全 文 ：收稿日期：２０１２－１０－１７
基金项目：三峡大学化学与生命科学学院科技开发预研基金
通信作者：陈剑锋（１９７９－），男，讲师，博士，主要研究方向为药理学．Ｅ－ｍａｉｌ：ｃｈｅｎｊｉａｎｆｅｎｇ２００３＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ
三峡区域特色药材宜昌润楠正丁醇
提取物体外抗炎活性研究
张　秀１　付雪娇１　王桂萍１　程　凡１，２　陈剑锋１
（１．三峡大学 化学与生命科学学院 天然产物研究与利用湖北省重点实验室，湖北 宜昌　４４３００２；２．北京林业
大学 生物科学与技术学院，北京　１０００８３）
摘要：目的：探讨宜昌润楠正丁醇提取物（ＭＣＢ）的体外抗炎活性．方法：利用细菌脂多糖（ＬＰＳ）刺
激经佛波酯（ＰＭＡ）诱导的人单核细胞ＴＨＰ－１建立体外炎症模型，ＭＴＴ法检测样品的细胞毒性，
ＥＬＩＳＡ方法检测药物干预前后细胞上清液中ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＴＮＦ－α和ＮＯ的分泌量，综合评价 ＭＣＢ
对炎性细胞因子和介质的抑制作用．结果：ＭＣＢ显著性地抑制了ＩＬ－６和ＴＮＦ－α以及ＮＯ的产生，
并且其抑制作用具有时间和剂量依耐性，但对ＩＬ－１β没有明显的抑制效果．结论：本研究初步验证
了宜昌润楠的体外抗炎作用，为其民间应用提供了理论依据，也为进一步分离生物活性物质提供
了方向．
关键词：宜昌润楠；　体外抗炎活性；　人单核细胞ＴＨＰ－１
中图分类号：Ｒ２８５　　　文献标识码：Ａ　　　文章编号：１６７２－９４８Ｘ（２０１３）０３－００９８－０５
Ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　ｏｆ　ｎ－ＢｕＯＨ　Ｅｘｔｒａｃｔｓ　ｆｒｏｍ　Ｍａｃｈｉｌｕｓ　Ｉｃｈａｎｇｅｎｓｉｓ
Ｚｈａｎｇ　Ｘｉｕ１　Ｆｕ　Ｘｕｅｊｉａｏ１　Ｗａｎｇ　Ｇｕｉｐｉｎｇ１　Ｃｈｅｎｇ　Ｆａｎ１，２　Ｃｈｅｎ　Ｊｉａｎｆｅｎｇ１
（１．Ｈｕｂｅｉ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｎａｔｕｒａｌ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　＆Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉ－
ｅｎｃｅｓ，Ｃｈｉｎａ　Ｔｈｒｅｅ　Ｇｏｒｇｅｓ　Ｕｎｉｖ．，Ｙｉｃｈａｎｇ　４４３００２，Ｃｈｉｎａ；２．Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　＆Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ－
ｇｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ　Ｕｎｉｖ．，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１０００８３，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｔｏ　ｅｖａｌｕａｔｅ　ｔｈｅ　ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｏｆ　ｎ－ＢｕＯＨ　ｅｘｔｒａｃｔｓ　ｆｒｏｍ　Ｍａｃｈｉｌｕｓ　ｉｃｈａｎｇｅｎｓｉｓ
