全 文 ：均匀设计法优化短果杜鹃高效快繁体系
姜云天 1 , 陈艳秋 2 ,顾地周 1 , 李玉梅 3 ,曲柏宏2, ＊
(1.通化师范学院生物系 ,吉林通化 134002;2.延边大学农学院园艺系 ,吉林龙井 133400;3.吉林师范大学 ,吉林四平 136000)
摘要 [目的 ]建立短果杜鹃高效快繁体系 ,实现短果杜鹃的高效离体快繁。 [方法]以短果杜鹃嫩茎段为外植体 , 应用均匀设计法筛选
最适合的培养基。 [结果]最适合嫩茎段的腋芽萌发及生根的最佳培养基为MS(改良)+IAA 0.15 mg/L+IBA0.30 mg/L+GA3 3.00mg/L,再生率达 92%以上。以再生植株的茎节为材料进行快繁的结果表明 ,在 35 d的 1个培养周期内增殖倍数平均达 45以上。 [结
论]该研究建立了短果杜鹃的高效快繁体系 ,为长白山高山杜鹃的开发利用和工厂化育苗提供了依据。
关键词 短果杜鹃;快繁;均匀设计
中图分类号 S685.21 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2009)33-16268-03
OptimizingHighEficientMicropropagationSystemofRhododendronbrachycarpumD.DonbyUsingUniformDesignMethod
JIANGYun-tianetal (DepartmentofBiology, TonghuaNormalUniversity, Tonghua, Jilin134002)
Abstract [ Objective] ToestablishhigheficientmicropropagationsystemofRhododendronbrachycarpumD.Don, andrealizethehighefi-
cientinvitromicropropagationofR.brachycarpum.[ Method] YoungstemsofR.brachycarpumwereusedasexplants, suitablemediumcom-
positionsforaxilarybudgrowingandrootingwerescreenedthroughuniformdesignexperiments.[ Result] MS(modified)+IAA0.15mg/L
+IBA0.30 mg/L+GA3 3.00mg/Lwasthemostsuitablemediumwiththeregenerationrateof92%.Stemseachwithonenodewerecutfromregeneratedshootsandculturedforpropagation, theproliferativemultiplewasover45withinonecultureperiodof35days.[ Conclusion]
HighefficientmicropropagationsystemofR.brachycarpumhasbeensuccessfulyestablished, whichprovidessomebasisfordevelopmentand
utilizationandindustrialseedlingofthealpinerhododendroninChangbaishan.
Keywords RhododendronbrachycarpumD.Don;Micropropagation;UniformDesign
基金项目 吉林省科技厅项目(200705C05);通化师范学院自然科学基
金项目(XS060074)。
作者简介 姜云天(1975-),男 ,吉林四平人 , 硕士研究生 ,助教 ,从事
长白山区植物生理生化研究。 ＊通讯作者。
收稿日期 2009-07-27
短果杜鹃(RhododendronbrachycarpumD.Don)是杜鹃花
科杜鹃花属常绿小灌木 ,为我国国家级保护的珍稀植物 , 《吉
林省野生动植物保护管理暂行条例 》中定为省级一类重点保
护植物。短果杜鹃可以盆栽观赏 ,因其在严寒季节叶片仍为
绿色 ,叶色光亮 ,叶长 8 ～ 20 cm,花色洁白 ,十分美观 ,可驯化
为观赏花卉;还可开发利用于耐寒 、抗寒及抗病能力强的园
艺新品种 ,作为高山杜鹃育种的种质资源。但其在我国分布
区甚狭 ,仅在东北地区境内分布 ,且数量不足 200株 [ 1] 。其
