全 文 ：西北林学院学报 201 0, 2 5 ( 4 ) : 19~ 22
J o u
r n a l o f N o r t h w es t oF
r e s t r y U n iv e r s i t y
低温对宜昌润楠生理指标及叶片超微结构的影响
黎 明’ , 杨芳绒 1,2 ’ , 商卫卫 ,
( 1
. 河南农业大学 林学院 ,河南 郑州 4 5 0 0 0 2 ; 2 . 北京林业大学 林学院 ,北京 1 0 0 0 8 3 )
摘 要 : 以 宜昌润楠 (M d e hi lus i hc a n ge ns i : ) 苗木为试验材料 ,研究了不 同低 温处理对 S O D 、 C A T
活性和 M D A 含量以及叶绿体超微结 构的影响 。 结 果表明 : 随着温度的降低 , S O D 和 C A T 的活性
先升高后降低 , 线拉体和淀粉拉数量逐渐增多 。 当温度降到 5℃ 时 , S O D 和 C A T 的活性均达到最
高 , M D A 含量最低 , 随着温度的 继续降低 , SO D 和 C A T 的活性均表现下 降趋势 , 而 M D A 含量逐
渐升高 。 通过电镜观察 , 宜昌润楠叶绿体在一 5℃ 时 , 线粒体减少 , 细胞膜模糊 , 叶绿体 同时受损伤
和破坏 。
关键词 : 宜昌润楠 ;低温胁迫 ; 超氧化物歧化酶 (S O D ) ; 丙二醛 ( M D A ) ; 过氧化氢酶 ( C A T ) ; 叶片超
徽结构
中图分类号 : 5 7 18 . 4 3 文献标志码 : A 文章编号 : 1 0 0 1一 7 4 6 1 ( 2 0 10 ) 0 4一 0 0 19一 0 4
E f f e e t s o f L o w T e m P e r a t u r e o n
S t r u e t u r e i n
C o l d R e s i s t a n e e a n d L e a f U l t r a m i e r o s e o P i e
M 改c h i l u s i c h a n g e n s i s
L l M i n g
l ,
Y AN G F an 兮 r o n g l , 2 ’ , S H A N G W e i一 w e i l
( 1
.
oC l抢 g e o f oF er st yr , 万巴n a n A g r ic “ l t u ar l nU i , sr i yt , hZ e n g hz o u , 月印 a n 4 5 0 0 02 , hC i na ;
2
.
CD l l
e g e o f F o er s t勺 , B e ij 艺n g F o er s t勺 nU i v e sr i t夕 , B e ij i n g 10 0 0 8 3 , hC i、 . )
A b s tar e t
:
V a r i a t i o n s o f s u p e r o x id e d i s m u t a s e ( S O D )
a n d e a t a l a s e ( C A T )
a e t i v i t y
,
m a l o n d i a ld e h y d e ( M D A )
e o n t e n t , u l t r a m im e r o s e o p ie s t r u e t u r e o f M d c h i l u s i c h a n g e n s i s s e e d li n g s a t d i f f e r e n t t e m p e r a t u r e s w e r e i n
-
v e s t i g a t e d
.
T h e d a t a s u g g e s t e d t h a t SO D a n d C A T a e t iv i t i e s w e r e i n e r e a s e d f i r s t l y a n d t h e n d e e r e a s e d
, a n d
t h e n u m b e r o f m i t o e h o n d r i a a n d s t a r e h g r a i n s i n e r e a s e d w i t h t h e t e m p e r a t u r e d e e l i n e
.
W h
e n t h e t e m p e r a
-
t u r e d r o p p e d t o s℃ , SO D a n d C A T a e t i v i t i e s r e a e h e d t o t h e t o p , M D A e o n t e n t r e a e h e d t o t h e l o w e s t
P o i n t
.
A s t h e t e m p e r a t u r e e o n t i n u e d t o d e e l i n e
,
SO D a n d C A T a e t iv i t i e s b o t h s h o w e d d o w n w a r d t r e n d
,
M D A e o n t e n t b e g a n t o i n e r e a s e g r a d u a l l y
.
