250
mmol·L －1蔗糖，1 mmol·L －1 EDTA，pH 7. 4)反复
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清洗，剪碎，反复清洗至无色，加 3 倍于肝重量的蔗
糖溶液，于冰浴中研磨成匀浆，超声分散 30 s;4 ℃
下(20 000 × g)离心 20 min，取上清液 4 ℃ 下
(100 000 × g)离心 60 min，沉淀用焦磷酸钾缓冲液
悬浮均匀，4 ℃下(100 000 × g)离心 60 min，所得沉
淀即为肝微粒体，用一定量的 Tris-HCl缓冲液悬浮，
置于 － 80 ℃冰箱内保存备用。采用 Lowry［7］法测定
肝微粒体悬浮液蛋白浓度。
2. 3 温孵条件
孵育体系由 0. 1 mol·L －1 K2HPO4缓冲液(pH
7. 4)组成，含 β-NADP 0. 5 mmol·L －1，G-6-P 1. 0
mmol·L －1，G-6-PD 1. 0 U·mL －1。肝微粒体蛋白
质量浓度为 1. 0 mg·mL －1，终体积为 1 mL 每个反
应体系中加入不同浓度的对照品溶液 10 μL，使甲
醇的终浓度为 1%。孵化液 37 ℃预热 5 min 后，向
反应体系中加入 NADPH 还原系统启动反应。孵化
体系于 37 ℃恒温振荡(150 r·min －1)一定时间后，
立即取出放入冰箱内，－ 20 ℃终止反应。
2. 4 样品处理
取上述温孵后的反应体系 1. 0 mL，加入 IS溶液
20 μL，涡旋 20 s，再加入乙酸乙酯 3. 0 mL，涡旋 2
min后离心(10 000 r·min －1)5 min，取上层有机相
2. 5 mL，37 ℃ N2吹干，残留物用甲醇 100 μL 溶解
后离心(14 000 r·min －1)10 min进样。
2. 5 色谱与质谱条件
液相色谱条件:Sapphire C18色谱柱(4. 6 mm ×
150 mm，5 μm) ，流动相为 A:甲醇(含有 0. 05%的
甲酸) ，B:水(含有 0. 05%的甲酸) ，梯度洗脱流程:
A在 0 ～ 3 min为 70% ～95%;3 ～ 7. 5 min以 A-B为
95∶ 5 进行洗脱，7. 5 ～ 8 min A 为 95% ～ 70%，每次
进样前以 A-B为 70 ∶ 30 预平衡 6 min。流速为 700
μL·min －1，进样量 10 μL。
质谱条件:电喷雾离子源(ESI 源) ，正离子模
式，Turbo V离子源，源温度为 650 ℃。源喷射电压
为 5. 5 kV，雾化气(gas 1)和加热气(gas 2)分别为
414 和 448 Pa，气帘气为 172 Pa，接口处加热，采用
多反应监测模式(MRM)。M1、M2 和 IS的解簇电压
(DP)、碰撞能量和监测离子对分别为:M1 20 V，19
eV，317. 2 /231. 1;M2 20 V，12 eV，317. 1 /233. 2;IS
20 V，19 eV，247. 1 /231. 1。分析物和内标物的 MS2
质谱图见图 1。
2. 6 方法学考察
2. 6. 1 专属性 取肝微粒体温孵样品(加入 46. 35
μmol·L －1的蛇床夫内酯)和空白温孵液，按照
图 1 3″，8-甲氧基异欧前胡内酯 (M1)，5″，8-羟基-8-甲氧基
异欧前胡内酯(M2)，茴芹内酯 (IS)的化学结构和 MS2 二级
离子扫描质谱图
Fig. 1 Product ion scan spectra and chemical structures of 3″，
8-methoxy-isoimperatorin (M1)，5″-hydroxyl-8-methoxy-isoim-
peratorin(M2)and pimpine llin (IS)
“2. 4”项方法处理后测定，将 M1 和 M2 混合对照品
溶液(1 266 μmol·L －1)用甲醇稀释 100 倍后进样
测定，见图 2。M1 和 M2 与其他峰分离良好，空白温
孵液中无内源性物质干扰。
2. 6. 2 线性关系 在空白温孵液中加入不同浓度
M1、M2 混合对照品溶液，使 M1、M2 浓度均分别为
0. 158 2、0. 316 4、1. 582、7. 912、12. 66、15. 82、18. 98
μmol·L －1，按照“2. 4”项方法处理后进样测定，以
浓度为横坐标，峰面积与内标峰面积比值为纵坐标，
绘制标准曲线。得回归方程 M1:Y = 0. 531 2X +
0. 107 5，r2 = 0. 999 4;M2:Y = 0. 508 3X + 0. 000 7，
r2 = 0. 999 5。说明 M1、M2 均在 0. 158 2 ～ 18. 98
μmol·L －1内线性关系良好。
2. 6. 3 精密度和准确度 在空白温孵液中加入不
同浓度的 M1、M2 混合对照品溶液，配制成低
(0. 316 4 μmol·L －1)、中(7. 912 μmol·L －1)、高
(15. 82 μmol· L －1)浓度的溶液，各 6 份，按照
“2. 4”项方法处理后进样测定，连续 5 d测定。计算
日内日间精密度和准确度。结果见表 1。
2. 6. 4 提取回收率 同上制备低、中、高 3 个浓度
的溶液，各 6 份，依次进样测定，以 M1、M2 和内标峰
面积比值，与相应浓度的M1、M2 混合对照品溶液经
同倍稀释后直接进样后峰面积与内标峰面积之比的
比值，计算 M1、M2 相应的提取回收率。结果
见表 1。
2. 7 酶促动力学研究
2. 7. 1 温孵时间的影响 温孵体系中底物蛇床夫