种子 、扦插等常规繁殖的萌发率和生根率极低 ,开发和利用
受到极大限制 。因此 ,在保护好现有野生资源的同时 ,对这
一野生珍稀植物进行离体快繁十分必要。
研究发现 ,通过愈伤组织再分化芽苗途径增殖系数高 ,
但仍存在外植体诱导愈伤组织周期较长 ,获得不定芽速度较
慢 ,且愈伤组织长期连续增殖极易发生退化和变异等缺点 。
而相对于愈伤组织再分化芽苗过程 ,腋芽增殖并同时生根途
径不仅成苗速度快 、繁殖系数高 ,而且遗传稳定性强 、一步成
苗 ,大大提高了种苗生产效率。均匀设计法为我国数学家方
开泰将数论和多元统计相结合 ,在正交设计的基础上 ,创造
出的一种适用于多因素 、多水平试验设计的新方法 [ 3] 。为
此 ,笔者应用均匀设计法对短果杜鹃嫩茎的腋芽生长伸长和
茎段生根条件进行筛选 ,以期获得最佳培养条件 ,为短果杜
鹃的开发利用和工厂化育苗提供依据。
1 材料与方法
1.1 外植体材料的处理 4月初 ,于长白山北坡海拔 1 470
m针阔混交林下采短果杜鹃休眠枝条在实验室内水培促使
腋芽萌发。待腋芽萌发并长至 2.0 cm时剪下 ,在超净工作
台上用 75%酒精涮洗 60 s,用饱和次氯酸钠溶液浸泡 10
min,无菌水冲洗 10次 ,无菌滤纸吸干表面水分 ,切除被杀菌
消毒剂损伤部分后 ,切割成一叶一段作为外植体备用。
1.2 短果杜鹃腋芽萌发生长及茎段生根培养基的筛选 以
改良 MS(1/4大量元素 、1/3微量元素 、1/3铁盐和 1/3有机
成分)为基本培养基 ,附加蔗糖 20.0g/L,琼脂粉 9.5g/L, pH
值 5.5,温度(24±2)℃,光照强度 1 100lx,光照周期 10h/d。
将外植体嫩茎段接种到附加不同浓度的 IAA、IBA、NAA和
GA3的改良 MS培养基上进行腋芽生长及生根培养 ,筛选最
适宜的培养基。
1.3 高效快繁体系的建立 以节培法进行快繁 [ 2] ,以短果
杜鹃再生植株的茎节为材料 ,即切割成一叶一段 ,转接到优
化后的腋芽生长及生根培养基中进行节增殖及生根培养。
统计并计算出增殖周期和倍数。
1.4 数据分析 采用均匀设计法进行初步规律设计性试
验 ,数据分析处理应用均匀设计软件(UniformDesign3.0V)。
2 结果与分析
2.1 短果杜鹃腋芽生长及茎段生根最佳培养基筛选 预备
试验结果表明 ,在改良 MS培养基中 ,短果杜鹃腋芽生长及茎
段生根培养的植物生长调节物质浓度范围分别为 IAA0.15
～ 0.35mg/L、IBA0.10 ～ 0.30mg/L、NAA0.07 ～ 0.12mg/L、
GA3 2.50 ～3.00 mg/L。低于控制范围 ,植物生长调节物质不
能促使短果杜鹃生根和腋芽生长伸长;过高的植物生长调节
物质浓度 ,会导致幼苗基部膨胀或产生愈伤瘤 ,抑制腋芽萌
发生长 ,继续培养根从膨胀部或愈伤瘤上发出 ,这样的苗在
移栽时 ,根随愈伤瘤从苗基部脱落 ,移栽成活率几乎为零。
为提高短果杜鹃植株的再生速度和再生率 ,笔者采用均匀设
计法 ,每个处理接种数 30,选用 U10(108)均匀表(表 1),同时
考察了 IAA、IBA、NAA和 GA3浓度交叉配比对短果杜鹃腋
芽生长及生根的影响。
责任编辑 陈娟 责任校对 张士敏安徽农业科学 , JournalofAnhuiAgri.Sci.2009, 37(33):16268-16270
表 1 U10(104)因素及水平设计
Table1 U10(104)factorsandlevelsdesign mg/L
水平
Levels
因素 Factors
X1 X2 X3 X4
1 0.15 0.10 0.07 2.50
2 0.20 0.15 0.08 2.60
3 0.25 0.20 0.09 2.70
4 0.30 0.25 0.10 2.80
5 0.35 0.30 0.11 2.90
6 0.15 0.30 0.12 3.00
7 0.20 0.25 0.10 2.70
8 0.25 0.20 0.09 2.80
9 0.30 0.15 0.08 2.90
10 0.35 0.10 0.07 3.00
注:X1为IAA浓度, X2为 IBA浓度 , X3为 NAA浓度 , X4为GA3浓度,
Y为再生率 ,考察再生率以同时腋芽生长伸长和茎段生根为标准。
Note:X1 isIAAconcentration;X2 isIBAconcentration;X3 isNAAcon-
centration;X4isGA3 concentration.