W h e n t h e t e m P e r a t u r e w a s 一 5℃ , i t w a s P r o v e d b y t r a n s m i s -
s i o n e l e e t r o n m i e r o s o p e o b s e r v a t io n t h a t p l a s m a l e m m a a n d e h l o r o p l a s t w e r e d a m a g e d o r d e s t r o y e d
.
A t t h e
s a m e t im e
,
t h e s t a r e h g r a i n s w a s d e g r a d e d
.
K e y w o dr s
:
M d e h i l u : i c h a n g e n s i: , l o w t e m p e r a t u r e ; SO D ; M D A ; C A T ; u l t r a m i e r o s e o p i e s t r u e t u r e
宜昌润楠 (M d c h i l u : i e h a n g e n s i: )是樟科 润楠
属常绿阔叶树种 , 产于湖北 、 四川 、 陕西南部 。 为我
国的特有种 , 属国家二级保护植物 。 其干形通直 ,树
冠卵形 , 四季常青 ,树姿优美 , 同时具有滞尘 、减噪 、
净化空气等诸多生态功能 , 是极具开发潜力的园林
绿化树种 :l[ 。 在北方城市能否种植 , 取决于幼苗是
否忍耐低温危害阅 。 本研究通过测定低温胁迫下宜
昌润楠幼苗膜脂过氧化程度 、保护酶活性以及 叶片
超微结构的变化闭 ,研究宜昌润楠幼苗的耐低温情
况 ,为其向北方引种提供理论依据 。
1 材料与方法
1.1 材料
供试材料为 l a 生宜昌润楠实生苗 , 平 均株高
收稿 日期 : 2 0 0 9一0 8一 1 3 修回 日期 : 2 0 0 9一 12一 1 8
甚金项目 : 河南省杰 出人才创新基金 (3 2 1。。 1 70 0) 。
作者简介 : 黎 明 , 副教授 ,主要研究方向 : 植物学 . E一 m ial : LI M ing nd @ 12 6 . c o m
, 通讯作者 : 杨芳绒 , 副教授 ,在读博士 , 主要研究方向 : 园林植物生态与环境 . E一m al : y f 6r 6@ 16 3 . c o m
西北林学院学报 25卷
20 e m
,于 2 0 0 8 年 1 月移栽到 口径为 2 5 。 m 的花盆
里 ,基质用草炭 、珍珠岩 、 蛙石 ( 2 , 1 , l) 混合而成 ,
每 3 d 浇 1 次清水 。
2L 方法
1
.
2
.
1 试验设计 在 2 0 0 8 年 n 月 , 将经过 自然低
温锻炼的宜昌润楠幼苗分为 4 组 ,每组 6 株 ,分别放
在 15 、 10 、 5 、 O℃的光照培养箱和一 5 ℃冰箱中进行
低温全黑暗处理 12 h ,取植株上部第 4一 5 片健康无
虫害的叶片测定各项指标 , 3 次重复 。
1
.
2
.
2 测 定指标和方法
1) 细胞膜透性 的测定 : 采用孙守家的方法 4j[ ,剪
取相同部位的叶片 ,用双蒸水进行冲洗 , 然后用滤纸
吸干水分 ,用打孔器取大小一致的圆片 15 片 (避开
大叶脉 ) ,将打好的叶片用干净纱布包好放人试管底
部 ,并加人 10 m L 双蒸水使材料完全浸人水 中 , 1
m in 时用电导仪测定电导值 , 记为 E o , 然后室温下
黑暗放置 24 h ,充分摇匀后测得电导率记为 E l ,最
后放人沸水浴 中 15 m in , 冷却至室 温后再测 电导
率 ,记为 E Z , 每个品种重复 3 次 。
相对电导率 ( L ) 一 E l 一 E O/ E Z一 E O
2) 丙二醛 (M D A )含量测定 : 参照 `植物生理生
化试验原 理和 技术 5j[ ’ 中的硫代巴 比妥酸法 进行
测定 。
3) 抗氧化 酶 活性 测 定 : 酶 液制备 , 称 取 叶 片
0
.