（ＭＣＢ）．Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ　ｍｏｄｅｌ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｗａｓ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ｂｙ　ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ｈｕｍａｎ　ａｃｕｔｅ　ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ　ｌｅｕｋｅｍｉａ　ｃｅｌ　ｌｉｎｅ
（ＴＨＰ－１）ｗｉｔｈ　ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ（ＬＰＳ）ａｆｔｅｒ　ｗｈｉｃｈ　ｗｅｒｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ　ｉｎｔｏ　ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ　ｂｙ　ｐｈｏｒｂｏｌ　ｅｓｔｅｒ
（ＰＭＡ）；Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ＭＣＢ　ｗａｓ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｂｙ　ＭＴＴ　ａｓｓａｙ；Ｔｈｅ　ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｏｆ　ＭＣＢ　ｗａｓ
ｅｖａｌｕａｔｅｄ　ｂｙ　ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ　ｉｔｓ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｍｅｄｉａｔｏｒｓ　ｏｆ　ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，ｓｕｃｈ　ａｓ
ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ　１β（ＩＬ－１β），ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ　６（ＩＬ－６），ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ－α（ＴＮＦ－α）ａｎｄ　ｎｉｔｒｉｃ　ｏｘｉｄｅ（ＮＯ）ｉｎ　ｃｅｌ
ｃｕｌｔｕｒｅ　ｍｅｄｉｕｍ　ｕｓｉｎｇ　ＥＬＩＳＡ　ｍｅｔｈｏｄｓ．ＭＣＢ　ｓｈｏｗｅｄ　ｇｒｅａｔ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｄｏｓｅ－ａｎｄ　ｔｉｍｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ａｃ－
ｔｉｖｉｔｙ　ｏｎ　ＩＬ－６，ＴＮＦ－αａｎｄ　ＮＯ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｂｕｔ　ｓｌｉｇｈｔ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｎ　ＩＬ－１β，ａｌ　ｏｆ　ｗｈｉｃｈ　ａｒｅ　ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｉｎｆｌａｍｍａ－
ｔｏｒｙ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ　ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ　ｖａｌｉｄａｔｅ　ｔｈｅ　ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｏｆ　ＭＣＢ　ａｎｄ　ｆｏｒ　ｉｔｓ　ｔｒａｄｉ－
ｔｉｏｎａｌ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｐｒｏｖｉｄｅ　ｔｈｅ　ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ　ｂａｓｉｓ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｔｈｉｓ　ｐｌａｎｔ　ｉｓ　ａ　ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ　ｃａｎｄｉｄａｔｅ　ｆｏｒ　ｆｕｒ－
ｔｈｅｒ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｏｆ　ｉｔｓ　ａｃｔｉｖｅ　ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ａｃｔｉｖｉｔｙ－ｇｕｉｄｅｄ　ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ　ｍａｃｈｉｌｕｓ　ｉｃｈａｎｇｅｎｓｉｓ；　ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｉｎ　ｖｉｖｒｏ；　ｈｕｍａｎ　ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ　ｃｅｌ　ｌｉｎｅ　ＴＨＰ－１
　 　 宜 昌 润 楠 （Ｍａｃｈｉｌｕｓ　ｉｃｈａｎｇｅｎｓｉｓ　Ｒｅｈｄ．ｅｔ　 Ｗｉｌｓ．）是樟科润楠属常绿植物［１］，主要产于湖北、四
第３５卷　第３期
２０１３年６月
三峡大学学报（自然科学版）
Ｊ　ｏｆ　Ｃｈｉｎａ　Ｔｈｒｅｅ　Ｇｏｒｇｅｓ　Ｕｎｉｖ．（Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）
Ｖｏｌ．３５Ｎｏ．３
Ｊｕｎ．２０１３
川、陕西南部和甘肃西部，资源十分丰富［２］．宜昌润楠
在我国传统和民间医药典籍中有应用记载，茎、叶、皮
药用，治霍乱、吐泻不止、抽筋及足肿，在三峡区域民
间主要应用其治疗各种皮肤炎症、关节肿痛和风湿性
疾病，疗效显著，且无明显的毒副作用［３］．目前国内外
尚未见到有关宜昌润楠化学成分和药理作用的报道，
临床使用经验提示宜昌润楠具有较好的抗炎效果，但
其抗炎药效的物质基础和作用机制尚未阐明．本试验
采用佛波酯（ＰＭＡ）诱导人单核细胞 ＴＨＰ－１分化成
巨噬细胞，再利用细菌脂多糖（ＬＰＳ）刺激产生白介素
１（ＩＬ－１β）、白介素６（ＩＬ－６）、肿瘤坏死因子（ＴＮＦ－α）和
一氧化氮（ＮＯ）等炎性细胞因子和炎性介质，构建炎
症细胞模型，观察宜昌润楠正丁醇提取物（ＭＣＢ）对
上述炎性细胞因子和介质的影响，初步探索其抗炎活
性作用机制，为宜昌润楠的民间药用提供药理学依
据．
１　材料与仪器
１．１　细胞
ＴＨＰ－１细胞购自中国科学院上海生命科学研究
院细胞资源中心（编号：ＴＣＨｕ　５７），按推荐的方法保
存、传代及培养．
１．２　药物与试剂
佛波酯ＰＭＡ（ＣＡＳ＃１６５６１－２９－８）购自Ｐｒｏｍｅｇａ
公司；脂多糖ＬＰＳ（ｆｒｏｍ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　０１１１：Ｂ４）购
自Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；人ＩＬ－１βＥＬＩＳＡ 检测试剂盒、人
ＩＬ－６ＥＬＩＳＡ检测试剂盒以及人ＴＮＦ－αＥＬＩＳＡ检测
试剂盒购自达科为生物技术有限公司；人ＮＯ　ＥＬＩＳＡ
检测试剂盒购自上海信然生物技术有限公司．
１．３　主要仪器
ＥＬＸ８００ＮＢ酶标仪（ＢｉｏＴｅｋ）；倒置显微镜（Ｏ－
ｌｙｍｐｕｓ　ＣＫＸ４１）；ＣＯ２ 培养箱（Ｔｈｅｒｍｏ　３１１１）．
２　方法
２．１　润楠正丁醇提取物的制备
取宜昌润楠干燥枝叶１ｋｇ，常温下９５％乙醇浸
提，减压浓缩得浸膏１０３ｇ，浸膏依次用石油醚、乙酸
乙酯、正丁醇萃取，得到正丁醇部位３２ｇ．正丁醇部位
上大孔树脂后用８０％乙醇洗脱，洗脱液浓缩干燥，得
润楠正丁醇提取物（ＭＣＢ）１８ｇ．
２．２　ＭＣＢ对ＴＨＰ－１细胞生长状况的影响
应用 ＭＴＴ法测定 ＭＣＢ对ＴＨＰ－１细胞的细胞
毒性．步骤如下：将处于对数生长期的人单核细胞
ＴＨＰ－１（２×１０５ 个／ｍＬ）接种于２４孔细胞培养板中（１
ｍＬ／孔），１２ｈ后加入终浓度为１００ｎＭ的ＰＭＡ，继续
培养４８ｈ，待细胞贴壁后分别添加：①正常细胞组：细
胞培养孔中仅加入相同体积的完全培养基；②阳性药
物组：于细胞培养孔中加入终质量浓度为５０μｇ／ｍＬ
的丝裂霉素；③给药组：于细胞培养孔中加入终质量
浓度为５０～１　６００μｇ／ｍＬ的 ＭＣＢ．每组６个复孔，药
物作用４８ｈ后ＯＤ４９０测定吸光度，根据公式：抑制率
（１－给药组ＯＤ４９０／正常组ＯＤ４９０）×１００％计算抑制
率．
２．３　ＭＣＢ对炎性细胞因子分泌的影响
２．３．１　固定药物浓度，观察作用不同时间的 ＭＣＢ
对炎性细胞因子分泌的影响
将处于对数生长期的人单核细胞 ＴＨＰ－１（２×
１０５ 个／ｍＬ）接种于２４孔细胞培养板中（１ｍＬ／孔），１２
ｈ后加入终质量浓度为１００ｎＭ的ＰＭＡ，继续培养４８
ｈ，待细胞贴壁后分别添加：①正常组，细胞培养孔中
仅加入相同体积的完全培养基；②模型组，于细胞培
养孔中加入终质量浓度为１μｇ／ｍＬ　ＬＰＳ；③给药组，
于细胞培养孔中加入终质量浓度为１μｇ／ｍＬ　ＬＰＳ以
及８００μｇ／ｍＬ的 ＭＣＢ；３７℃，５％ＣＯ２ 下培养不同时
间后（２ｈ、４ｈ、８ｈ、１２ｈ、２４ｈ等）收取细胞上清，ＥＬＩＳＡ
试剂盒分别检测ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＴＮＦ－α和 ＮＯ的含量．
根据公式：抑制率＝（１－给药组浓度／模型组浓度）×
１００％测定抑制率．
２．３．２　固定药物作用时间，观察不同浓度的 ＭＣＢ
对炎性细胞因子分泌的影响
将处于对数生长期的人单核细胞 ＴＨＰ－１（２×
１０５ 个／ｍＬ）接种于２４孔细胞培养板中（１ｍＬ／孔），１２
ｈ后加入终质量浓度为１００ｎＭ的ＰＭＡ，继续培养４８
ｈ，待细胞贴壁后分别添加：①正常组，细胞培养孔中
仅加入相同体积的完全培养基；②模型组，于细胞培
养孔中加入终质量浓度为１μｇ／ｍＬ　ＬＰＳ；③给药组，
于细胞培养孔中加入终质量浓度为１μｇ／ｍＬ　ＬＰＳ以
及不同质量浓度的 ＭＣＢ（５０～８００μｇ／ｍＬ）；３７℃，５％
ＣＯ２ 下培养相同时间后同时收取细胞上清，ＥＬＩＳＡ
试剂盒分别检测ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＴＮＦ－α和 ＮＯ的含量，
计算 ＭＣＢ对相应细胞因子的抑制率．抑制率＝（１－
给药组浓度／模型组浓度）×１００％测定抑制率．
２．４　数据处理
所有实验数据均以ｘ±ｓＤ 表示，并应用Ｇｒａｐｈ－
Ｐａｄ　Ｐｒｉｓｍ５．０软件进行图表绘制和统计分析．