内酯的浓度为 46. 35 μmol·L －1，肝微粒体蛋白质
量浓度为 1. 0 mg·mL －1，37 ℃温孵，分别于 5、10、
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中国药学杂志 2011 年 12 月第 46 卷第 23 期 Chin Pharm J，2011 December，Vol. 46 No. 23
图 2 M1，M2，IS在空白温孵液(A)，对照品(B)和样品(C)的 MRM色谱图
Fig. 2 MRM Chromatograms of M1，M2 and IS in blank(A)，standards (B)and sample(C)
表 1 M1 和 M2 的日内和日间精密度、准确度和回收率
Tab. 1 Intra-day and inter-day precision，accuracy and extraction recovery of M1 and M2
Components
c
/μmol·L －1
Intra-day Inter-day
Precision RSD /% Accuracy /% Precision RSD /% Accuracy /%
Recovery
/%
M1 0． 317 1． 99 99． 1 2． 66 97． 1 90． 4
7． 912 4． 37 101． 1 4． 14 99． 4 88． 1
15． 82 2． 97 96． 7 5． 50 99． 8 84． 8
M2 0． 317 3． 26 101． 7 5． 38 104． 5 91． 2
7． 912 5． 16 102． 9 6． 58 104． 7 88． 3
15． 82 3． 72 97． 5 7． 55 102． 5 86． 0
20、30、40、50、60、80、100 min 取样，处理后进样测
定。结果见图 3。M1、M2 的生成量在 0 ～ 30 min 内
呈线性增加，因此选择 30 min为最佳温孵时间。
2. 7. 2 蛋白浓度的影响 蛇床夫内酯体系浓度为
46. 35 μmol·L －1，肝微粒体蛋白质量浓度分别为
0. 25、0. 5、1. 0、2. 0 mg·mL －1，温孵 30 min，处理后
测定。结果 M1、M2 生成量在 0. 25 ～ 1. 0 mg·mL －1
呈线性增加，因此选择 1. 0 mg·mL －1为最佳蛋白
浓度。
2. 7. 3 底物浓度的影响 在温孵体系中分别加入
不同浓度的蛇床夫内酯对照品溶液，使其在体系中
的浓度分别为 9. 27、23. 18、46. 35、69. 53、92. 70、
139. 1、185. 4 μmol·L －1，蛋白质量浓度 1. 0 mg·
mL －1，37 ℃温孵 30 min，处理后进样测定。结果见
图 3，显示 M1 和 M2 生成量在底物浓度为 9. 27 ～
46. 35 μmol· L －1 内呈线性增加，46. 35 ～ 92. 70
μmol·L －1时增加缓慢，92. 70 ～ 185. 4 μmol·L －1时
几乎不再增加，说明酶已接近饱和状态。M1、M2 结
果基本一致。故本实验选择的底物浓度为
46. 35 μmol·L －1。
2. 7. 4 酶促动力学参数的测定 采用 Lineweave-
Burk作图法，即双倒数作图法(图 4) ，以 V － 1对
［S］－ 1作图(V 为反应速率，S 为底物浓度) ，得到直
线，其纵截距为 V － 1max，横截距为 K
－ 1
m ，代谢清除率
·2481· Chin Pharm J，2011 December，Vol. 46 No. 23 中国药学杂志 2011 年 12 月第 46 卷第 23 期
CLint = Vmax /Km。M1 回归方程为 Y = 115. 54X +
0. 867 7，r2 = 0. 994 1，计算得 Vmax = 1. 152 μmol·
(min·mg pro)－ 1，Km = 133. 2 μmol·L
－1，CLmin =
8. 655 mL·(min·mg pro)－ 1。M2 回归方程为 Y =
179. 58X + 0. 613 2，r2 = 0. 993 8，Vmax = 1. 631
μmol·(min·mg pro)－ 1，Km = 292. 9 μmol· L
－1，
CLmin = 5. 569 mL·(min·mg pro)
－ 1。
3 讨 论
M1、M2 为蛇床夫内酯的代谢产物，两个化合物
结构相近，相对分子质量相同。利用三重四极杆高
效液相-质谱联用仪进行定量，选择了裂解方式稳
定、质核比稳定且有足够丰度的碎片离子，使得 M1、
M2 很好的分离、定量。
细胞色素 P450 酶系主要存在于肝微粒体中，
是动物体中参与外源性物质代谢的主要酶系。本实
验采用了 NADPH 还原系统引发反应，通过模拟体
内环境，研究蛇床夫内酯的代谢物M1、M2 的酶促反
应动力学。寻找了最佳温孵条件，依据二者随底物
浓度变化的生成速率，采用 Lineweave-Burk 作图法
计算出酶促反应动力学常数。结果表明，细胞色素
P450 酶参与了蛇床夫内酯的生物转化，该化合物是
一个肝脏代谢药物，为该药的临床试验研究提供了
参考依据。
酶促动力学研究阐明了药物在肝微粒体中是否
被代谢，提供了最佳反应时间、蛋白浓度以及最适底
物浓度等条件，是药物代谢酶系及代谢物定性研究
的前提。蛇床夫内酯是中药白芷的主要成分之一，
通过单体成分在肝微粒体中的定性、定量研究，为阐
明其在体内的作用机制奠定了基础。
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