5 9
,加 s n止 、 p H 7 . 8 ( 0 . o 5 M )的磷酸缓冲液 ,冰浴
研磨 ,在 O一 4℃的冰冻离心机 中 12 o o r · 而 n 一 ` 下
离心 20 而 n , 上清液即为酶液提取液 ,即可用于超氧
化物酶 ( SO D )和过氧化氢酶 ( CAT )酶活性的测定 ;酶
活性测定 : S O D 的测定方法参照文献 6j[ 中氮蓝四哇比
色法 , C AT 的测定方法参照 文献图 , 反 应 系 统为
0
.
0 4 m L酶液和 2 . 9 6 C A T 反应 液 (用 0 . 0 5M 、 P H =
7
.
0的磷酸缓冲液将 0 . 28 m L 30 % 的 H Z q 稀释至
25 0 m L )
, 以磷酸缓冲液作为空白 , 用石英比色皿 , 每
10 5测定 1 次 O 2D 40 值 ,连续测定 3 而on
1
.
2
.
3 叶绿体超微结构的观察 在第 3 片叶的同
一部位 、无 叶脉处取样 , 将所取样品切成 1 m m Z 的
方块 ,在 2 . 5%戊二醛〔用 0 . 1 m ol · L 一 `磷酸缓冲液
( p H 6
.
8 ) 配 制」固定液 中 固定 2 4 h 以 上 。 再用
0
.
1 m o l
·
L 一 `磷酸缓冲液 ( p H 6 . 8 )漂洗 Z h , 转人
1%饿酸固定 Z h 。 用重蒸水漂洗 3 次 , 再用酒精逐
级脱水 ( 3 0% ~ 5 0% ~ 7 0 %~ 8 0 %~ 9 0 %一 1 0 0% ) 、
E p o n 81 2 渗透 、 包 埋 。 A O 型超薄切 片机切片 , 醋
酸双氧铀和柠檬酸铅溶液双重染色 , T E M 一 1 2 0 E X
透射电子显微镜观察 、拍照 。
U 平均数 、 标准误的计算及试验数据估计精度检测
平均数 、标准误的计算公式为 :
厉一生又 x : (1 )
_ ,
, 尸 / l 尸一 , 1 , 一
S
,
= S
`刀云= ` / , 二一二「艺 x` 2一土 (艺 x 、 ) 2 1 ( 2 )一二 一 ` v ” 勺 n ( n一 1 ) ` 一一 , n 、 一一 ’ “
P
。一 1一乙 (至 )
X
1一 u
o
s
二
X
( 3 )
根据 ( 1 ) 、 ( 2 ) 、 ( 3) 式 ,计算各指标的平均数和标
准误 (表 1 ) 。
表 1 不 同温度下测定指标的平均数和标准误
T a b l e 1 T h e a v e r a g e a n d t h e s t a n d a r d e r or r o f t h e in d ie e s i n d if fe r e n t t e m Pe ar t u r e s
相对电导率 ( )L 丙二醛 ( M D A ) S O D 活性 C A T 活性温度
1 5℃
1 0℃
5℃
O℃
一 5℃
平均值 (了 )
1 8
.
7 8 8 9
2 2
.
1 4 6 5
3 3
.
9 68 6
40
.
2 9 9 5
4 6
.
3 1 5 5
标准误 (凡 ) 平均值 (幻 标准误 (凡 ) 标准误 (凡 ) 标准误 (凡 )
0
.
4 27 7
0
.
5 60 9
0
.
4 18 6
0
.
4 5 0 3
0
.
5 0 9 8
0
.
0 4 8 2
0
.
0 4 9 7
0
.
0 3 8 4
0
.
0 4 7 8
0
.
0 4 8 1
0
。
0 0 1 0
0
.
0 0 0 8
0
.
0 0 0 8
0
.
0 0 0 5
0
.
0 0 0 9
平均值 (幻
1 1 6
.
2 1 7 4
1 4 1
.
7 1 6 6
1 6 5
.
6 0 9 4
1 5 5
.
7 4 5 3
1 4 1
.
0 1 1 3
0
.
50 8 4
0
.
6 17 3
0
.
50 5 4
0
.
4 0 0 9
0
.
5 0 1 1
平均值 (万 )
1 3 6
.
3 0 2 5
1 9 1
.