表 2 U10(104)均匀设计试验安排及结果
Table2 U10(104)uniformdesigntestplanandresult
处理号
Treatmentnumber
因素∥mg/LFactors
X1 X2 X3 X4 Y∥%
1 0.15 0.20 0.10 2.90 86.00
2 0.20 0.30 0.09 3.00 88.50
3 0.25 0.15 0.07 2.80 80.00
4 0.30 0.10 0.11 2.90 78.50
5 0.35 0.25 0.08 2.70 79.00
6 0.15 0.25 0.08 2.80 86.00
7 0.20 0.10 0.12 2.60 77.50
8 0.25 0.15 0.07 2.70 78.50
9 0.30 0.30 0.09 2.50 79.50
10 0.35 0.20 0.10 3.00 81.00
所得数据经均匀设计软件处理 ,得回归方程 Y=53.4-
29.9X1 +24.2X2 -34.9X3 +12.3X4 ,样本容量 N=10,显著性
水平 α=0.01,复相关系数 R=0.996 6,检验值 Ft=182.20,
临界值 F(0.01, 4, 5) =11.39, Ft>F(0.01, 4, 5),说明回归方程有意
义 。对各方程项进行显著性检验可知 ,检验值 F(3)=15.16,
临界值 F(0.01 , 1, 5) =16.26, F(3)
得回归方程 Y=50.4-29.6X1 +27.0X2 +12.0X4 ,复相关系
数 R=0.986 2,检验值 Ft=70.80, 临界值 F(0.01, 3 , 6)=9.78, Ft
>F(0.01, 3, 6),回归方程显著。同理对各方程项进行显著性检
验可知 ,各方程项对 Y影响均显著。根据回归方程求出 Y的
最优组合为 X1 =0.15, X2 =0.30, X4 =3.00,在此组合基础上
求得最优解 y=90.0。该解为方程解析解 ,需按公式 Y=y±
uα·s计算出优化值区间估计为 Y=90.0(±2.82),即
87.18% ～92.80%。以最优组合进行验证试验 ,将短果杜鹃
嫩茎段接种到附加 IAA0.15 mg/L+IBA0.30 mg/L+GA3
3.00 mg/L的改良 MS培养基中 ,培养 20 d嫩茎基部开始出
现根锥 , 25d后腋芽开始萌动生长 ,继续培养至 35 d嫩茎基
部直接发出 5 ～ 7条不定根(图 1), 45 d后苗高达 2.5 cm以
上 ,有的产生了侧根 ,根和苗的形态 、发育均正常 ,再生率达
92%以上 。在估计区间范围内 ,且比所有试验 Y值都大。可
见 ,短果杜鹃腋芽萌发生长及生根的最佳培养基为:MS(改
良)+IAA0.15 mg/L+IBA0.30 mg/L+GA3 3.00mg/L。
图 1 短果杜鹃腋芽生长及生根
Fig.1 AxillarybudsgrowingandrootingofRhododendron
brachycarpumD.Don
2.2 高效快繁体系的建立 采取节培法进行继代快繁 ,待
短果杜鹃茎段生根的苗伸长至 3.0 cm以上时 ,在超净工作
台上打开培养瓶留 1片叶剪下苗干 ,将其切割成一叶一段再
转接到嫩茎段生根同时腋芽生长伸长的培养基 MS(改良)+
IAA0.15 mg/L+IBA0.30 mg/L+GA3 3.00 mg/L中进行节
增殖和生根培养。试验发现 , 35 d为 1个增殖周期 ,每瓶增
殖倍数平均达 45以上(图 2)。
图 2 短果杜鹃节增殖培养
Fig.2 StemsmultiplicationofRhododendronbrachycarpumD.