９９第３５卷　第３期　　　　　　　　　张　秀，等　三峡区域特色药材宜昌润楠正丁醇提取物体外抗炎活性研究
３　结　果
３．１　ＭＣＢ对ＴＨＰ－１细胞生长状况的影响
结果如图１所示，加入药物后培养４８ｈ，发现
１６００μｇ／ｍＬ的 ＭＣＢ明显抑制了细胞生长，与正常细
胞相比，有显著性差异，表明１　６００μｇ／ｍＬ的 ＭＣＢ对
ＴＨＰ－１细胞具有一定毒性．但５０ ～８００μｇ／ｍＬ的
ＭＣＢ对ＴＨＰ－１细胞不表现毒性，与未加药的正常细
胞相比，反而促进了细胞生长，表明 ＭＣＢ对ＴＨＰ－１
细胞的安全质量浓度应该在８００μｇ／ｍＬ及以下．
＊＊：Ｐ＜０．０１，＊＊＊：Ｐ＜０．００１，与正常细胞组相比，显
著性抑制细胞生长；△：Ｐ＜０．００１，与正常细胞组相比，
显著性促进细胞生长．
图１　宜昌润楠正丁醇提取物（ＭＣＢ）对
ＴＨＰ－１细胞生长状况的影响
３．２　ＭＣＢ对ＩＬ－１β分泌的影响
３．２．１　加药后不同时间 ＭＣＢ对ＩＬ－１β分泌的影响
加入８００μｇ／ｍＬ的 ＭＣＢ后，于３７℃，５％ＣＯ２ 下
培养２、４、８、１２、２４ｈ后收取细胞上清．每个时间段设
３个复孔；ＥＬＩＳＡ试剂盒检测ＩＬ－１β的含量．结果如
图２所示，随着ＬＰＳ刺激时间的延长，ＩＬ－１β的分泌
量逐渐增大，在１２ｈ时达到顶峰．在加入药物２ｈ以
内，与模型组相比，８００μｇ／ｍＬ的 ＭＣＢ能极显著地抑
制ＩＬ－１β的分泌（Ｐ＜０．００１）．但随着时间的增加，在
加药４ｈ及以后 ＭＣＢ均没有表现出抑制ＩＬ－１β分泌
的活性．
＊＊＊：Ｐ＜０．００１．
图２　８００μｇ／ｍＬ的 ＭＣＢ作用不同时间（２～２４ｈ）
对ＩＬ－１β分泌的影响
３．２．２　不同质量浓度的 ＭＣＢ对ＩＬ－１β分泌的影响
加入不同质量浓度的 ＭＣＢ（５０～８００μｇ／ｍＬ），每
个浓度设３个复孔，继续培养２ｈ后取细胞上清，
ＥＬＩＳＡ试剂盒检测ＩＬ－１β的含量．结果图３所示，随
着药物浓度的增大，ＭＣＢ对 ＴＨＰ－１细胞分泌Ｌ－１β
的抑制率也随之增大，当ＭＣＢ质量浓度达到８００μｇ／
ｍＬ时，有最大抑制率，约为７５％左右．
图３　不同质量浓度的 ＭＣＢ对ＩＬ－１β分泌的抑制率
（作用时间：２ｈ）
３．３　ＭＣＢ对ＩＬ－６分泌的影响
３．３．１　加药后不同时间 ＭＣＢ对ＩＬ－６分泌的影响
加入８００μｇ／ｍＬ的 ＭＣＢ后，于３７℃，５％ＣＯ２ 下
培养２、４、８、１２、２４ｈ后收取细胞上清．每个时间段设
３个复孔；ＥＬＩＳＡ试剂盒检测ＩＬ－６的含量．结果如图
４所示，ＬＰＳ刺激４ｈ后，ＴＨＰ－１细胞开始分泌ＩＬ－６，
随着刺激时间的延长，ＩＬ－６的分泌量逐渐增大．与模
型组相比，加药组（８００μｇ／ｍＬ的 ＭＣＢ）的ＩＬ－６含量
在不同的时间段均明显下降，表明 ＭＣＢ对ＬＰＳ诱导
的ＩＬ－６有极显著的抑制作用（Ｐ＜０．００１）．
＊＊＊：Ｐ＜０．００１．
图４　８００μｇ／ｍＬ的 ＭＣＢ作用不同时间（２～２４ｈ）
对ＩＬ－６分泌的影响
３．３．２　不同质量浓度的 ＭＣＢ对ＩＬ－６分泌的影响
加入不同浓度的 ＭＣＢ（５０～８００μｇ／ｍＬ），每个浓
度设３个复孔，继续培养８ｈ后取细胞上清，ＥＬＩＳＡ
试剂盒检测ＩＬ－６的含量．结果图５所示，可见随着药
物浓度的增大，ＭＣＢ对ＴＨＰ－１细胞分泌Ｌ－６的抑制
率也随之增大，当 ＭＣＢ质量浓度达到８００μｇ／ｍＬ
时，有最大抑制率，约为９８％左右．
３．４　ＭＣＢ对ＴＮＦ－α分泌的影响
３．４．１　加药后不同时间 ＭＣＢ对ＴＮＦ－α分泌的影响
加入８００μｇ／ｍＬ的 ＭＣＢ后，于３７℃，５％ＣＯ２ 下
培养２、４、８、１２、２４ｈ后收取细胞上清．每个时间段设
００１ 三 峡 大 学 学 报（自 然 科 学 版）　　　　　　　　　　　　　　２０１３年６月