3 5 2 6
3 1 0
.
8 3 1 8
2 5 9
.
4 7 1 2
2 0 8
.
9 5 9 2
0
。
1 9 9 7
0
.
5 00 4
0
。
5 70 6
0
.
5 02 6
0
.
10 1 5
2 结果与分析
去1 低温胁迫对宜 昌润楠细胞膜透性的影响
植物受到低温伤害时 ,细胞质膜透性会有不同
程度增大 , 电解质会不同程度外渗 ,从而导致电导率
提高闭 。 通过测定外渗液电导值 的变化 , 来反映所
测材料的细胞膜伤害程度 ,进而判断植物抗寒性的
大小 3[, 幻 。 宜 昌润楠 随着处理温度 的变化 , 其叶片
相对电导率发生变化 。 随着温度的降低宜昌润楠的
膜透性呈现增加趋势 。 一般认为 , 相对电导率达到
50 %为植物的临界致死温度图 。 在 一 5 ℃ 时 , 宜昌
润楠叶片的相对电导率达 46 . 3% , 说明在一 5 ℃时
宜昌润楠细胞膜已受到严重损伤 。
么2 低温胁迫对宜昌润楠 M D A 含量 的影响
在低温胁迫下 , 细胞 内活性氧代谢的平衡被破
坏 ,而有利于活性氧的产生 。 活性氧过剩的毒 害之
一是引发或加剧膜质过氧化作用 ,造成细胞膜 系统
的损害 。 M D A 是膜脂过氧化的 主要产物 , 其含量
第 4 期 黎 明 等 低温对宜昌润楠生理指标及叶片超微结构的影响
的变化是质膜损伤程度的重要标 志之一0 [1〕 。 宜 昌
润楠 MD A含量随处理温度的降低表现为先降低后
增加的变化趋势 , 在 15 一 5 ℃之间 M D A 含量均有
所下降 ,表现对低温适应 , 而后随着温度的持续降
低 ,其含量逐渐升高 ,表现出膜系统的损害 。
之3 低温对宜昌润楠叶片 SO D 和 C A T 活性的影响
作为植物体主要 内源 的酶 系清 除剂 , S O D 和
C A T 起着清除细胞内过多的活性氧 ,保护膜结构的
作用 。 在低温胁迫下 ,宜 昌润楠的 S O D 和 C A T 酶
活性先升高后降低 , 5 ℃是二者的最大值 , 但二者
变化的陡度有一 定的差异 。 5 ℃ 时叶 片 SO D 和
C A T 酶 活 性 比 15 ℃ 时 分别 增 加 了 42 . 5纬和
I n
.
2肠 , C A T 活性增幅较 S O D 大 ,说明在幼苗阶
段 , C A T 酶对低温敏感性较 S O D 强 (表 1 ) 。 SO D
和 C A T 酶活性的上升可能是宜昌润楠对低温胁迫
的一种保护性应激反应 , 随温度的再降低 , S O D 和
C A T 酶活性下降 ,表明低温胁迫对 S O D 和 C A T 酶
产生伤害 [ , , , :〕 。
14 低温胁迫对宜 昌润楠叶片超徽结构 的影响
低温对植物超微结构的研究表明 , 低温引起叶
绿体膨胀 , 类囊体腔膨大 , 进而改变排列方向或弯
曲 ;淀粉粒体积变小 , 数量减少 , 进而嗜饿颗粒发生
积累 , 基粒片层消失 ,被膜破裂 ;线粒体膨胀 , 内峙腔
扩大和空泡化 ,严重时内峪破坏 lz[ , ` 3〕 。
15 ℃时叶绿体基粒片层和间质片层结构清晰
可见 , 排列规则有序 (图 1一 a) , 叶绿体间质片层 之间
有一定数量的嗜饿颗粒 ,并有淀粉粒 ( 图 1一 b) 。 10
℃时叶绿体基粒片层较 15 ℃ 时模糊 , 但排列有序
(图 l 一 c) ,有大量 的淀粉粒存在 (图 l 一 d) 。 5 ℃ 时叶
绿体间质变化不大 ,片层结构仍然清晰可见 ,排列有
序 (图 1一 e) ,但淀粉粒较 10 ℃时略有减少 (图 1一 f) 。
O ℃时细胞结构不清晰 , 叶绿体膨胀 , 片层 较紊乱
( 图 1一 g ) ,线粒体数目明显增多 (图 1一h) 。 一 5 ℃时 ,
植物明显受到伤害 , 细胞结构模糊 , 淀粉粒减少 , 叶
绿体片层模糊 ,线粒体结构模糊 (图 1一 i , j ) 。
F i.g 1 C h a n g e s in m e s o p h y ll e e ll u l t ar s t r u ct u r e o f 几耘 e h i l u s i e人a n g e n s i , d u r i n g e o ld s t r e s s
a
.