Don
2.3 炼苗和移栽 待苗根长至 2.0 cm以上时 ,从培养瓶中
取出试管苗 ,在含有 5.00mg/L杀毒矾溶液中洗去苗上残留
的琼脂 ,然后将苗植入经 20倍杀毒矾消毒过的腐烂松针 、泥
炭土和细河砂混合(比例为 2∶2∶1)的基质中 ,用透光性好的
塑料薄膜覆盖以保湿保温 ,湿度保持在 75%,温度控制在(18
±2)℃,每天自然光照 8h,每天中午通风换气 10min。10d后
揭去薄膜 ,每天早晚喷洒清水各 1次。试验发现 ,采用上述炼
苗和移栽方法 ,短果杜鹃试管苗的成活率达 95%以上(图 3)。
3 结论
试验结果证明 ,培养基 MS(改良)+IAA0.15 mg/L+
IBA0.30 mg/L+GA3 3.00 mg/L对短果杜鹃腋芽生长伸长
及茎段生根的诱导效果最好 , IAA和 IBA的同时加入促进了
茎段的生根率和生根速度 ,在培养基中加入 3.00 mg/L的
GA3加快了腋芽的萌发和生长伸长;继代快繁采取节培法 ,
以短果杜鹃再生植株茎节为材料 ,即切割成一叶一段转接到
优化后的腋芽生长伸长及生根培养基 MS(改良)+IAA0.15
1626937卷 33期 姜云天等 均匀设计法优化短果杜鹃高效快繁体系
图 3 短果杜鹃试管苗移栽成活
Fig.3 PlantlettransplantsurvivalofRhododendronbrachy-
carpumD.Don
mg/L+IBA0.30mg/L+GA3 3.00 mg/L中进行节增殖同时
生根培养 ,遗传稳定性好 ,速度快 、成苗率高 ,从而缩短了增
殖周期 ,提高了增殖倍数 ,方法简捷 、经济实用 、可操作性强 ,
达到了快速增殖的目的。应用均匀设计法处理和分析数据
大大缩短了培养基配方的摸索周期。
近年来 ,德国 、意大利 、比利时等国家的高山杜鹃已驯化
为园艺栽培种进入我国市场。而在我国 ,仅甘肃 、云南等少
许高山品种得到半引种。短果杜鹃系长白山高山杜鹃 ,该类
型高山杜鹃至今未得到引种 。该研究建立了短果杜鹃的高
效离体快繁体系 ,对长白山高山杜鹃的开发利用和工厂化育
苗有一定的参考意义。
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(上接第 16262页)
突变为酪胺酸 ,从而影响牛的产奶性状 [ 7] 。
笔者首次分析延边黄牛群体 GHR基因第 8外显子的
SSCP多态性 ,发现延边黄牛群体在该座位存在 2个等位基
因 ,其中 A等位基因为优势基因 ,而 B等位基因频率较低。
3.2 GHR多态性与生长性状关系的分析 该研究发现 ,群
体内部 , AA基因型个体在所研究的各项指标的群体均值(全
期增重 、胴体重 、屠宰率 、净肉率 、眼肌面积)上略高于其他基
因型个体。多重比较结果显示 ,全期增重和日增重 2项指标
上 , AA型个体与 AB型 、BB型个体差异达显著水平 (P<
0.05)。这些指标作为主要测定指标能够反映出肉牛生长发
育状况 ,存在差异 ,可能是因为 GHR基因的表达产物 ,与生
长激素(GH)结合 ,对动物生长发育 、新陈代谢起重要调控作
用 [ 10] 。提示 , AA基因型可以作为延边黄牛生长发育性状候
选基因型之一 。
AA型个体在各项指标群体均值上都高于 AB、BB型个
体 ,并且在某些指标上显著高于 AB、BB基因型个体 ,提示 A
等位基因有利于生长发育 ,而 B等位基因则有可能是不利于
生长发育的基因。A基因频率较高(0.847 8)可能正是长期
进化的结果。
产肉性状是一个数量性状 ,受多个基因影响 ,单个基因
作用较小。从该试验的结果来看 , AA型个体虽然在各项指
标的群体均值上都高于其他型个体 ,但是差异达显著水平指
标的基因型群体较少 ,说明 GHR基因的作用比较轻微 。提
示人们进行育种工作时 ,应结合多个基因位点 ,才能达到有
效选育的目的。
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16270 安徽农业科学 2009年