图５　不同质量浓度的 ＭＣＢ对ＩＬ－６分泌的抑制率
（作用时间：８ｈ）
３个复孔；ＥＬＩＳＡ试剂盒检测ＴＮＦ－α的含量．结果如
图６所示，ＬＰＳ刺激 ＴＨＰ－１细胞后开始分泌 ＴＮＦ－
α，随着刺激时间的延长，ＴＮＦ－α的分泌量逐渐增大．
与模型组相比，加药组（８００μｇ／ｍＬ的 ＭＣＢ）的ＴＮＦ－
α含量在不同的时间段均明显下降，表明 ＭＣＢ对
ＬＰＳ诱导的 ＴＮＦ－α有极显著的抑制作用 （Ｐ＜
０．００１）．
＊＊＊：Ｐ＜０．００１．
图６　８００μｇ／ｍＬ的 ＭＣＢ作用不同时间（２～２４ｈ）
对ＴＮＦ－α分泌的影响
３．４．２　不同质量浓度的 ＭＣＢ对ＴＮＦ－α分泌的影响
加入不同质量浓度的 ＭＣＢ（５０～８００μｇ／ｍＬ），每
个浓度设３个复孔，继续培养４ｈ后取细胞上清，
ＥＬＩＳＡ试剂盒检测ＴＮＦ－α的含量．结果图７所示，可
见随着药物浓度的增大，ＭＣＢ对 ＴＨＰ－１细胞分泌
ＴＮＦ－α的抑制率也随之增大，当 ＭＣＢ质量浓度达到
８００μｇ／ｍＬ时，有最大抑制率，约为９０％左右．
图７　不同质量浓度的 ＭＣＢ对ＴＮＦ－α分泌的抑制率
（作用时间：４ｈ）
３．５　ＭＣＢ对ＮＯ产生的影响
３．５．１　加药后不同时间 ＭＣＢ对ＮＯ产生的影响
加入８００μｇ／ｍＬ的 ＭＣＢ后，于３７℃，５％ＣＯ２ 下
培养８、１２、２４、３６、７２ｈ后收取细胞上清．每个时间段
设３个复孔；ＥＬＩＳＡ试剂盒检测ＮＯ的含量．结果如
图８所示，ＬＰＳ刺激 ＴＨＰ－１细胞３６ｈ后开始产生
ＮＯ，随着刺激时间的延长，ＮＯ的含量逐渐增大．与
模型组相比，加药组（８００μｇ／ｍＬ的 ＭＣＢ）在药物作
用７２ｈ后能极显著地抑制ＮＯ的产生（Ｐ＜０．００１）．
＊：Ｐ＜０．０５．＊＊＊：Ｐ＜０．００１．
图８　８００μｇ／ｍＬ的 ＭＣＢ作用不同时间（２～２４ｈ）
对ＮＯ分泌的影响
３．５．２　不同质量浓度的 ＭＣＢ对ＮＯ产生的影响
加入不同质量浓度的 ＭＣＢ（５０～８００μｇ／ｍＬ），每
个浓度设３个复孔，继续培养７２ｈ后取细胞上清，
ＥＬＩＳＡ试剂盒检测ＮＯ的含量．结果图９所示，可见
随着药物浓度的增大，ＭＣＢ对ＴＨＰ－１细胞产生ＮＯ
的抑制率也随之增大，当ＭＣＢ质量浓度达到８００μｇ／
ｍＬ时，有最大抑制率，约为５０％左右．
图９　不同质量浓度的 ＭＣＢ对ＮＯ分泌的抑制率
（作用时间：７２ｈ）
４　讨　论
炎症是机体对外来刺激产生的一种病理反应过
程，症状表现为局部的红肿热痛，病理检查可发现有
大量炎症细胞，如粒细胞、巨噬细胞的局部浸润和组
织坏死，在这一过程中，一些细胞因子起到重要的促
进作用，如ＩＬ－１β、ＩＬ－６、和ＴＮＦ－α以及ＮＯ等介质可
促进炎症细胞的聚集、活化和炎症介质的释放，加重
炎症症状．在许多炎症性疾病中都可检测到上述细胞
因子的水平升高［４］．当重度感染时，腹腔巨噬细胞受
１０１第３５卷　第３期　　　　　　　　　张　秀，等　三峡区域特色药材宜昌润楠正丁醇提取物体外抗炎活性研究
到大量ＬＰＳ刺激，产生大量的ＩＬ－１β、ＩＬ－６和ＴＮＦ－α，
它们相互诱生，相互协同．由于这些细胞因子的过量
存在，进一步激活多形核白细胞和内皮细胞等效应细
胞，并释放氧自由基、蛋白酶等，加速花生四烯酸代
谢，释放血栓素Ａ２、前列腺素、白三烯等炎症介质，形
成瀑布效应，导致过度炎症反应［５］．目前己开始利用
细胞因子抑制剂治疗炎症性疾病，例如利用ＩＬ－１β的
受体拮抗剂和抗ＴＮＦ－α抗体治疗内毒素性休克、类
风湿关节炎等，收到了初步疗效［６－７］．
宜昌润楠是三峡区域一种常见的民间药材，多用
来治疗关节肿痛和风湿类风湿性关节炎以及各种皮
肤瘙痒症．采集新鲜的枝叶捣碎后外敷患部或水煮液