1 5℃时的叶绿体片层结构 , x 2 0 0 0 0 , b . 15℃时的叶绿体 (淀粉粒增加 ) , x 6 0 00 ; e . 1 0℃时的叶绿体 , x 1 5 0 0 0 ; d . 10℃时的淀粉粒 , x 6
0 0 0 , e
.
5℃ 时的叶绿体 , x 2 0 o o o . f . 5℃时的淀粉粒 , X 6 0 0 0 ; 9 . 0 ,C 时的叶绿体片层结构 , X 1 5 00 0 , h . o℃ 时 的叶片线粒体 , X l 0 0 0 o ; 1. 一
5℃时的叶绿体 , X 12 0 0。妇. 一 5℃时的叶绿体 , X 6 0 0 ; C ih : 叶绿体 ; C W : 细胞壁 ; M : 线粒休 ; S : 淀粉粒
a
.
A s e e t i o n o f a e h lo or p l
a s t i n a m e s o p h y ll e e l l
, s h o w in g t h e s t : u e t u r e o f i t s l a m e lla a t 15℃ , X 2 0 0 0 0 , b . P o r t io n o f a m e s o p h y ll e e ll a t
1 5℃ , s h o w i n g t h e s t r u e t u r e o f a e h lo r o p la s t , X 6 00 0 ; e . P o r t i o n o f a m e s o p h y l l e e ll a t 1 0℃ , X 1 5 0 0 0 , d . P o r t io n o f a m e s o P h y ll e e l l a t 1 0℃ ,
s h o w in g th e s t r u e t u r e of
a e
hl
o r o p la s t
,
X 6 0 0 0 , e
.
P o r t io n o f a m e s o p h y l l e e ll a t s℃ , X 2 0 0 0 0 , f . P o r t io n o f a m e s o p h y ll e e ll a t 10℃ , s h o w in g
t h e s t r u e t u r e o f a e h l o or p l a s t
, 火 6 0 0 0 ; 9 . A s e e t io n o f a e h lo r o p la s t i n a m e s o p h y ll e e ll , s h o w i n g t h e s t r u e t u r e o f i t s l a m e lla a t o℃ , X 1 5 0 0 0 ;
h
.
A s e e t io n o f a m e s o p h y ll e e l l a t o ℃ , s h o w in g th e s t r u e t u r e o f a m i t o e h o n d r io n , X 10 0 00 ; 1. P o r t io n o f a m e s o p h y ll e e ll a t 一 5℃ , X 1 2 0 0 0 .
j
.
P o r t io n o f a m e s o p h y ll e e ll a t 一 5℃ , X 6 0 0 0 ; C h l : e h lo r o p l a s t ; CW : e e ll w a ll ; M ; M i t oc h o n d r i o n , S : S t a r e h
3 结论与讨论
及1 保护酶活性和 M D A 含 t 的关系
S O D 和 C A T 是植物对膜脂过氧化的酶促防御
系统中重要的保护酶 。 植物体内酶促防御系统中的
各种酶之间要保持一个合理的配比 ,及时消除低温
胁 迫产 生 的 活性 氧 , 保持一 个 低水 平 的动 态 平
衡 [ , 4〕 。
SO D 和 C A T 保护酶活性下降与 M D A 积累密
切相关 , 可 能互 为因果 , 即一 方面 由于 S O D 、 C A T
活性下降 ,使有害自由基积累乃至超过伤害阑值 , 可
能直接或者间接地启动膜脂过氧化使 M D A 含量增