口服，可有效缓解局部红肿热痛的症状，且极少发生
毒副作用或其它不良反应，深受当地老百姓的喜爱．
但目前国内外尚未见到有关宜昌润楠化学成分和药
理作用的报道，根据其临床使用经验和用药方式，推
测其可能具有较好的抗炎效果．本研究以宜昌润楠正
丁醇提取物为研究对象，初步探索其抗炎的物质基础
和作用机制，为宜昌润楠这一民间药物的应用奠定基
础．根据试验结果，发现其对细胞基本无毒性，高浓度
的正丁醇提取物甚至还可以促进细胞的生长，这可能
是其临床应用毒副作用极小的原因之一．另外，正丁
醇提取物虽然对ＩＬ－１β的抑制效果不明显，但对炎性
细胞因子ＩＬ－６和 ＴＮＦ－α以及炎性介质 ＮＯ的产生
均具有极显著的抑制效果，随着剂量的增加，其抑制
效果也随之增大，可以初步确定抑制炎症反应过程中
ＩＬ－６、ＴＮＦ－α和ＮＯ的产生是其发挥抗炎活性的原因
之一．但本研究对其抗炎活性的评价并不全面，诸如
对前列腺素、白三烯、血栓素Ａ２、氧自由基释放等均
未评价，这也是需要进一步研究的地方．
参考文献：
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［Ｍ］．北京：科学出版社，１９７９：１８７．
［２］　李锡文．中国植物志：第三十一卷［Ｍ］．北京：科学出版
社，１９８２：７－１４．
［３］　江苏新医学院．中药大辞典［Ｍ］．上海：上海科学技术出
版社，１９７７：１１４，１００９，１４２３．
［４］　Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｎ　Ｓｅｒｈａｎ，Ｊｏｈｎ　Ｓａｖｉｌ．Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｎｆｌａｍｍａ－
ｔｉｏｎ：ｔｈｅ　Ｂｅｇｉｎｎｉｎｇ　Ｐｒｏｇｒａｍｓ　ｔｈｅ　Ｅｎｄ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ　Ｉｍ－
ｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００５，６：１１９１－１１９７．
［５］　Ｎａｔｈａｎ，Ｃａｒｌ．Ｐｏｉｎｔｓ　ｏｆ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｉｎ　Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ［Ｊ］．
Ｎａｔｕｒｅ，２００２，４２０：８４６－８５２．
［６］　Ｌｅｎｎａｒｄ　ＡＣ．Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ［Ｊ］．
Ｃｒｉｔ　Ｒｅｖ　Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９５，１５（１）：７７－１０５．
［７］　Ｍａｒｃ　Ｆｅｌｄｍａｎｎ，Ｒａｖｉｎｄｅｒ　Ｎ．Ｍａｉｎｉ．Ａｎｔｉ－ＴＮＦ－αＴｈｅｒ－
ａｐｙ　ｏｆ　Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ　Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ：Ｗｈａｔ　Ｈａｖｅ　ｗｅ　Ｌｅａｒｎｅｄ？
［Ｊ］．Ａｎｎｕａｌ　Ｒｅｖｉｅｗ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００１，１９：１６３－１９６．
［责任编辑　周文凯］
２０１ 三 峡 大 学 学 报（自 然 科 学 版）　　　　　　　　　　　　　　２０１３年６月